Анализ на вич метод real-time что это

Сегодня ДНК-анализы активно используются с целью диагностирования инфекций и могут выявить даже единичных возбудителей. Самый известный способ исследования ДНК — полимеразная цепная реакция. Сегодня в медицинской практике активно внедряется новый метод — ПЦР в реальном времени. Суть его заключается в наблюдении и численной оценке накапливания продуктов полимеразной цепной реакции при автоматической фиксации и расшифровке результатов.

Применение этого метода анализа исключает стадию электрофореза. Это дает возможность предотвратить ложноположительные результаты и существенно сократить время для получения результата. ПЦР в реальном времени дает возможность исследовать материал за 20-60 минут и обнаружить даже одну молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты в пробе.

Анализ ПРЦ: сущность обследования и его принципы

Полимеразный метод цепной реакции создал Кэри Мюллис в 1983 г. За свое изобретение, ставшее одним из самых выдающихся в конце 20 века в сфере молекулярной биологии, он удостоился Нобелевской премии по химии (1993).

Принцип анализа методом ПЦР real time базируется на выявлении в биоматериале малой части ДНК провокатора подозреваемой инфекции. Дезоксирибонуклеиновая кислота состоит из множества оснований, поэтому для распознавания заболевания хватит минимального фрагмента молекулы. В период проведения ПЦР-анализа выискивается такой элемент ДНК, который характерен только для конкретного возбудителя инфекции.

Полимеразная цепная реакция непосредственно применяется с целью, чтобы обнаруженный фрагмент расплодить. К концу исследования фрагментов должно накопиться не меньше 1012.

Преимущества ПЦР в реальном времени:

• высокая достоверность анализа;
• определение численности фрагментов ДНК в материале;
• минимальный риск получения ошибочного результата при диагностике;
• короткий срок осуществления ПЦР анализа;
• возможность обнаружения нескольких возбудителей одновременно;
• фиксация процедуры и результатов в электронном виде.

Инфекции, выявляемые с помощью ПЦР-диагностики

В реальном времени ПЦР используется в медицинской практике для определения вирусной, бактериальной нагрузки (количества агентов), для установления числа внутриклеточных возбудителей инфекций, для анализа результативности лечения, для выявления устойчивости к лекарственным препаратам.

Заболевания, которые можно выявить с помощью ПЦР:

• ВИЧ-инфекция;
• инфекции, которые передаются половым путем;
• вирусные гепатиты;
• папилломавирус человека;
• мононуклеоз;
• цитомегаловирусная инфекция;
• герпес;
• туберкулез;
• клещевой энцефалит;
• кандидоз;
• хеликобактерная инфекция.

Материал для сдачи ПЦР-анализа

Противопоказаний для данного исследования нет — все могут проводить ПЦР. Для изучения берут биоматериал человека:

• соскоб клеток эпителия (из уретры у мужчин, из половых путей у женщин);
• кровь и ее компоненты;
• жидкости (плевры, суставов и др.);
• слизь;
• слюна;
• моча;
• мазок спермы у мужчин.

Материал помещают в амплификатор — прибор для ПЦР реал тайм.

Подготовка к ПЦР-анализу

Точность результатов, которые дает ПЦР диагностика, в большей степени зависит от соблюдения человеком рекомендаций по подготовке к анализу. Перед исследованием нужно придерживаться таких рекомендаций:

1. За 10 дней до проб нужно прервать прием антибактериальных препаратов и терапевтические процедуры (если это не противоречит рекомендациям врача). Мужчинам не желательно мочиться за 4-5 часов до осуществления процедуры ПЦР в реальном виде.
2. Полимеразная цепная реакция у женщин проводится до месячных или спустя 1-4 дня после их окончания.
3. Перед забором крови нельзя есть и пить.
4. Моча собирается утром в стерильную емкость.

Непосредственно перед сдачей анализа:

1. Не проводить туалет половых органов с помощью антибактериальных средств.
2. Не мочиться минимум за 3 часа до ПЦР анализа.
3. Исключить спринцевание женщинам, не применять вагинальные свечи.
4. Положительный исход диагностики зависит также от чистоты материала — очень важно исключить его контаминацию, которая ставит под сомнение достоверность результата.
5. Рекомендуется приходить на обследование в период обострения заболевания. Если был незащищенный половой акт, должно пройти минимум 3 недели, прежде чем может проводиться диагностика.

Как берут анализ ПЦР real time?

Существуют определенные стандартные правила сбора биологического материала. Образцы материала берут в процедурном кабинете с помощью специального стерильного одноразового инструмента. После этого образцы помещаются в стерильные пробирки, которые перед этим обрабатываются хромовой смесью и подвергаются воздействию высокой температуры.

Венозная кровь собирается на голодный желудок. Перед исследованием необходимо исключить употребление жирной и аллергенной пищи. Для сбора мочи необходимо помыть половые органы чистой водой, собрать мочу в стерильную емкость и отнести в лабораторию. Если берется мазок из влагалища, врач использует специальный инструмент, когда пациентка располагается на гинекологическом кресле. Соскоб у мужчин берут из внешней части уретры. Когда материал взят, пробу направляют на исследование.

Расшифровка результатов ПЦР

Итоговый результат будет готов через сутки после сбора биоматериала. Иногда полимеразная цепная реакция может дать результат через час. Если в исходном материале не выявлено следов молекул возбудителей инфекций, то считается, что анализ ПЦР отрицательный.

Если выявлены следы инфекции в диагностируемом биоматериале, то результат положительный. Он свидетельствует о присутствии возбудителя в момент времени, когда сдавалась проба. Бывает, что полимеразная цепная реакция дает положительный результат, но нет видимых симптомов заболевания, то есть человек является носителем инфекции без демонстрации клинических признаков. В этом случае лечение не требуется, но необходимо постоянное наблюдение специалиста.

Инфекция от носителя может передаваться здоровому человеку. Также болезнь может переходить в хроническую форму. Если анализ дает положительный результат в крови, то это подтверждает факт, что человек уже не является носителем, и требуется лечение. Для каждого конкретного носителя инфекции количественный результат ПЦР может оценить врач индивидуально.

Расшифровка анализа дает возможность определить меру активности заболевания и его стадию. Этот фактор влияет на дозу назначенных препаратов, на курс лечения.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени практически не дает ложноположительного результата, когда при отсутствии инфекции диагностика дает положительную пробу. Ложный результат ПЦР отрицательный прослеживается редко. Обычно это связано с тем, что в данный момент отсутствует активность инфекции.

На сегодняшний день полимеразная цепная реакция в реальном времени — одно из самых безошибочных исследований. Но при подозрении на любое заболевание не обязательно прибегать только к этому виду исследования. Есть определенная группа инфекций, для которых предпочтительны другие методы. Для каждого конкретного случая следует проконсультироваться со специалистом.

Все инфекционные заболевания нуждаются в своевременной точной диагностике. ВИЧ и СПИД — не исключение. Поставленный вовремя диагноз позволяет принять необходимые терапевтические меры и продлить пациенту жизнь. Как же определить наличие или отсутствие заболевания с максимальной точностью?

Диагностика ВИЧ-инфекции и СПИДа

Сегодня, наверное, каждый человек слышал о ВИЧ и СПИДе и знает, что эти заболевания очень опасны, что передаются они в основном во время незащищенного барьерным способом полового акта. А между тем, первые случаи инфицирования были зафиксированы не так давно — в 1978 году (у нескольких мужчин-гомосексуалов из США и Швеции). Сам вирус был открыт в 1983 году.

В первую очередь ВИЧ атакует и разрушает лимфоциты (Т-лимфоциты, или хелперы). Они отвечают за иммунный ответ организма, распознавание и уничтожение инфицированных клеток. В результате заболевший теряет способность противостоять инфекциям.

У здорового человека количество Т-лейкоцитов составляет 1200–3000 клеток/мкл. После ВИЧ-инфицирования число клеток снижается. При этом заболевший продолжает чувствовать себя нормально. Данный период болезни может длиться на протяжении многих лет. Но наступает момент, кода количество клеток-хелперов достигает критической отметки. Это может проявиться следующими проблемами:

• кандидоз полости рта и ЖКТ;
• опоясывающий лишай (герпес);
• неделями не спадающая высокая температура;
• ночная потливость;
• диарея;
• частые ОРЗ и ОРВИ и др.

Если число Т-лимфоцитов снижается до 200 клеток/мкл, то диагностируют СПИД. Организм больного в таком состоянии не может сопротивляться даже простейшим микроорганизмам — от дрожжей до вирусов. У здорового человека к ним развивается резистентность, тогда как страдающего СПИДом они могут довести до летального исхода. Чаще всего возбудителями смертельных заболеваний становятся токсоплазма, криптоспоридии, цитомегаловирус. Кроме того, снижение лимфоцитов провоцирует образование злокачественных опухолей.

При отсутствии должного лечения пациенты с ВИЧ-инфекцией не переступают порог выживаемости в 10 лет. Грамотно и своевременно назначенная терапия затормаживает развитие болезни, в разы увеличивая продолжительности жизни больного. ВИЧ-положительный человек в таком случае может дожить до преклонных лет.

Основной метод диагностики инфекции — анализ крови. С момента заражения до появления антител в крови проходит 1–3 месяца.

Разные виды лабораторных анализов венозной крови, взятой натощак, позволяют обнаружить наличие или отсутствие ВИЧ-инфекции в крови. Рассмотрим виды этих исследований.

• Скрининговое исследование иммуноферментными (ИФА) методами представляет собой выявление антител к антигенам ВИЧ-типов: ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Уже со второй недели после инфицирования могут появиться антитела, хотя они способны обнаружиться и позже — через несколько месяцев. В последующее время количество антител растет и сохраняется в крови пациента. При наличии антител в большинстве случаев клинические признаки ВИЧ не проявляются 2–10 лет.
  Отметим, что данный тест не всегда точен, возможен ложноположительный результат. В любом случае при положительном результате назначается повторный анализ через 2-3 недели.
• Верификационное исследование методом иммуноблота проводится, если описанный выше анализ дважды дал положительный результат. Данное исследование сочетает анализ ИФА и метод электрофореза, который позволяет разделить по молекулярному весу входящие в состав вируса антигены. Данное исследование имеет максимальную точность.

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени дает возможность определить концентрацию вирусной РНК в плазме крови. Тест проводят в целях ранней диагностики возможного инфицирования после случая повышенного риска (на 7–10 день после предположительного инфицирования).
  Также данный анализ назначается для оценки эффективности применяемой терапии, для решения вопроса о начале антиретровирусной терапии, о проведении кесарева сечения у инфицированных беременных за 4 недели до родов.
  Такое исследование крови проводят новорожденным детям инфицированных матерей. Полученный дважды положительный ответ говорит о заражении ребенка.

Поводом пройти исследование на ВИЧ-инфекцию может стать множество причин. Тест необходим перед оперативным вмешательством, в случае планирования беременности, риск приобретения данной инфекции несут случайные половые контакты. Отдельная категория граждан (врачи, педагоги, работники пищевых производств, продавцы пищевой продукции и др.) обязана проходить тест в рамках оформления медицинской книжки, являющейся обязательным условием допуска к работе.

Что касается тревожных симптомов, то обычно врачи назначают анализ на ВИЧ при следующих состояниях:

• Резкая потеря веса.
• Диарея, длящаяся более трех недель.
• Лихорадка неясного происхождения.
• Увеличение лимфатических узлов в разных областях.
• Лейкопения и лимфопения.
• Тяжелые инфекционные заболевания: пневмония, кандидоз внутренних органов, туберкулез, манифестный токсоплазмоз, частые случаи обострения герпесвирусной инфекции и другие.

Специальной подготовки перед сдачей венозной крови не требуется. Единственное — это воздержание от приема пищи в течение 8–10 часов. Также накануне рекомендуется избегать физических и эмоциональных нагрузок, отказаться от употребления алкоголя.

Вся процедура забора венозной крови занимает не более пяти минут. После взятия материала место укола дезинфицируют и заклеивают специальным пластырем. Так как анализ берется натощак, во избежание головокружения после забора крови следует выпить сладкий чай или съесть кусочек шоколада.

В государственных поликлиниках, чтобы получить направление на анализ, придется сначала посетить участкового терапевта. В частных же медицинских центрах нужно просто заполнить заявку на анализ. Для этого в клинике попросят предъявить паспорт или какой-либо другой документ, удостоверяющий личность (миграционная карта, водительские права, военный билет и т. д.). Документ позволит идентифицировать результаты анализа. Впрочем, тест на ВИЧ можно сделать и анонимно. В этом случае заявке и образцу крови, который отправляется на анализ в лабораторию, присваивается номер, известный лишь пациенту и медицинскому персоналу. Однако результаты анонимных исследований не могут быть представлены для госпитализации, в женские консультации и не могут быть зарегистрированы в ОРУИБ (Отдел регистрации и учета инфекционных болезней).

Следует помнить, что интерпретировать результаты исследования и поставить точный диагноз способен только врач. Полученный результат ни в коем случае не может быть поводом для самолечения, к тому же одни и те же результаты у разных пациентов могут говорить о противоположной клинической картине.

Показывает объем выявленной РНК вируса иммунодефицита человека, выраженный в C/ml (копии/мл). Интерпретировать результаты следует следующим образом:

1. РНК не выявлена, либо значение ниже предела чувствительности метода (20 копий/мл).
2. Меньше 20 копий/мл — РНК выявлена в концентрации на пределе чувствительности метода, характеристика с удовлетворительной точностью невозможна.
3. От 20 до 10 6 копий/мл — полученное значение находится в пределах линейного диапазона, результат достоверен.
4. Больше 10 6 копий/мл — РНК выявлена в указанной концентрации, выходящей за верхний предел линейного диапазона.

Анализы на ВИЧ можно сдать в частных клиниках. В этом случае стоимость скринингового исследования иммуноферментными методами в среднем составит от 400 до 800 рублей. Срок выполнения исследования — один рабочий день, хотя возможна и срочная диагностика, в таком случае ответ будет получен через 2 часа.

Верификационное исследование методом иммуноблота обойдется в 3000–5000 рублей. Результаты станут известны через 3–7 рабочих дней.

Полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени представляет собой более сложный анализ, поэтому его стоимость намного выше — она составляет 10 000–12 000 рублей. Результаты исследования готовятся в среднем 10–14 рабочих дней.

Согласно законодательству все иммунные анализы в государственных медицинских учреждениях проводятся бесплатно. В обязательном порядке проверку на ВИЧ-инфекцию проходят беременные женщины, пациенты, готовящиеся к оперативному вмешательству и госпитализации. В остальных случаях направление на данное исследование назначается по усмотрению врача.

Пройти анализ на ВИЧ-инфекцию сегодня не составляет сложности. Сама процедура практически безболезненна и занимает считанные минуты. Современное оборудование и методики проведения теста позволяют получить максимально точные результаты.

Во­пре­ки не­ко­то­рым мне­ни­ям, ВИЧ не яв­ля­ет­ся при­го­во­ром. Ин­фи­ци­ро­ван­ные лю­ди спо­соб­ны про­жить дол­гую, пол­но­цен­ную жизнь. Они мо­гут иметь семью, де­тей, без опа­се­ний об­щать­ся с окру­жа­ю­щи­ми. Глав­ное при этом вы­пол­нять осо­бые пра­ви­ла ги­ги­е­ны и бы­то­во­го по­ве­де­ния, знать, как свес­ти к ми­ни­му­му риск за­ра­же­ния до­мо­чад­цев. А в слу­чае воз­ник­но­ве­ния со­мни­тель­ных или спор­ных си­ту­а­ций — об­ра­щать­ся к спе­ци­а­лис­там: вра­чам, пси­хо­ло­гам. Но ни в ко­ем слу­чае не за­мы­кать­ся и не ста­вить на жиз­ни крест.

ПЦР – основной метод контроля течения ВИЧ-инфекции. Иногда его используют для первичной диагностики этого заболевания.

Суть методики ПЦР при ВИЧ

Не вдаваясь в сложные технические детали исследования, суть его можно описать следующим образом:

1. У вируса есть генетический материал. Он закодирован в РНК (рибонуклеиновой кислоте) с помощью нуклеотидов (молекул четырех видов, которые располагаются в разной последовательности).

2. Ученые владеют информацией о некоторых участках РНК, знаю нуклеотидную последовательность.

3. В ходе ПЦР проводится многократное удвоение вирусной РНК и сравнение её с эталоном (известной последовательностью нуклеотидов).

Таким образом, исследование позволяет определить, есть ли в крови пациента специфические – уникальные только для вируса иммунодефицита – фрагменты РНК. Определяется не только факт их наличия, но и количество – концентрация копий РНК в 1 мл крови. Эта информация важна для планирования лечения и оценки эффективности терапии.

Кому проводится ПЦР?

Основные области применения ПЦР:

1. Тестирование донорской крови на ВИЧ. Её проверяют и с помощью серологических тестов. Но те могут дать ложноотрицательный результат, если инфицирование произошло недавно. Поэтому кровь дополнительно обследуется методом ПЦР для выявления вирусной РНК – самого раннего маркера инфекции.

2. Первичная диагностика ВИЧ у новорожденных. Обычно для первичной диагностики ВИЧ-инфекции используют серологические тесты. Но в случае обследования новорожденных они не будут эффективными. Раз пациенту назначены анализы, это означает, что он родился от ВИЧ-инфицированной матери. В её крови есть антитела к вирусу иммунодефицита. Это означает, что они будут обнаруживаться и в крови ребенка.

Таким образом, при обследовании всех детей, рожденных от ВИЧ-позитивных матерей, будут получены положительные результаты ИФА. Но это не означает, что передача инфекции произошла. Ведь организм ребенка вполне может и не продуцировать собственных антител.

Диагноз можно подтвердить и с помощью серологических методов. О ВИЧ-инфекции говорит более высокая концентрация антител в крови ребенка, чем у матери, а также возрастание титра в динамике (если это материнские антитела, то их уровень должен со временем снижаться, а не увеличиваться).

В качестве альтернативного теста используется ПЦР. Обнаружение вирусной РНК тоже считается подтверждением присутствия вируса иммунодефицита. Специфичность теста составляет 99% (риск ложноположительного результата не превышает 1%). Но чувствительность ниже – около 96%. Поэтому требуется два исследования: первое проводится через месяц после родов, а второе – через 3 месяца (в этом возрасте чувствительность ПЦР достигает 100%).

Даже при двух отрицательных результатах ПЦР, нужно подтвердить исчезновение из крови материнских антител при помощи ИФА. Поэтому анализы сдаются в возрасте 1 год. Если положительная реакция сохраняется, то контроль проводится в полтора года.

3. Слабоположительная реакция. ИФА на ВИЧ является скрининговым тестом. Его результаты подтверждаются при помощи иммуноблота. Но это исследование иногда дает сомнительные результаты. В таких ситуациях стандартный алгоритм диагностики предполагает дополнительное тестирование таких пациентов через несколько месяцев. Но бывает, что результаты снова оказываются сомнительными или слабоположительными.

Самой частой причиной сомнительных результатов является недавнее инфицирование пациента. Но он также может быть следствием другой инфекции. Чтобы точно узнать, имеется ли у человека ВИЧ, можно выполнить ПЦР. Этот метод покажет точный результат уже после первого случая получения слабоположительной реакции.

4. Острый ретровирусный синдром. В большинстве случаев по своим клиническим проявлениям ничем не отличается от гриппа или инфекционного мононуклеоза. Большинство пациентов проходят под диагнозом ОРВИ. Но внимательный врач может обратить внимание на длительную лихорадку, тяжелое течение инфекции, отсутствие насморка и увеличение сразу нескольких групп лимфоузлов.

Ретровирусный синдром начинается спустя месяц после заражения. В этот период антител в крови ещё может не быть. Но ПЦР уже становится положительной. Поэтому именно этот способ диагностики применяют, если есть подозрение, что больной мог заразиться совсем недавно.

5. Противоречивые результаты основных тестов. Основными тестами является ИФА и иммуноблот. Иногда они проводятся одновременно, иногда – последовательно. Положительная реакция ИФА становится поводом для проведения иммуноблота. Это подтверждающий тест. Если он положительный, ставится диагноз ВИЧ. Но бывает, что подтверждающий тест оказывается отрицательным. Причин тому может быть две:

• ложноположительный результат ИФА (бывает в 3-4% случаев);
• ложноотрицательный результат иммуноблота (обычно в ранний период после заражения).

Разрешить противоречие помогает ПЦР. При отрицательном результате ВИЧ исключают, а при положительном – подтверждают. В случае получения отрицательного результата желательно повторно сдать анализы через 3 месяца, чтобы на 100% удостовериться в отсутствии ВИЧ.

6. Определение показаний к экстренной профилактике ВИЧ у медработника. Профилактика антиретровирусными препаратами показана, только если медработник повредил свою кожу инфицированным материалом. Иногда неизвестно, инфицирован ли человек, с кровью которого произошел контакт. В таком случае для его обследования лучше провести ПЦР, чем серологические тесты, так как они дают ложные положительные результаты на раннем этапе развития заболевания.

Изредка необходимость в ПЦР возникает, если нужно отличить ВИЧ 1 и 2 типа. Второй тип встречается редко – у 1 из 200 инфицированных. Обычно иммуноблот позволяет провести дифференциальную диагностику. Но иногда наблюдаются случаи перекрестной реактивности, когда антитела к ВИЧ-1 взаимодействуют с антигенами ВИЧ-2. Более точным тестом, позволяющим точно определить тип вируса, является ПЦР.

Преимущества и недостатки методики ПЦР при ВИЧ

Большинство производителей тест-систем указывают, что ПЦР может использоваться в качестве метода первичной диагностики ВИЧ. Однако в действительности в большинстве стран, в том числе в России, анализ на вирусную РНК не используют для этой цели, предпочитая ему серологические исследования. Это связано с некоторыми недостатками диагностического метода:

1. Большинство тестов, использующихся в рутинной врачебной практике, определяют только ВИЧ 1 типа. Но существует также ВИЧ 2 типа, вызывающий около 0,5% случаев заболевания.

2. Риск ложноотрицательного результата. Вирус быстро мутирует. Его генетический материал постоянно меняется. Поэтому участок РНК, на поиск которого направлена ПЦР, может оказаться измененным. Проблема решается путем проведения ПЦР с двойной мишенью. В этом случае реакция направлена на поиск сразу двух специфических фрагментов РНК. Вероятность, что оба они окажутся измененными в результате мутации, чрезвычайно мала. Но такое исследование стоит дороже.

3. Не выявляется ВИЧ у элитных контроллеров. Это группа людей – около 1% — организм которых способен сдерживать развитие вируса без помощи лекарств. У них не развивается синдром иммунодефицита. Вирусная нагрузка очень маленькая, поэтому ПЦР дает отрицательный результат. Но антитела в крови определяются, поэтому серологические тесты более эффективны. Существуют также люди с временным контролем ВИЧ-инфекции. У них способность контролировать вирус выражена слабее. Но на некоторое время достигается полное его подавление. И если в этот промежуток времени провести ПЦР, она покажет отрицательный результат.

4. Низкая эффективность после экстренной профилактики. Её выполняют после того как состоялось действие, которое могло послужить фактором передачи инфекции. Например, это может быть:

• ребенок, которого ВИЧ-инфицированная мать покормила грудным молоком;
• взрослый, вступивший в половую связь с ВИЧ-инфицированным человеком;
• медработник, уколовшийся зараженной иглой.

Но имеются и плюсы. ПЦР редко дает ложноположительные результаты. Кроме того, метод определяет количество вирусов в крови, что важно для выбора лечебной тактики.

Сколько времени делается анализ ПЦР, и где можно сдать?

Большинство лабораторий выдают результаты через 2 дня и более с момента взятия биоматериала. Сдать анализ ПЦР на ВИЧ в Москве по доступной цене вы можете в нашем медицинском центре.

🔊 Прослушать пост

ПЦР (полимеразная цепная реакция) представляет собой метод молекулярной генетики, который позволяет анализировать любую короткую последовательность ДНК (или РНК) даже в образцах, содержащих только мельчайшие количества ДНК или РНК, тем самым определив наличие/отсутствие патогенного возбудителя (определить, например есть ли в человеке вирус ВИЧ или гепатита Б или микобактерии туберкулёза). ПЦР используется для воспроизведения/умножения/клонирования (амплификации) выбранных участков ДНК или РНК для анализа.

Метод ПЦР настолько прост, что его может поставить даже школьник)

Раньше амплификация ДНК включала клонирование сегментов, представляющих интерес, в векторы для экспрессии в бактериях и занимала недели. Но теперь, когда ПЦР делается в пробирках, требуется всего несколько часов. ПЦР является высокоэффективной, так что из ДНК может быть сделано огромное количество копий.

Последовательность ДНК и соответствие нуклеотидов.

Более того, ПЦР использует те же молекулы, которые природа использует для копирования ДНК:

То есть ПЦР — это такая техника при которой частицы ДНК (иногда РНК) умножаются в определенном растворе или на специальной поверхности, где они могут быть депонированы.

ПЦР — это метод, с помощью которого учёные могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл.

Ключом к пониманию ПЦР является знание о том, что каждый человек, животное, растение, паразит, бактерия или вирус содержит генетический материал — ДНК (или РНК) последовательности (нуклеотидные последовательности или кусочки ДНК (или РНК)), которые уникальны для каждого индивидуума. То есть, если образец содержит сегменты ДНК или РНК,

задача ПЦР как метода — умножить (амплифицировать), сделать как можно больше их копий, чтобы можно было идентифицировать кому они могут принадлежать (определенному человеку, животному или патогенному организму), даже если есть только следы наличия ДНК/РНК.

Однако ПЦР-амплификация является лишь частью диагностического теста. После проведения амплификации амплифицированные сегменты необходимо сравнить с другими нуклеотидными сегментами, но уже из известного источника (например, конкретного человека, животного или патогенного организма). Это сравнение уникальных сегментов часто выполняется путем размещения нуклеотидных последовательностей, сгенерированных ПЦР, рядом с известными нуклеотидными последовательностями от людей, патогенов или других источников в специальном геле.

В 1983 году Кари Муллис разработал основные этапы по амплификации ДНК-последовательностей. Он и Майкл Смит были удостоены Нобелевской премии за создание ПЦР в 1993 году.

ПЦР проводится в одной пробирке с соответствующими химическими веществами и при определенной температуре нагревания.

Необходимы следующие реагенты или химикаты:

• Образец, содержащий нуклеотидную последовательность (из крови, волос, гноя, кожи и т. д.).
• ДНК-праймеры: короткая одноцепочечная ДНК, которая присоединена к нуклеотидным последовательностям, которая способствует синтезу комплементарной цепи нуклеотидов.
• ДНК-полимераза: фермент, который, когда ДНК связывается с праймером, спускается по фрагменту ДНК с добавлением структурных блоков ДНК для образования комплементарных пар оснований и, таким образом, синтезирует комплементарную нуклеотидную цепь ДНК (введение термостойкой ДНК-полимеразы, Taq-полимеразы , полученной из термостойких бактерий, заметно улучшает способность к ПЦР).
• Большой избыток структурных блоков ДНК, называемых нуклеотидами (аденин, тимидин, цитозин и гуанин, сокращенные как: A, T, C и G соответственно) в растворе. Когда эти блоки соединены вместе, они образуют нуклеотидную последовательность или одну нить ДНК. Когда эти строительные блоки связывают свой комплементарный строительный блок слабыми водородными связями (например, A будет связываться только с T и G только с C) образуется комплементарная нуклеотидная последовательность ДНК, которая связана с исходной одноцепочечной ДНК. Когда связывание завершается, комплементарная ДНК с двойной цепью образуется в определенной последовательности.

Он верит в астрологию, но не верит, что ВИЧ вызывает СПИД.)

Затем полимеразно-цепная реакция начинается с сегмента ДНК из образца, который помещается в пробирку с указанными выше реагентами. Раствор нагревают до 94°С. Нагревание разрушает водородные связи, которые позволяют образовывать комплементарные цепи ДНК, поэтому в смеси существуют только одиночные нити (это называется денатурацией двухцепочечной ДНК).

Этапы ПЦР

Смеси дают остыть до 54°C. При этой температуре ДНК-праймеры и ДНК-полимераза связываются с отдельной одноцепочечной ДНК (это называется отжигом ДНК). Поскольку строительных блоки в избытке (высокая концентрация) в смеси, полимераза использует их для создания новых комплементарных нитей ДНК (называемых расширением ДНК), и этот процесс происходит быстрее при 72°C. Этот процесс создает новую двухцепочечную молекулу ДНК из каждой из одиночных нитей исходной молекулы.

Этот цикл повторяется примерно 40 раз в машине, называемой термическим циклером (термосайклером), который автоматически повторяет циклы нагрева-охлаждения, при этом количество каждой последовательности ДНК удваивается каждый раз, когда цикл нагрева-охлаждения завершается. То, что изначально было одним коротким сегментом ДНК, можно было увеличить до примерно 100 миллиардов копий после 40 циклов удвоения.

Тест на ПЦР является основой для ряда тестов, которые могут отвечать на многие различные медицинские вопросы, которые помогают врачам диагностировать и лечить пациентов. Например, тесты ПЦР могут обнаруживать и идентифицировать патогенные организмы у пациентов, особенно тех, которые трудно культивировать (например, ВИЧ и другие вирусы и некоторые грибы).

Одни врачи назначают ПЦР-тесты, чтобы помочь диагностировать генетические заболевания, в то время как другие врачи используют ПЦР для обнаружения биологических родственных отношений, таких как идентификация родителей детей. ПЦР-тесты также используются для идентификации и характеристики генетических мутаций и перегруппировок, обнаруженных при определенных раковых заболеваниях.

Тем не менее, ПЦР-тесты были модифицированы и внедрены во многие аспекты научных исследований, включая эволюционную биологию, генетическую отпечатку пальцев, судебно-медицинские исследования и многие другие.

Обратно-транскриптазный ПЦР (RT-PCR) — это тест на ПЦР, который предназначен для обнаружения и измерения количества РНК. Хотя первоначальные тесты ПЦР амплифицировали ДНК, многие вирусы и другие биологические компоненты (например, митохондрии) используют РНК в качестве своего генетического материала. RT-PCR отличается от обычной ПЦР сначала взятием РНК и превращением нити РНК в нить ДНК. Это делается по существу тем же самым методом для ПЦР, описанным выше, за исключением использования фермента, называемого обратной транскриптазой, вместо ДНК-полимеразы.

Обратная транскриптаза позволяет перевести одну нить РНК в комплементарную цепь ДНК. Как только эта реакция происходит, рутинный метод ПЦР можно затем использовать для амплификации ДНК. RT-PCR используется для обнаружения и изучения многих РНК-вирусов. RT-PCR не следует путать с другим вариантом ПЦР, называемым ПЦР в реальном времени (реал-тайм).

ПЦР в реальном времени представляет собой вариацию ПЦР, которая позволяет анализировать амплифицированную ДНК в течение обычных 40 циклов процедуры. Хотя процедура аналогична обычной ПЦР с циклированием, ПЦР реального времени использует флуоресцентные красители, прикрепленные к некоторым из строительных блоков или небольших нуклеотидных нитей. В зависимости от используемого метода флуоресценция возникает, когда образуются амплифицированные нити ДНК. Количество флуоресценции можно измерить на протяжении 40 циклов и позволяет исследователям измерять определенные продукты и их количества во время циклов амплификации.

Это часто позволяет исследователям или техническим специалистам пропускать гель-электрофорез или другие вторичные процедуры, необходимые для анализа продуктов ПЦР, тем самым обеспечивая более быстрые результаты. ПЦР в реальном времени и RT-PCR являются вариациями или модификациями исходного теста ПЦР. Тем не менее, существует еще много вариантов (не менее 25), которые существуют и используются для решения конкретных проблем. Все они имеют разные названия, такие как сборка ПЦР, ПЦР с горячим началом, мультиплексная ПЦР, твердотельная ПЦР и многие другие.

ПЦР будет развиваться и дальше, чтобы помочь ответить на многие другие вопросы в медицине, биологии и других областях науки.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) — метод умножения генетического материала вируса, анализ, который определяет генетический материал вируса — РНК или ДНК ВИЧ.

Если вирус содержится в минимальном значении, то в результате реакции это количество многократно увеличивается. Поэтому ПЦР имеет высокое диагностическое значение.

Обычно этот тест используется для определения ВИЧ в донорской крови или для раннего определения наличия ВИЧ в организме до выработки специфических антител к ВИЧ. Специфические антитела определяют обычные тесты на ВИЧ (ИФА), но только через 1-3, редко 12 месяцев после заражения. А с помощью ПЦР можно дать достаточно точный ответ через 14 дней с достоверностью 98% и даже через 5 дней, но тогда достоверность будет 80%. ПЦР на ВИЧ — это дорогой и более трудоемкий анализ, чем ИФА, поэтому его используют не всем подряд, а только по особым показаниям (доноры, пострадавшие от медицинской аварии с ВИЧ-инфицированным) или платно.

Это метод определения комплиментарного участка ДНК в геноме клетки лимфоцита пораженного ВИЧ. Т.е. определяется не сам вирус, а материал, который вирус встраивает в клетку. В ядре клетки уже будет храниться его ДНК из которой он потом будет считываться и размножаться (копировать самого себя).

Количественный ПЦР анализ на РНК ВИЧ — определяет количество копий РНК вируса в крови (для определения вируса в клетках используют ПЦР ДНК, например у детей). Делается только у ВИЧ-инфицированных, для контроля лечения, определения выраженности процесса развития болезни, эффективности лечения.

ВИЧ с помощью ПЦР можно обнаружить через 4-14 дней после заражения. Отрицательный результат ПЦР на ВИЧ достоверен после 14 дней после рискованного контакта, но по действующим нормативам всё равно требуется обследование с помощью ИФА.

РНК обычно используется в количественных тестах для оценки вирусной нагрузки у диагностированных лиц, например, для оценки эффективности терапии.

ДНК — в мононуклеарных клетках, например, для диагностики у детей, там, где антитела к ВИЧ матерей мешает использовать метод ИФА.

И тот и другой тест могут быть и количественными, и качественными.

И тот, и другой можно в особых случаях применить диагностики, но с учетом конкретных ограничений, которые накладывают технические параметры системы, т.е. по назначению врача.

Но если были допущены ошибки со стороны персонала медицинского учреждения , ТО ПЦР может быть ложноположительным, более чем в 2% случаев.

Для исследования на ВИЧ методом ПЦР сдаётся кровь из вены, желательно (но необязательно) утром натощак.

Москва: ЦМД (2450 руб.), ИАКИ (2300 руб.). Санкт-Петербург: СПб СПИД-центр. Екатеринбург: КДЛ (2480 руб.). Самара: СитиЛаб (1400 руб.). Краснодар: КДЛ (3000 руб.). Минск: Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья. Киев: Первая Независимая Лаборатория.

Около 1,5-3 тыс. руб. в зависимости от региона.

Через 14 дней после заражения достоверность ПЦР на ВИЧ составляет 100%, с 4-5 дня — достоверность 80%.

Технически 4-6 часов, но в реальности зависит от организации работы лаборатории и обычно результат выдается через 2-3 дня.

Так как у ребёнка до 1,5 лет рожденного от ВИЧ+ матери сохраняются её антитела против ВИЧ, то определить заражен ВИЧ ребенок или нет с помощью ИФА невозможно. В такой ситуации используется ПЦР:

• Если у ребенка возрастом 1 мес с помощью ПЦР обнаружили вирус, значит он заразился.
• Если у ребенка в 1-2 месяца и 4-6 месяцев ПЦР отрицательная, то при условии, что мать не кормила его своим грудным молоком — ребёнок здоров.

ПЦР определяет сам вирус, а ИФА реакцию (в виде антител) организма на вирус.

ПЦР быстрее определяет наличие вируса, чем ИФА.

Новый алгоритм определения ВИЧ.