Люминесцентная микроскопия. Электронная микроскопия. Радиоавтография. Конфокальная микроскопия.

Добавил пользователь Владимир З.
Обновлено: 21.12.2024

Микроскоп. Развитие микроскопии. Открытие клетки.

Гистология как самостоятельная наука выделилась в начале XIX века. Предысторию гистологии составили результаты многочисленных макроскопических (визуальных) исследований составных частей различных животных и растительных организмов. Решающее значение для становления гистологии как науки о строении тканей имело изобретение микроскопа, первые образцы которого были созданы в начале XVII века (Г. и 3. Янсены, Г. Галилей и др.). Одно из самых ранних научных исследований с помощью микроскопа собственной конструкции провел английский ученый Роберт Гук (1635-1703). Он изучал микроскопическое строение многих предметов. Все изученные объекты Р. Гук описал в книге "Микрография или некоторые физиологические описания мельчайших тел, выполненные при посредстве увеличительных стекол. ", изданной в 1665 г. Из своих наблюдений Р. Гук сделал вывод о широком распространении пузырьковидных клеток, или ячеек, в растительных объектах и впервые предложил термин "клетка".

На протяжении всего XVIII века происходило постепенное накопление фактов о клеточном строении растений и животных. Клетки животных тканей подробно исследовали и описали чешский ученый Ян Пуркиня (1787-1869) и его ученики в начале XIX века.

Большое значение для развития знаний о микроскопическом строении организмов имело дальнейшее усовершенствование микроскопов. В XVIII веке микроскопы производились уже в большом количестве. В Россию они впервые были привезены из Голландии Петром I. Позднее при Академии наук в Петербурге была организована мастерская по изготовлению микроскопов. Для развития микроскопии в России многое сделал М.В. Ломоносов, предложивший ряд технических усовершенствований конструкции микроскопа и его оптической системы. Вторая половина XIX века знаменательна бурным усовершенствованием микроскопической техники. Были созданы новые конструкции микроскопов, и, благодаря изобретению иммерсионных объективов (водная иммерсия стала применяться с 1850 г., масляная — с 1878 г.), разрешающая способность оптических приборов увеличилась в десятки раз. Параллельно с совершенствованием микроскопа развивалась и техника приготовления микроскопических препаратов.

Если раньше объекты исследовали под микроскопом сразу после их выделения из растений или животных без какой-либо предварительной подготовки, то теперь стали прибегать к разнообразным методам их обработки, которые позволяли сохранять структуру биологических объектов. Были предложены разные способы фиксации материала. В качестве фиксирующих средств нашли применение хромовая, пикриновая, осмиевая, уксусная и другие кислоты, а также их смеси. Простой и во многих случаях незаменимый фиксатор — формалин — впервые был применен для фиксации биологических объектов в 1893 г.

Изготовление препаратов, пригодных для исследования в проходящем свете, стало возможным после разработки методов заливки кусочков в плотные среды, что облегчало получение тонких срезов. Изобретение специальных конструкций для резки — микротомов — в лаборатории Я. Пуркиня значительно улучшило технику изготовления гистологических препаратов. В России первый микротом сконструировал киевский гистолог П.И. Перемежко. Для усиления контрастности структур стали прибегать к окрашиванию срезов различными красителями. Первым гистологическим красителем, окрашивающим ядра клеток, нашедшим широкое применение (начиная с 1858 г.), был кармин. Другой ядерный краситель — гематоксилин — стал применяться с 1865 г., однако долгое время его свойства не были оценены в полной мере. Ко второй половине XIX века уже употребляли анилиновые красители, были разработаны метод импрегнации тканей нитратом серебра (К. Гольджи, 1873) и окраска нервной ткани метиленовым синим (А.С. Догель, А.Е. Смирнов, 1887).

Благодаря фиксации биологического материала и получению из него тончайших окрашенных срезов исследователи конца XIX века имели возможность значительно глубже проникнуть в тайны строения тканей и клеток, на основе чего был сделан ряд величайших открытий. Так, в 1833 г. Р. Браун открыл постоянный компонент клетки — ядро. В 1861 г. М. Шультце утвердил взгляд на клетку, как на "комочек протоплазмы с лежащим внутри него ядром". Главными составными частями клетки стали считать ядро и цитоплазму. В 70-х годах XIX века группой исследователей одновременно и независимо друг от друга был открыт непрямой способ деления клеток — кариокинез, или митоз. В работах И.Д. Чистякова (1874), О. Бючли (1875), Э. Страсбургера (1875), В. Майзеля (1875), П.И. Перемежко (1878), В. Шлейхера (1878), В. Флемминга (1879) и др. были описаны и проиллюстрированы все стадии непрямого клеточного деления. Это открытие имело большое значение для развития знаний о клетке. Оно послужило также основой для более глубокого изучения такого важнейшего биологического процесса как оплодотворение. Изучение митоза и оплодотворения привлекло особое внимание исследователей к ядру клетки и выяснению его значения в процесе передачи наследственных свойств. В 1884 г. О. Гер-твиг и Э. Страсбургер независимо друг от друга высказали гипотезу о том, что хроматин является материальным носителем наследственности.

Объектом пристального внимания ученых стали хромосомы. Наряду с изучением ядра клетки, тщательному анализу была подвергнута и цитоплазма.

Успехи микроскопической техники обусловили открытие в цитоплазме органелл — постоянных и высокодифференцированных ее элементов, имеющих определенное строение и выполняющих жизненно важные для клетки функции. В 1875-76 гг. немецким биологом О. Гертвигом и бельгийским ученым Ван-Бенеденом был открыт клеточный центр, или центросома; а в 1898 г. итальянским ученым К. Гольджи — внутриклеточный сетчатый аппарат (комплекс Гольджи). В 1897 г. К. Бенда — в животных клетках, а в 1904 г. — Ф. Мевес — в растительных клетках описали хондриосомы, которые позднее стали называться митохондриями.

Таким образом, к концу XIX века на основе успешного развития микроскопической техники и анализа данных о микроскопическом строении клетки был накоплен колоссальный фактический материал, позволивший выявить ряд важнейших закономерностей в строении и развитии клеток и тканей. В это время учение о клетке выделилось в самостоятельную биологическую науку — цитологию.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Люминесцентная микроскопия. Электронная микроскопия. Радиоавтография. Конфокальная микроскопия.

Люминесцентная, или флюоресцентная, микроскопия — метод гистологического анализа с помощью люминесцентного микроскопа, в котором используется явление люминесценции (свечения) веществ при действии на них коротковолновых лучей (ультрафиолетового света, рентгеновских лучей). Некоторые биологические соединения, присутствующие в клетках, характеризуются спонтанной флюоресценцией при попадании на клетку ультрафиолетовых лучей. Для выявления же большинства других соединений клетки обрабатываются специальными флюорохромами (флюо-ресцеином, акридином оранжевым, корифосфином). С помощью флюорохромов исследуют, например, содержание в клетках нуклеиновых кислот. При окраске акридином ДНК дает красно-зеленое свечение, а РНК — оранжевое.

Люминесцентный микроскоп широко используется также для изучения иммунофлюоресценции. Иммунофлюоресценция позволяет исследовать в клетке содержание очень малых количеств белка. Препарат предварительно обрабатывают антителами к исследуемому белку, меченными флюоресцирующим красителем.

Ультрафиолетовая микроскопия — метод изучения клеток с помощью микроскопов, в которых для освещения объекта используют ультрафиолетовые лучи (длина волны которых равна 210-275 нм). Такие микроскопы имеют большую, чем обычные световые микроскопы, разрешающую способность. Для наблюдения за объектом требуется специальная аппаратура — электронно-оптический преобразователь, который предохраняет орган зрения от действия ультрафиолетовых лучей.

Электронная микроскопия. В электронных микроскопах используют пучок электронов, длина электромагнитной волны которых в 100 000 раз короче длины волны видимого света. Разрешающая способность электронного микроскопа в сотни и тысячи раз превышает обычные оптические приборы и равна 0,5-1 нм, а современные мегавольтные электронные микроскопы дают увеличение до 1 000 000 раз. С помощью электронных микроскопов получены многочисленные данные об ультраструктуре клеток. Разновидностью электронной микроскопии является сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), при которой изучаются поверхностные структуры клеток.

Цитоспектрофотометрия — метод изучения химического состава клетки, основанный на избирательном поглощении теми или иными веществами лучей с определенной длиной волны. По интенсивности поглощения света, которая зависит от концентрации вещества, производится количественное определения его содержания в клетке.

Радиоавтография — важный информативный метод, позволяющий изучать распределение в клетках и тканях веществ, в состав которых искусственно введены радиоактивные изотопы (3Н, НС, 32Р и др.). Введенный в организм животного (или в среду культивирования клеток) изотоп включается в соответствующие структуры (например, меченый тимидин — в ядра клеток, синтезирующих ДНК). Метод основан на способности включенных в клетки изотопов восстанавливать бромистое серебро фотоэмульсии, которой покрывают срезы ткани или клетки. Образующиеся после проявления фотоэмульсии зерна серебра (треки) служат своего рода автографами, по локализации которых судят о включении в клетку примененных веществ. Применение меченных тритием предшественников нуклеиновых кислот (тимидина, аденина, цитидина, уридина) позволило выяснить многие важные аспекты синтеза ДНК, РНК и клеточных белков.

Гисто- и иммуноцитохимические методы. В их основе лежит применение химических реакций для выявления распределения химических веществ в структурах клеток, тканей и органов. Современные гистохимические методы позволяют обнаруживать аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, различные виды углеводов, липидов и др. Для выявления специфических белков используют иммуноцитохимические реакции. Для этого получают специфические сыворотки, содержащие антитела (например, против белка микротрубочек — тубулина). Далее химическим путем соединяют эти антитела с флюорохромом (или другим маркером). Если меченые антитела нанести на гистологический срез, они вступают в соединение с соответствующими белками клетки и возникает специфическое свечение, видимое в люминесцентном микроскопе. Современные иммуноцитохимические методы, помимо флюорохромов, используют другие самые разнообразные специфические маркеры, позволяющие качественно и количественно оценивать содержание в клетке исследуемых соединений. Модификацией рассматриваемого метода является введение меченых антител в цитоплазму живых клеток с помощью микроманипуляторов.

Метод культуры клеток, тканей заключается в выращивании клеток и тканей вне организма в искусственных питательных средах (в условиях in vitro). Для получения изолированных клеток производят предварительную обработку материала ферментами трипсином или коллагеназой. Метод позволяет изучать реакции клеток на различные воздействия, механизмы регуляции пролиферации, дифференцировки и гибели. Особенно важное значение данный метод имеет для эмбриологических и цитофизиологических исследований, а также для трансплантации эмбриональных клеток при лечении врожденных и приобретенных дефектов обмена веществ.

Микроскопическая хирургия клетки — совокупность методических приемов, осуществляемых с помощью специального прибора — микроманипулятора. Этот прибор позволяет производить различного рода тончайшие операции на клетке (введение веществ, удаление или пересадка структурных компонентов клетки, нанесение уколов, разрезов и пр.) и нашел широкое применение в эмбриологии.

Цейтрафферная, или замедленная, микрокино- или видеосъемка — изучение живых клеток. Такой способ позволяет проследить за медленно протекающими изменениями клеток.

Метод фракционирования (дифференциального центрифугирования) клеток. Его суть заключается в получении из клеток изолированных структурных компонентов. Основан на разных скоростях осаждения этих компонентов при вращении гомогенатов клеток в ультрацентрифугах. Данный метод сыграл и играет очень важную роль в изучении химического состава и функциональных свойств субклеточных элементов — прежде всего, органелл.

Конфокальная микроскопия — современный метод, использующий в качестве осветителя лазерный луч, который последовательно сканирует всю толщину препарата. Информация о плотности объекта по каждой линии сканирования передается в компьютер, где специальная программа осуществляет трехмерную реконструкцию исследуемого объекта.

Следует отметить, что здесь приведены лишь самые основные, необходимые для гистологического образования врачей всех профилей методы гистологического анализа. Существуют многие десятки других методов, с которыми можно ознакомиться в специальной гистологической и цитологической литературе.

Методы исследования в гистологии. Подготовка препаратов к микроскопии.

Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью световых или электронных микроскопов. Гистологические препараты представляют собой мазки, отпечатки органов, пленочные препараты, тонкие срезы кусочков органов, окрашенные тем или иным красителем (исследуются также нативные — неокрашенные срезы), помещенные на предметное стекло, заключенные в бальзам и покрытые тонким покровным стеклом.

Для изготовления гистологического препарата необходимо после взятия материала произвести его фиксацию в том или ином фиксаторе (формалине, спирте, а для электронной микроскопии — в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия). Делается это для предотвращения процессов аутолиза и сохранения структуры органа, близкой к прижизненной. Далее следуют этапы обезвоживания кусочка органа в спиртах возрастающей концентрации и в ксилоле с целью уплотнения тканей, что необходимо для изготовления тонких срезов. Для придания кусочку органа еще большей плотности и гомогенности, обеспечивающей высококачественную резку, проводят его заливку в органическую среду — парафин, целлоидин (для световой микроскопии) и органические смолы (эпон, аралдит, дуркупан) — для электронно-микроскопического исследования.

Существуют также физические способы фиксации материала, наиболее распространенным из которых является быстрое замораживание кусочка органа с помощью жидко.го азота и других средств. Для резки замороженного материала используют специальные приборы — криостаты, или замораживающие микротомы.

Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии, не должна превышать 4-5 мкм, для электронной — 50-60 нм (такие ультратонкие срезы изготавливают на специальном приборе ультратоме, используя стеклянные или алмазные ножи и автоматический режим резки).

После получения срезов их помещают на предметные стекла, далее следуют этапы освобождения срезов от заливочной среды (при световой микроскопии) и окраски для придания срезам контрастности. Среди гистологических красителей наиболее часто употребляется сочетание гематоксилина, маркирующего ядро (кислотные молекулы), и эозина, избирательно окрашивающего белковые молекулы (цитоплазматический краситель).

По окончании окрашивания срезы заключают в консервирующие среды (канадский, кедровый бальзамы) и накрываются покровным стеклом.

Основным методом гистологического исследования клеток, тканей и органов является световая микроскопия. В световом микроскопе для освещения объекта используются лучи видимого спектра. Современные световые микроскопы позволяют получать разрешение порядка 0,2 мкм (разрешающая способность микроскопа — это то наименьшее расстояние, при котором две рядом расположенные точки видны как отдельные). Разновидности световой микроскопии — фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная, темнопольная и др.

Фазово-контрастная микроскопия — метод изучения клеток в световом микроскопе, снабженном фазово-контрастным устройством. Благодаря смещению фаз световых волн в микроскопе такой конструкции повышается контрастность структур исследуемого объекта, что позволяет изучать живые клетки.

Интерференционная микроскопия. В интерференционном микроскопе падающие на объект световые пучки раздваиваются — один пучок проходит через объект, другой — идет мимо. При последующем воссоединении пучков возникает интерференционное изображение объекта. По сдвигу фаз одного пучка относительно другого можно судить о концентрациях различных веществ в исследуемом объекте.

Поляризационная микроскопия. В микроскопах этого типа световой пучок разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Проходя через структуры ткани со строгой ориентацией молекул, лучи запаздывают друг относительно друга вследствие неодинакового их преломления. Возникающий при этом сдвиг фаз является показателем двойного лучепреломления клеточных структур (таким способом были исследованы, например, миофибриллы).

Как работает люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия — исследование, связанное со свечением объектов. Большинство из них не видны, т.к. используется ультрафиолетовое излучение. В некоторые образцы добавляют красители, взаимодействующие с соединениями.

Люминесцентная микроскопия — это исследование объектов, окрашенных специальными красителями.

Краткая историческая справка

Флуоресценцию открыл Джордж Стокс в 1852 г. Английский физик наблюдал ее у хининовых веществ. Позже ученые выяснили, что облучение ультрафиолетом приводит к свечению многих соединений. Флуоресценция характерна для витаминов, кристаллов, горных пород, масел и хлорофилла. Однако полученные сведения применили позднее.

В 1930-х гг. ученые-биологи стали окрашивать бактерии и клетки флюорохромами, способствующими свечению. Был придуман микроскоп для подобных исследований.

Применение флуоресценции позволило изучать микрообъекты с разрешением от 1 до 10 нм. Наноскопия может раскладывать частицы на отдельные молекулы.

Что такое люминесцентная микроскопия

При физическом процессе соединения поглощают фотоны. Одновременно у веществ появляется излучение с иной длиной волны. У получившихся фотонов она больше, но энергии меньше. Когда соединения облучают ультрафиолетом, отдельные из них светятся. Цвет излучения направлен к красной спектральной части.

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться.

Люминесцентные устройства функционируют в отраженном свете. Основной задачей при применении флуоресценции является отделение потока света объекта от сильного излучения подсветки. Чтобы увеличить наглядность изображения, используется темный или черный фон.

Методы исследования

В люминесцентной микроскопии применяются различные методы исследований. Микробиологи используют флюорохромирование и реакцию иммунной флуоресценции. Вторую часто называют также методом флуоресцирующих тел.

Существует другой вид изучения молекул — конфокальная микроскопия. Она дает возможность исследовать частицы на той или иной глубине.

Флюорохромирование

Метод является распространенным в исследовании органов и тканей человека. Вторичную люминесценцию получают, обрабатывая образцы флюорохромами. Каждый предназначен для каких-либо целей.

Акридиновый оранжевый применяется для диагностики раковых заболеваний и инфаркта на ранних сроках. Ишемические участки имеют зелено-желтое свечение. Флюорохром применяют, чтобы выявлять кислые мукополисахариды. Если он взаимодействует с ДНК, появляется зеленая флуоресценция. Для реакции красителя на РНК характерна красная.

Флюорохромирование — это обработка флуорохромом с целью увеличения контрастности свечения.

Кофеин 5 и родамин применяются для определения гликогена в печени. Фосфин 3Р — для выявления липидов. Аналогичными свойствами обладает смесь растворов бензпирена и кофеина. Второй должен быть насыщенным. При наличии липидов появляется бело-голубая люминесценция.

Тиофлавин окрашивает особые белковые соединения при амилоидозе. Для него характерно зеленое свечение. При такой болезни внутренних органов в них образуются амилоиды.

Морин используют для определения содержания кальция в тканях. После обработки спиртовым раствором образцы имеют зеленую люминесценцию.

Черный солохром применяют для выявления алюминия. Он сопровождается желто-оранжевым свечением.

Родамин 6Ж необходим для определения сурфактанта в тканях легких. На его наличие указывает оранжевая люминесценция.

Реакция иммунной флюоресценции

Благодаря методу флуоресцирующих тел выявляют антитела, гормоны, продукты метаболизма и др. Реакция иммунной флюоресценции определяет рак и инфекции на ранних стадиях. Возможности таких исследований расширило развитие иммунохимии. Сейчас небелковые соединения в тканях выявляют искусственными гаптенами.

Особенности исследования отдельных молекул и микроорганизмов

В теории можно сделать изображение какой-либо молекулы, используя оптические устройства, красящие вещества, ультрафиолет и светофильтр. Объект исследования должен флюоресцировать на темном фоне, а остальные частицы нет. Их цветовое значение близко к нулю.

Детектор микроскопа распознает не только излучение нужной молекулы, но и реагирует на иные фотоны. Они попадают на люминесцентное устройство от других источников света.

Сейчас для детального анализа образца применяют оптико-механические приборы и электронно-вычислительную технику. С помощью современного программного обеспечения ее подключают к монитору. На него выводится трехмерное изображение. После получения информации о координатах новых частиц компьютер микроскопа запоминает их расположение. Они исчезают с экрана.

Для осуществления наблюдения нужен стереомикроскоп.

Получить изображение объекта легко с помощью оптики, дополнительной техники и ПО. Качество снимка будет ниже, чем при применении люминесцентного устройства. Иногда для наблюдений такой способ допускается, т.к. не всегда требуется сверхвысокое разрешение.

Для осуществления наблюдения понадобятся:

простой стереомикроскоп;
источник возбуждения излучения;
светофильтры для блокировки света возбуждения и удерживания свечения объектов, создающих ненужный фон;
система для проецирования полученной картинки на фотокамеру;
компьютер с ПО для запечатления и обработки изображений.

Сфера применения люминесцентной микроскопии

Флюоресцентный микроскоп незаменим в биологии, медицине, а также смежных областях. Он позволяет проводить точные исследования клеток и тканей организмов. Главным преимуществом люминесцентной микроскопии считается возможность увидеть образец изнутри. Остальные приборы изучают лишь поверхность объекта.

Метод люминесцентной микроскопии применяется для исследования клеток организма.

Флюоресцентные устройства часто используют криминалисты. Они сравнивают образцы тканей и веществ для установления их принадлежности. Свечение применяется в санитарно-эпидемиологических исследованиях. Оно помогает выделять бактерии и клеточные структуры из-за способности взаимодействовать лишь с нужными красителями.

Явление флуоресценции открыли в 1852 г., но громоздкие микроскопы имели плохое разрешение. Новейшие технологии позволяют использовать люминесцентные ферментные метки, делающие устройства компактными. Их разрешение обладает высоким качеством.

Метод люминесцентной микроскопии является незаменимым для:

анализа кровяных клеток костного мозга;
диагностики инфекционных болезней;
исследования клеток организма и глазных тканей сетчатки.

Применение эффекта свечения нужной длины волны у молекул помогает распознать вирусы и бактерии с высочайшей точностью.

Другие микроскопы выявляют только наличие инфекции. Благодаря разрешению 1 нм получают четкие и яркие изображения.

Принцип работы люминесцентного микроскопа

Принцип работы устройства заключается в испускании излучения объектом исследования вслед за светом возбуждения — электромагнитной волной с ультрафиолетовым диапазоном. Иногда используются зеленые или синие лучи. Они являются видимыми.

Принцип работы заключается в испускании излучения объектом исследования.

В микроскоп устанавливают зеркало, направляющее на исследуемый образец поток света. Его источником является ксеноновая или ртутная лампа. Отдельные лучи поглощаются материалом, остальные отражаются и направляются в пространство. Под ним подразумевается и глаз человека. Отраженное свечение источника забирает слабое излучение — собственное свечение микрообъекта. Для его отделения от ультрафиолета перед линзами устройства размещают светофильтр. Он отсекает лучи с более короткой электромагнитной волной.

Люминесценция отличается двойственным происхождением.

Большинство веществ светятся самостоятельно из-за воздействия ультрафиолетовых лучей. В других случаях к образцам добавляют флюорохромы.

Преимущества люминесцентной микроскопии

Люминесцентная микроскопия имеет множество достоинств. Основным является возможность изучения живых клеток и микроорганизмов. Исключается опасность их соединения или окрашивания, что провоцирует гибель. Поэтому ученые могут:

наблюдать за клеточной структурой образца;
фиксировать динамику происходящих биологических изменений.

Пример наглядности результата

Ярким примером служит изучение глиальной ткани человеческого мозга с помощью оптического и фазово-контрастного устройства. При сравнивании изображения выводы может сделать любой человек, не имеющий специальных знаний.

При применении оптического микроскопа клетки мозга выглядят прозрачными. Можно увидеть только части, имеющие выраженное преломление, к примеру мембрану или ядро. Полученная картинка не подходит для подробного изучения образца.

При использовании метода фазового контраста детали хорошо различимы. На четком изображении видны мельчайшие клеточные структуры и места их соединения друг с другом.

Как интерпретировать

Образцы, окрашенные флюорохромами, рассматривают, увеличивая в 200-630 раз. Однако чаще используется значение 400. При изучении препаратов после обработки карболовым фуксином изображение увеличивают в 1000 раз. Поэтому поле зрения объектива на люминесцентном микроскопе намного больше, чем простом.

Например, при диагностике туберкулеза методом флуоресцентной микроскопии есть свои тонкости. Приводится рекомендуемое количество полей для просмотра. Мазок оценивают как отрицательный, применяя различную степень увеличения.

Методы световой микроскопии

Световая, или оптическая, микроскопия — это один из основных методов исследования частиц, неразличимых человеческим глазом. Данный метод имеет широкое распространение в медицине, фармакологии, биологии, металлографии, криминалистике и других сферах.

Увеличение изображения в световом микроскопе обеспечивается системой собирательных линз, расположенных в окуляре и объективе.

Световой микроскоп — оптический прибор, позволяющий рассмотреть мелкие детали.

Метод световой микроскопии

Предельная разрешающая способность человеческого глаза составляет около 0,1 мм. Это понятие отражает минимальное расстояние, на котором 2 соседние точки определяются как отдельные объекты. Микрочастицы, клеточные структуры и дефекты поверхности имеют размер менее 100 мкм, поэтому для их исследования требуется специальное оборудование.

Историческая справка

Первые оптические микроскопы были изобретены в XVI-XVII вв. Первым, кто заметил увеличительный эффект комбинации из нескольких линз, был венецианский врач Джироламо Фракасторо. В 1609 г. Галилео Галилей представил собственный вариант прибора с 2 стеклами: выпуклым и вогнутым. Первое устройство называлось оккиолино (occhiolino).

Через 10 лет после этого голландский ученый Корнелиус Дреббель усовершенствовал конструкцию, использовав для объектива 2 выпуклые линзы.

Практическое применение микроскопа началось с конца XVII в., когда Антони Ван Левенгук использовал собственное оптическое устройство для исследования биологических структур. Его микроскоп содержал всего одно мощное стекло, что уменьшало количество дефектов картинки.

Приборы Левенгука позволяли увеличить изображение в 275 раз и рассмотреть строение бактерий, дрожжей, эритроцитов, одноклеточных микроорганизмов и насекомых.

Популяризации микроскопии способствовала и книга английского исследователя Роберта Гука, которая вышла в 1664 г. В ней ученый ввел термин «клетка» и опубликовал гравюры некоторых микрообъектов.

Методы микроскопии выбираются в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.

В течение следующих столетий конструкция оптического микроскопа непрерывно совершенствовалась. Несмотря на то, что в первой половине XX в. были изобретены электронные приборы, которые позволяли рассмотреть нанообъекты, световой метод не теряет своей популярности. В 2006 г. группа немецких ученых разработала оптическое устройство под названием наноскоп, которое обладает разрешающей способностью 10 нм.

Подробно о принципе действия

Принцип работы оптического микроскопа основывается на прохождении прямого или отраженного луча света через систему линз.

Объектив прибора содержит до 14 стекол. При прохождении светового пучка через эту часть устройства изображение увеличивается до 100 раз, а при прохождении окуляра — в 20-24 раза. Выпуклые и вогнутые стекла позволяют сфокусировать картинку на сетчатке или приспособлениях для документирования информации.

Видимое излучение, которое создает осветительная система прибора, ограничивают несколькими диафрагмами. Это повышает четкость изображения.

Увеличивающие линзы имеют 2 дефекта. Сферическая аберрация мешает фокусировать сразу все поле исследования, а хроническая приводит к появлению яркой каймы по контуру изображения. Чтобы компенсировать дефекты, окуляр и объектив оснащаются корригирующими стеклами.

Где применяется

Методы световой микроскопии применяют в следующих областях науки и промышленности:

медицине и лабораторной диагностике;
биологии;
металлографии, неразрушающих методах контроля на производстве;
микроэлектронике;
минералогии, кристаллографии;
археологии, геологии;
криминалистике;
пищевой промышленности;
ювелирном деле и др.

Световая микроскопия применяется в медицине и биологии.

В целом об устройстве светового микроскопа

Оптический микроскоп состоит из следующих элементов:

штатива;
тубуса;
окуляра;
объектива;
призмы;
источника света;
конденсора;
апертурной и полевой диафрагм;
фокусировочного механизма;
светофильтра;
зеркала;
предметного столика.

Устройство светового микроскопа.

Некоторые модели прибора оборудованы дополнительными объективами, системами записи и передачи информации.

Виды световых микроскопов с описанием

Особенности конструкции зависят от предназначения микроскопа. Для увеличения четкости изображения используют методы флуоресценции, люминесценции, инверсии и др.

Биологическое оборудование

Биологические приборы позволяют исследовать прозрачные или полупрозрачные объекты. Принцип их работы основан на изучении светлого поля в потоке проходящего света. Такие микроскопы применяют в лабораторной диагностике, ботанике, цитологии, микроэлектронике, археологии и пищевой промышленности.

Биологическое оборудование позволяет исследовать прозрачные объекты.

Для повышения разрешающей способности используют иммерсионные оптические системы. В этом случае между образцом и первым стеклом вводится жидкость с высоким коэффициентом преломления (минеральное масло, раствор глицерина, дистиллированная вода и др.).

Криминалистическое оборудование

Главная особенность криминалистического микроскопа — это возможность сравнения 2 объектов. Такое исследование помогает найти сходство между компонентами взрывных устройств, гильзами, пулями, волосами, волокнами и другими уликами.

Приборы для криминалистики оснащают фото- и видеокамерами, а также программным обеспечением.

Это позволяет снизить вероятность ошибок, построить модели объектов и сравнить с данными из электронных источников.

Флуоресцентные микроскопы

Флуоресцентные, или люминесцентные, микроскопы позволяют исследовать объекты, которые испускают световой поток после облучения ультрафиолетом. Они оборудованы коротковолновым источником освещения, светофильтрами и интерференционной пластинкой.

Флуоресцентный микроскоп — оптический прибор, показывающий в увеличенном виде клетки.

Флуоресцентные микроскопы активно применяют в лабораторной диагностике, в частности, при изучении клеток крови и антигенов. Для анализа предметов, которые не излучают свет, используют люминесцентные красители и порошки.

Поляризационные микроскопы

Поляризационный прибор является наиболее сложным из всех представленных видов микроскопов. Его используют для исследования анизотропных материалов, полимеров, некоторых клеток и микробиологических объектов.

Источник света со специальными фильтрами формирует поляризованный поток, который облучает образец.

Оптическая система интерпретирует двойное лучепреломление среды и позволяет изучить ее структуру.

Инвертированные с перевернутым положением объектива

В инвертированном микроскопе объектив располагается не над образцом, а под предметным столиком. Такие приборы применяют в биологии, медицине, промышленности, металлографии, криминалистике и других сферах.

Инвертированный микроскоп имеет особенную конструкцию.

Перевернутое положение оптической системы позволяет изучать более крупные образцы и работать со специальной посудой.

Микроскопы для металлографии

Металлографические микроскопы предназначены для исследования поверхности непрозрачных объектов. Изображение получают путем преломления отраженного светового луча.

Предметом изучения являются микродефекты поверхности и зерна сплавов. Помимо металлургии и промышленности, такие устройства применяют в геологии и археологии. Для обеспечения четкости используют специальные системы линз и зеркал.

Стереомикроскопы (дают объемное изображение)

Стереомикроскопы оснащены 2 объективами, что позволяет получать объемное изображение исследуемого образца. По сравнению с устройствами плоского поля они дают более резкую, четкую и контрастную картинку.

Стереомикроскопы позволяют получать объемное изображение.

Такие приборы используют в точном машиностроении, ювелирном деле и других областях промышленности.

Моновидеомикроскопы с возможностью получения видео

Видеомикроскопы предназначены для динамического наблюдения за образцом и фиксации изображения. Для повышения эффективности работы их оснащают специальными линзами, светофильтрами и адаптерами.

Разновидности методов световой микроскопии

Выбор метода оптической микроскопии определяется особенностями объектов и целью исследования.

Светлое поле в потоке проходящего света

Данный метод основан на принципе прохождения потока света через образец. Предмет частично поглощает и рассеивает попадающие на него лучи, что позволяет сформировать изображение.

Светлое поле в потоке — метод, который построен на принципе прохождения света.

Светлопольную микроскопию применяют для изучения окрашенных тканей животных и растений, тонких шлифов и др. Для прохождения светового пучка препарат должен быть прозрачным.

Косое освещение

Данный метод является разновидностью микроскопии светлого поля. Чтобы выявить рельеф и сделать изображение более контрастным, поток направляют под большим углом к образцу.

Светлое поле в отраженном свете

Светопольная микроскопия в отраженном свете позволяет исследовать поверхности непрозрачных предметов (сплавов, покрытий, руд и др.). Свет падает на образец сверху, а основная оптическая система исполняет роль объектива и конденсора.

Светлое поле в отраженном свете позволяет исследовать поверхности непрозрачных предметов.

Изображение формируется за счет того, что элементы поверхности по-разному отражают и рассеивают попадающие лучи. Травление дает возможность изучить не только дефекты, но и микроструктуру и фазовый состав образца.

Темное поле

Метод темного поля предназначен для изучения прозрачных образцов, которые не абсорбируют свет. Специальный конденсор направляет лучи так, что они формируют полый конус, в центре которого находится объектив. Таким образом, большая часть лучей не попадает в оптическую систему.

Изображение представляет собой темное поле с небольшими светлыми включениями, которые формируются за счет рассеяния света частицами препарата.

Ультрамикроскопия

Метод ультрамикроскопии является разновидностью темнопольного. Для исследования образцов используют сильные источники света, а лучи направляют перпендикулярно предметному столу. Эффект рассеяния волн позволяет обнаружить частицы менее 10 нм.

Ультрамикроскопия — метод наблюдения и анализа коллоидных частиц.

Фазовое контрастирование

Метод фазового контраста позволяет изучать прозрачные и неокрашенные образцы. При малом различии в коэффициенте преломления изображение нельзя получить ни на светлопольном, ни на темнопольном микроскопе, поскольку разница в поглощении и рассеянии света будет минимальной.

Однако при прохождении через образец волна приобретает фазовый рельеф, который фиксируется специальным объективом. В изображении он отображается как различие в яркости элементов.

Аноптральный контраст

Данная методика является подвидом фазовой микроскопии. На иммерсионную линзу наносят кольцо из сажи, которое пропускает 10% лучей и совпадает с контуром кольцевой диафрагмы конденсора. При отсутствии образца амплитуда световых волн уменьшается на 90%.

Проходя через среды разной плотности, лучи дифрагируют, в результате чего их амплитуда остается неизменной.

За счет этого поле исследования получается темным, а частицы образца — светлыми.

Поляризационный метод

Анализ анизотропных материалов проводят в свете, пропущенном через специальную фильтрующую пластинку. При прохождении через образец плоскость поляризации лучей меняется.

По разнице между начальными и конечными характеристиками волн определяют количество оптических осей, их ориентацию и др.

Интерференционная микроскопия

Интерференционный метод основан на параллельном прохождении 2 лучей через предметный столик и мимо него. В окуляре микроскопа когерентные волны соединяются и интерферируют между собой.

При прохождении через образец первый луч запаздывает по фазе, что влияет на результирующую амплитуду и яркость изображения.

Люминесценция или флуоресценция

Принцип люминесцентной микроскопии основан на том, что некоторые образцы испускают видимый свет после облучения ультрафиолетом. Перед исследованием препараты обрабатывают флуоресцирующими антисыворотками, порошками или маркерами.

Волны ультрафиолетового спектра применяют для повышения разрешающей способности микроскопа. Для изучения препаратов, которые не испускают видимый свет после воздействия УФ-лучей, используют фотокамеры и кварцевые линзы.

Читайте также: