Правила забора хранения крови для исследования на вич

Приложение N 6
к приказу
от 27 января 2006 г. N 16/9

Правила забора, хранения и транспортировки
крови для исследования на ВИЧ

1. Для исключения ложных результатов при исследовании на антитела к ВИЧ рекомендуется неукоснительно выполнять следующие правила забора и транспортировки сывороток крови:

1.1. Кровь для первичной серодиагностики в ИФА берется из локтевой вены в количестве 3-5 мл, желательно натощак, в чистую сухую пробирку.

Допускается пальцевая проба у детей. При невозможности взятия крови из вены, кровь может быть взята из пальца в количестве до 1 мл.

1.2. Пробирки герметично закрывают резиновыми или ватно-марлевыми, обернутыми полиэтиленовой пленкой, пробками и помещают в штатив, который доставляется в лабораторию в специальном контейнере или биксе с маркировкой "Осторожно, AIDS". Не допускается перевозка материала в сумках, портфелях и других предметах личного пользования, а также запрещается доставка биоматериала на исследование больными или родственниками пациентов. При перевозке на транспорте требуется доставлять исследуемый материал для проведения скрининговых исследований в сумках-холодильниках (термоконтейнерах) при температуре +4 +8. При необходимости возможно использование уплотнителей (вата, поролон), которые в последующем в лаборатории подлежат обеззараживанию и утилизации. Запрещается перевозка на общественном транспорте.

1.3. Срок хранения крови, забранной для анализа на ВИЧ, - не более 12 часов при комнатной температуре и не более 1 суток в холодильнике при +4 +8 град. Наступающий гемолиз может повлиять на результат анализа. По этой причине цельная кровь должна быть доставлена в диагностическую лабораторию в день забора.

1.4. Предпочтительнее сразу после взятия крови и наступления ретракции кровяного сгустка после ценрифугирования (или отстаивания) отобрать сыворотку. Отдельная сыворотка переносится в чистую (лучше стерильную) пробирку, пластиковый контейнер. Если сыворотка не может быть сразу же доставлена в СПИД - лабораторию, то в таком виде она может храниться до 3 дней при температуре +4 +8 С.

Категорически запрещается переливание сыворотки через край пробирки, пипетирование сыворотки ртом. Отсасывание сыворотки производит лаборант с помощью груши, лучше автоматическими пипетками с одноразовыми наконечниками, при этом необходимо обеспечить, чтобы каждый образец сыворотки отбирался индивидуальным наконечником. Стеклянные палочки и пипетки должны быть индивидуальными для каждой сыворотки. Ни в коем случае нельзя использовать повторно палочки и пипетки в процессе отделения сыворотки из разных образцов, т.к. это может привести к перекрестной контаминации отрицательных сывороток.

1.5. Пробирки маркируют карандашом по стеклу. Не рекомендуется использовать для этой цели этикетки из лейкопластыря. Номера пробирок в штативе должны соответствовать номерам в направлениях и в общем списке. Зачеркивать, вносить изменения, поправки категорически запрещается.

1.6. Сопроводительная документация составляется в 2-х экземплярах. Лечебно-профилактические учреждения при первичном (скрининговом) лабораторном исследовании пациентов на антитела к ВИЧ заполняют направление по форме N 264/у-88. Зачеркивания, внесение изменений, поправки категорически запрещены. Направления помещают в полиэтиленовые пакеты и доставляют в лабораторию вне контейнера.

1.7. В случае поступления в лабораторию биоматериалов на исследование с направлением в виде свободной таблицы-списка, необходимо одновременно предоставить заполненный бланк направления отдельно на каждого обследуемого по форме N 264/у-88 (см. Приложение N 7).

1.8. С целью обеспечения полноты обследования на ВИЧ, особенно в условиях работы стационаров, необходимо осуществлять забор крови на ВИЧ ежедневно, включая выходные и праздничные дни. После отстаивания или получения сыворотки путем центрифугирования рекомендуется отделить сыворотку от кровяного сгустка (лучше в стерильную пробирку) и доставить в СПИД-лабораторию в день транспортировки, сохраняя сыворотку в холодильнике при температуре +4 +8 С.

1.9. Лаборатории диагностики ВИЧ-инфекции/СПИД перекладывают присланный материал в штативы или другие емкости диагностической лаборатории, помещенные на эмалированные или металлические подносы, и переносят в комнату разборки и подготовки материала для серологических исследований. Контейнеры, в которых доставлен материал, после разгрузки обрабатывают дезраствором.

1.10. Лаборатория в обмен выдает пробирки, обработанные согласно МУ 3.5.1/3.5.4.001-98, в полиэтиленовые мешки учреждений. Штативы и биксы возвращают только после дезинфекции.

1.11. Термоконтейнеры или биксы с биоматериалом доставляет в лабораторию персонал, прошедший инструктаж. Выполнение этими лицами данных функциональных обязанностей должно быть предусмотрено приказом по ЛПУ.

2. В случае положительного скринингового теста на антитела к ВИЧ проводится дальнейшая серологическая диагностика с целью подтверждения специфичности полученного результата в референс-лаборатории.

2.1. С целью окончательного лабораторного подтверждения ВИЧ-инфекции забор крови осуществлять лучше в стерильную пробирку, желательно натощак, свежеприготовленная сыворотка доставляется в референс-лабораторию в день забора крови.

2.2. При повторном взятии крови необходимо предупредить все возможные ошибки обусловленные неточностью маркировки пробирок и заполнения бланков направлений, которые могут привести к подмене сывороток от разных пациентов.

2.3. При отправке в референс-лабораторию второй порции сыворотки для проведения подтверждающей серологической диагностики ВИЧ-инфекции заполняется сопроводительная документация, составленная по форме N 265/у-88 (Приложение N 8), заверенная подписью врача, направившего материал на референс-исследование.

2.4. Сыворотка упаковывается в соответствии с правилами транспортировки инфекционного материала и доставляется в штативе, отдельном от других образцов, с собой маркировкой пробирок красным карандашом по стеклу.

2.5. Прием контейнера с сывороткой, предназначенной для проведения подтверждающих тестов, регистрируется в отдельном журнале с указанием должности, фамилии лица, ответственного за транспортировку сыворотки, направленной на перепроверку или постановку иммуноблота.

3. При проведении повторных исследований на антитела к ВИЧ, при сомнительных результатах первичного исследования сыворотки крови, (через 3 месяца и при сохранении неопределенных результатов - через 6 месяцев) - забор крови и транспортировка проводится в соответствии с п.п. 2.1.-2.5. с обязательной отметкой в ф. N 265/у-88 (Приложение N 8).

> N 8. Направление N_____ на исследование крови на СПИД в референс-лабораторию

Содержание Приказ Министерства здравоохранения Самарской области от 27 января 2006 г. N 16/9 "Об улучшении работы по выявлению ВИЧ-инфицированных.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Взятие, доставку и оформление материалов для проведения лабораторных исследований методом ИФА на ВИЧ-инфекцию и СПИД - индикаторные заболевания, для проведения лабораторных исследований методом ПЦР на ВИЧ - инфекцию, вирусные гепатиты В и С, а также для иммунологических исследований в КДЛ ГБУЗ РЦПБ СПИД и ИЗ производить строго в соответствии с правилами (приложение 1, 2, 3).

Наиболее частыми нарушениями указанных правил являются следующие:

1) при оформлении сопроводительной документации не указывается наименование диагностической тест-системы, ее серия, срок годности

2) не полностью указываются паспортные данные обследуемых, а также дата и место взятия материала

3) зачастую в лабораторию ГБУЗ РЦПБ СПИД и ИЗ доставляется материал, уже непригодный для исследования: сыворотки, хранившиеся дольше установленного срока хранения (для разных методов исследования сроки хранения составляют от 3 до 48 часов); проросшие, гемолизированные сыворотки, в недостаточном для исследования количестве (в зависимости от метода минимально необходимый объем материала составляет от 2 до 5 мл);

4) номера, проставленные на флаконах, не соответствуют указанным в направлении; количество проб крови не соответствует количеству, указанному в направлении;

5) неправильно производится взятие материала, в пробах крови, доставляемых для исследований методом ПЦР и для иммунологические исследований, обнаруживаются сгустки,

6) при заборе материала не всегда медицинский персонал ЛПУ обращает внимание на сроки годности пробирок.

Правила взятия и доставки крови для проведения лабораторных исследований методом ИФА на ВИЧ-инфекцию и СПИД-индикаторные заболевания.

Взятие крови производится из локтевой вены в чистую сухую пробирку в количестве 3-5 мл. У новорожденных можно брать пуповинную кровь с указанием об этом в направлении. Полученный материал не рекомендуется хранить более 12 часов при комнатной температуре и более 1 суток в холодильнике при +4-8 0С. Наступающий гемолиз может повлиять на результаты анализа. В случае невозможности доставки материала в течение суток следует сразу после взятия крови отобрать из нее сыворотку. Сыворотка отделяется центрифугированием. Отделенная сыворотка переносится в чистую (лучше стерильную) пробирку, флакон или пластиковый контейнер, и в таком виде она может храниться до 7 дней при температуре +4-8 0С. На пробирке следует указать порядковый номер, фамилию и инициалы пациента, в строгом соответствии с направлением. Для транспортировки в КДЛ диагностики ВИЧ штативы с пробирками помещают в термоконтейнер, легко подвергающийся дезинфекции. Полученный материал в КДЛ диагностики ВИЧ доставляет медицинский персонал, прошедший специальный инструктаж в установленном порядке.

Утв. МЗ СССР от 05.09.1988 г. №690

Направление №__________________

на исследование образца крови в ИФА на ВИЧ-инфекцию

В_________________________________________________________
(наименование учреждения)

Должность лица, направляющего материал___________________________________

Взятие материала для исследования производить только при предъявлении пациентами паспорта или иного документа, удостоверяющего его личность (кроме анонимного обследования).

Коды контингентов

Наименование кода

код

Доноры (крови, биологических жидкостей, органов и тканей)

Медицинский персонал, работающий с ВИЧ - инфицированными лицами и инфицированным материалом

Гомо- и бисексуалисты

Больные заболеваниями, передающимися половым путем

Лица, находящиеся в местах лишения свободы

Обследованные по клиническим показаниям

Беременные (доноры плацентарной и абортной крови)

Обследованные при эпидемиологическом расследовании

Для лабораторий диагностики ВИЧ-инфекции в обменном журнале и направлении обязательно дополнительно указываются результаты исследования (ОП сыворотки, ОП критическое), а также дата постановки, название, серия, срок годности используемой тест-системы.

Правила взятия, хранения и доставки материала для проведения исследований методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В направлении должны быть четко указаны: учреждение, направившее материал, Ф.И.О. (полностью), год рождения, код контингента, домашний адрес, дата, точное время и место взятия материала, фамилия и подпись ответственного лица с указанием номера контактного телефона.

Правила взятия и доставки материала для проведения иммунологических исследований.

Материал должен быть доставлен в лабораторию сразу после взятия. Недопустимо замораживание биологического материала. Флаконы должны быть четко промаркированы с указанием фамилии пациента, даты и времени взятия. Маркировка флаконов должна строго соответствовать данным, указанным в направлении.

В направлении должны быть четко указаны: учреждение, направившее материал, Ф.И.О. (полностью), год рождения, код контингента, домашний адрес, дата, время и место взятия материала, фамилия и подпись ответственного лица с указанием номера контактного телефона.

действует Редакция от 21.03.2003 Подробная информация

ПРАВИЛА СБОРА, ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ ОБРАЗЦОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ И ВИРУССОДЕРЖАЩИХ МАТЕРИАЛОВ

1. Сбор, хранение и транспортировка образцов сыворотки крови

Для лабораторной диагностики кори используются серологические методы исследования, основанные на выявлении вирусспецифических антител в одной или парных сыворотках крови.

В лабораторной сети Европейского региона для диагностики кори рекомендуют использовать метод иммуноферментного анализа (ИФА), предназначенный для обнаружения в сыворотке крови вирусспецифических LgM-антител, в редких случаях — LgG-противокоревых антител.

LgM-ИФА обладает высокой специфичностью и чувствительностью, требует для исследования одного образца сыворотки. Метод легко осуществим в лабораториях на местах, обеспечивает получение быстрых и достоверных результатов, на которые можно ориентироваться при проведении надзора за корью.

Только в случае получения сомнительных результатов в LgM-ИФА целесообразно использовать LgG-ИФА, однако при этом необходимо иметь для исследования две сыворотки, полученные от больного в активной фазе заболевания (4 — 5 день сыпи) и в период реконвалесценции (2-ую сыворотку допускается брать через 1 — 2 недели, но не позже 1,5 мес. с момента заболевания).

1.1. Техника взятия, маркировка и регистрация проб крови

Для серологической диагностики кори можно использовать как капиллярную, так и венозную кровь.

Капиллярную кровь берут из пальца в асептических условиях. Перед взятием крови кисть руки пациента согревают горячей водой, затем насухо вытирают чистым полотенцем. Палец, протерев 70 °C спиртом, прокалывают стерильным скарификатором одноразового пользования. Кровь в количестве 1,5 — 2,0 мл собирают в стерильную одноразовую центрифужную пробирку (или в специальные микропробирки для взятия капиллярной крови). После взятия крови место укола смазывают йодом, а пробирку закрывают резиновой пробкой.

Кровь из вены в количестве 5 мл берут стерильным шприцем в стерильную пробирку в строго асептических условиях, используя для этого специальное помещение, полностью соответствующее санитарно-эпидемиологическим требованиям.

На пробирку с кровью следует наклеить этикетку (лучше пользоваться полоской лейкопластыря) с указанием регистрационного (порядкового) номера, фамилии, имени, даты взятия крови.

На месте сбора образцов сывороток крови следует хранить дубликаты списков обследованных лиц и результаты исследования сывороток в течение не менее 1 года.

1.2. Техника первичной обработки крови

Для получения сыворотки пробирку с кровью оставляют в наклонном (под углом 10° — 20°) положении при комнатной температуре на 30 минут для образования сгустка, после чего пробирку с кровью встряхивают (для отделения сгустка от стенки пробирки), закрывают пробкой и ставят на ночь в холодильник при температуре +4° — 8 °C.

После отделения сыворотки от сгустка (пробирки можно обвести по внутренней поверхности пастеровской пипеткой), ее центрифугируют при 500 g (1500 об./мин.) в течение 7 — 10 минут. Затем сыворотку отсасывают пипеткой в стерильные центрифужные (пластиковые) пробирки (или эппиндорфы) с обязательным переносом на них этикетки с соответствующей пробирки.

Если в лаборатории нет центрифуги, то цельную кровь надо оставить в холодильнике до тех пор, пока не произойдет полная ретракция сгустка (отделение сгустка эритроцитов от сыворотки). Осторожно, тщательно избегая повреждения эритроцитов, перенести сыворотку в другую стерильную пробирку, снабженную этикеткой. Сыворотка должна быть прозрачной, светло-желтого цвета, без выраженного гемолиза.

Поступившие в лабораторию ЦГСЭН в субъекте Российской Федерации сыворотки можно хранить до передачи в вирусологическую лабораторию регионального центра в бытовых холодильниках при температуре +4 °C не более 7 дней.

Исследование сывороток осуществляется в вирусологической лаборатории регионального центра, где они должны храниться замороженными при температуре -20 °C в течение 1 года. Многократное замораживание и оттаивание сыворотки не допускается, в связи с чем сыворотку перед замораживанием необходимо разлить в несколько эппиндорфов по 0,25 мл.

1.3. Транспортировка образцов сыворотки (крови)

Перед транспортировкой собранного материала очень важно принять меры предосторожности: проверить наличие маркировки и сопроводительной документации (аккуратно заполненные этикетки на пробирках, списки и направления), прочно закрыть пробирки пробкой, расположить пробы согласно их номерам, уложить сыворотки в пластиковый пакет.

Для транспортировки крови (сыворотки) следует использовать термоконтейнеры (сумки-холодильники, термос, пенопластовую коробку). Если используются холодильные элементы (они должны быть заморожены), то положите их на дно и по бокам контейнера (коробки), а затем внутрь поместите пластиковый пакет с образцами сыворотки, а сверху вновь положите замороженные элементы. Сопроводительные документы (списки и направления на лабораторное исследование), указав время и дату отправления, поместите в полиэтиленовый пакет, положите его под крышку термоконтейнера или коробки.

Когда приготовления к отправке будут закончены, проинформируйте получателя о времени и способе транспортировки. При пересылке проб железнодорожным или воздушным транспортом лабораторию необходимо известить (по телефону, телеграммой) о номере поезда и вагона (рейса), дате и времени отправки и прибытия, количестве проб и пр.

При транспортировке образцов цельной крови в зимнее время года следует особенно следить за ее сохранением, не допуская замораживания.

Образцы крови должны быть доставлены как можно скорее. Не ждите, пока образцы накопятся!

1.4. Обработка медицинского инструментария

Обработка лабораторного инструментария и перевязочного материала, а также сбор и утилизация отходов медицинского назначения осуществляются в соответствии с действующими нормативными документами.

2. Сбор, транспортировка и хранение вируссодержащих образцов

В ходе реализации эпиднадзора за корью на этапе ее элиминации необходимо наладить слежение за циркуляцией вируса с помощью идентификации штаммов вируса кори и генетической характеристики вирусных изолятов.

Вирус кори можно выделить в продромальной стадии заболевания и в стадии высыпания из различных материалов от больного: из мочи, назофарингеальных секретов и из лимфоцитов периферической крови. Интенсивность экскреции вируса быстро падает. Обнаружение и идентификация вируса кори на культуре клеток занимает несколько недель. Эти исследования должны проводиться на базе Национального центра по надзору за корью для слежения за биологическими свойствами циркулирующих на территории России штаммов вируса кори.

Выделение изолятов вируса кори позволяет в дальнейшем проводить их генетический анализ и сравнивать штаммы, полученные из различных мест в разные годы. Таким образом можно получить исчерпывающую информацию об их происхождении и проследить пути передачи вируса. Для проведения молекулярно-эпидемиологического анализа надо иметь коллекции местных штаммов вируса из эндемичных стран.

Выделение вируса — это достаточно дорогостоящий и трудоемкий метод, который занимает много времени и требует наличия вирусологической лаборатории, оборудованной специально для работы с культурами клеток и выделения вирусов. Вирус кори чрезвычайно чувствителен к повышению температуры. Поэтому образцы материалов, предназначенные для выделения вируса, должны быть транспортированы в лабораторию как можно быстрее и в условиях строгого соблюдения холодовой цепи.

Сбор и транспортировка вируссодержащих образцов проводится на базе региональных центров по надзору за корью.

2.1. Сбор, транспортировка и хранение образцов мочи

Для исследования берут пробы мочи в объеме 10 — 50 мл. Целесообразно использовать первую утреннюю порцию мочи, содержащую большее число эпителиальных клеток, из которых, как правило, и выделяется вирус кори. Наиболее успешно удается выделение вируса из образцов мочи, полученных на самых ранних стадиях болезни — в момент появления сыпи и максимум в течение 5 дней от момента высыпания.

Мочу собирают в стерильную емкость, охлаждают до +4 — 8 °C, центрифугируют в ближайшие несколько часов после забора. Центрифугирование проводят при 500 g (1500 об./мин.) в течение 5 мин. при +4 °C. Надосадочную жидкость выливают, а осадок ресуспендируют в 1 мл вирусной транспортной среды (см. Примечание) или питательной среды для культур клеток (RPMI, ИГЛА и другие).

Ресуспендированный осадок может храниться при температуре 4 °C не более 48 часов перед доставкой его в Национальный центр по надзору за корью или другую лабораторию, занимающуюся молекулярно-генетическим типированием вируса кори. В противном случае осадок должен быть заморожен в транспортной вирусной среде при -70 °C и отправлен с сухим льдом в герметично закрытых пробирках, предохраняющих этот осадок от воздействия углекислого газа.

В герметично закрытых емкостях, при 4 °C, можно транспортировать образцы цельной мочи, но лучше мочу отцентрифугировать в течение 24 часов после сбора и транспортировать ресуспендированный осадок.

Ресуспендированный осадок не следует замораживать, если можно его отправить на исследование в течение ближайших 48 часов.

Образцы мочи не следует замораживать до окончания процедур концентрирования.

2.2. Сбор, транспортировка и хранение назофарингиальных образцов

Назофарингиальные образцы (образцы носоглоточных смывов) должны быть взяты у больного как можно раньше, не позднее пятого дня с момента появления сыпи. В это время в этих образцах будет наиболее высокая концентрация вируса.

Назофарингиальные образцы могут быть взяты у больного одним из следующих способов, перечисленных в порядке возможности выделения вируса:

Аспирация носового секрета. Производится путем введения в нос 2 — 3 миллилитров стерильного физиологического раствора шприцем через надетый на него тонкий резиновый зонд, после чего жидкость отсасывают и помещают в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой, в которой находится специальная транспортная среда для вирусов.

Полоскание (промывные воды). Со слизистых оболочек носоглотки получают путем полоскания горла небольшим количеством физиологического раствора (2 — 3 мл); промывные воды вносят в транспортную среду для вирусов.

Назофарингиальные смывы. Для взятия используют ватный тампон, которым протирают слизистую оболочку носоглотки с достаточным усилием, чтобы снять часть эпителиальных клеток. Тампоны помещают в маркированные стерильные пробирки с завинчивающимися крышками, в которых содержится 2 — 3 мл транспортной среды для вирусов.

Образец носового секрета, взятого любым из перечисленных выше способов и помещенного в вирусологическую транспортную среду , должен быть доставлен для исследования в течение 48 часов на холоде (при температуре 4 — 8 °C). Если условия не позволяют быстро отправить образец смыва из носоглотки, пробирку с тампоном следует энергично встряхнуть так, чтобы смыть клетки, а затем извлечь тампон. Назальные аспираты или смывы центрифугируют при температуре 4 °C при 500 g (1500 об./мин.) в течение 5 минут, затем осадок ресуспендируют в 2 мл питательной среды для клеточных культур. Ресуспендированный осадок и надосадочную жидкость хранят раздельно при температуре -70 °C и транспортируют в лабораторию на сухом льду в герметично закрытых флаконах, чтобы избежать попадания в них углекислоты.

Если нет в наличии специальной транспортной вирусологической среды, ее можно заменить физиологическим раствором или средой для клеточных культур.

Поскольку вероятность выделения вируса максимальна в первые 3 дня с момента появления сыпи, не следует задерживаться со сбором клинического материала для изоляции вируса; не ожидать результатов лабораторного подтверждения клинического диагноза кори.

2.3. Сбор, транспортировка и хранение крови

Для выделения вируса из лимфоидных клеток кровь берут из вены в строго асептических условиях на 1 — 3 день сыпи в объеме 1,0 — 2,0 мл. Кровь берут в стерильную пробирку с плотно закрытой пробкой. В пробирке должно находиться 0,1 мл гепарина — 500 МЕ (в 1 мл жидкого гепарина — 5000 МЕ). Непосредственно перед взятием крови пробирку с гепарином раскатывают по твердой поверхности для смачивания стенок пробирки гепарином, что предотвращает образование сгустков (пробку не мочить!). Хранить при +4 °C не более 24 часов. Как можно раньше отправить в Национальный центр, соблюдая холодовой режим (+4 °C).

Примечания. 1. Транспортная среда для выделения вирусов:

основной раствор Хенкса pH 7,4 с ХЕПЕС буфером (имеется концентрированный коммерческий раствор 10X);

бычий сывороточный альбумин — 2,0 г;

раствор пенициллина со стрептомицином (см. ниже) — 1,0 мл;

феноловый красный, 0,4%-ный раствор — 0,2 мл.

Растворите 2,0 г бычьего сывороточного альбумина в 100 мл дистиллированной воды, добавьте к 80 мл дистиллированной воды 10 мл раствора Хенкса, затем добавьте 10 мл 2%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина и 0,2 мл раствора фенолового красного. Стерилизуйте фильтрованием. Добавьте 1 мл раствора пенициллина со стрептомицином, разлейте в стерильные флаконы и храните при 4 °C.

2. Раствор пенициллина со стрептомицином:

кристаллический пенициллин С;

Растворите 10 в 6 ЕД пенициллина и 1,0 г стрептомицина в 100 мл стерильного ФБР. Разлейте во флаконы по 5 мл, храните при -20 °C. Добавление 1 мл этого раствора к 100 мл питательной среды позволяет получить раствор с окончательной концентрацией 1200 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина в 1 мл раствора.

Приложение N 5
к Приказу
Министерства здравоохранения
Российской Федерации
от 21 марта 2003 г. N 117

Клетками-мишенями ВИЧ в организме человека являются ден­дритные клетки, моноциты/ макрофаги, Т-лимфоциты, мегакариоциты, клетки тимуса, эозинофилы, клетки кишечника, клетки ЦНС: нейроны, микроглия, астроциты.

Характерные проявления ВИЧ-инфекции — тяжелый имму­нодефицит, обусловленный прогрессирующим снижением числа Т-хелперов и их функциональной недостаточностью. Избиратель­ное поражение этих клеток при ВИЧ-инфекции объясняется на­личием на их поверхности молекул CD₄, которые служат рецеп­торами ВИЧ.

Патогенез состоит из фаз связывания вируса с клеткой, проник­новения в клетку, репликации. Т-лимфоциты разрушаются за счет прямого повреждающего действия ВИЧ, образования синцития, ау­тоиммунных реакций.

II ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции включает в себя два последовательных этапа:

установление собственно диагноза ВИЧ-инфекции, то есть определение состояния инфицирования ВИЧ;

установление развернутого клинического диагноза, то есть определение стадии, характера течения ВИЧ-инфекции, наличия вторичных (развившихся вследствие ВИЧ-инфекции) и сопут­ ствующих заболеваний, определение маркеров прогрессирования ВИЧ-инфекции (уровня CD4-лимфоцитов в кропи и уровня РНК ВИЧ в крови).

Правила заполнения направлений обследования на бич

В процедурном кабинете на пробу биологического материала, предназначенную для тестирования на ВИЧ-инфекцию, оформля­ется сопроводительный медицинский документ-направление. На­правление составляют по форме 264/у — 88 в двух экземплярах. В направлении на исследование заполняются все графы. Записи дела­ются четко и аккуратно, без сокращений и исправлений. Зачерки­вать, вносить в направления изменения и поправки категорически запрещено.

В направлении содержатся следующие данные: название лечебно-профилактического учреждения-отправителя (обязательно наличие штам­па ЛПУ), номер пробы, цель исследования, фамилия, имя, отчество, пол, возраст пациента (дата рождения), гражданство, домашний адрес, место работы (учебы), код, дата взятия крови, а также должность, фамилия, имя отчество, подпись лица, направляющего материал на исследование. В слу­чае анонимного обследования пациента в направлении вместо фамилии, имени, отчества указывается буквенный или буквенно-цифровой шифр. Направления помещают в полиэтиленовые пакеты и доставляют в лабора­торию вместе с образцами крови.

ПРАВИЛА ЗАБОРА, ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ

ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ

на исследование образца крови на антитела к ВИЧ

Фамилия, имя, отчество (полностью)

Дата забора крови

Должность, фамилия, имя, отчество, подпись лица, направляющего материал

Фамилия, имя, отчество, подпись медицинской сестры, забиравшей кровь.

Для серологического обследования на антитела к ВИЧ используетсявенозная кровь. Кровь в количестве 3-5 миллилитров забирают из лок­тевой вены (или любой другой вены — запястья, тыла ладони и т.д.). У новорожденных кровь берется из пупочной, височной, яремной вен.

Для забора используют одноразовые шприцы с иглами и стеклянные пробирки или одноразовые вакуумные системы. Стеклянные пробирки с венозной кровью сразу после взятия герметизируют резиновыми пробка­ми. Отобранный биологический материал маркируется. На пробу оформ­ляется сопроводительный медицинский документ — направление.

Если доставка проб крови в лабораторию в течение рабочего дня невозможна, полученный материал (цельную кровь) следует хра­нить не более 1 суток в холодильнике при +4-8°С.

Если проба не может быть доставлена в лабораторию в течение суток с момента забора, необходимо отделить сыворотку от сгустка. Кровь отстаивают при комнатной температуре (+18-22°С) в течение 30 минут до полного образования сгустка. Затем пробирки центрифугируют. Отделенная сыворотка переносится в чистую (лучше сте­рильную) пробирку, флакон или пластиковый контейнер. Сыворотка отбирается одноканальной пипеткой с использованием одноразовых наконечников или одноразовыми индивидуальными шприцами. В крайнем случае используются индивидуальные пипетки, прошедшие дезинфекцию, предстерилизационную обработку и контроль предстерилизационной обработки. Проба может храниться при темпера­туре +4-8°С до 7 дней, в замороженном виде — несколько лет.

Для транспортировки проб биологического материала в лабора­торию используют термоконтейнеры. Пробы в лабораторию достав­ляет персонал, прошедший инструктаж, назначенный ответствен­ным за транспортировку приказом по лечебно-профилактическому учреждению. Не допускается доставка в лабораторию проб биоло­гического материала с гемолизом, хилезом, бактериальным проро­стом, хранившихся дольше установленных сроков.

ПРАВИЛА ВЗЯТИЯ, УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И

ТРАНСПОРТИРОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ВИЧ

МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Для проведения исследования по определению ДНК провируса ВИЧ (качественный тест ПЦР) используют кровь с антикоагулянтом К ₃ ЭДТА. В исследовании по определению вирусной нагрузки ВИЧ может быть использована только плазма.

Взятие крови производится из локтевой вены в вакуумную про­бирку (вакутейнер), содержащую антикоагулянт К₃ЭДТА. После забо­ра пробирка с кровью перемешивается переворачиванием 3-4 раза.

Пробирку маркируют с указанием номера пробы, фамилии обследуе­мого или эпидемиологического номера ВИЧ-инфицированного пациен­та. Дату и время забора крови указывать обязательно. Пробирки с кро­вью перед доставкой в лабораторию хранят при температуре +2-8 0 С.

Биологический материал для определения ДНК провируса ВИЧ достав­ляется в лабораторию не позднее 24 часов с момента взятия крови. Для определения РНК ВИЧ (вирусной нагрузки) биоматериал должен быть доставлен в лабораторию в течение 6 часов с момента взятия крови.

Плазма крови должна быть отобрана не позднее б часов после за­бора крови. Для этого пробирку с кровью необходимо центрифуги­ровать при 3000 оборотов в минуту в течение 20 минут. Затем ото­брать плазму в количестве не менее 1 мл (отдельным наконечником с аэрозольным барьером) в одноразовую стерильную пробирку объ­емом 1,5-2 мл. Микропробирка с плазмой маркируется аналогично пробирке с кровью и хранится при температуре +2-8°С в течение 5 суток, при температуре -70°С — длительно.

Пробы биоматериала в лабораторию доставляет персонал, про­шедший инструктаж, назначенный ответственным за транспорти­ровку приказом по лечебно-профилактическому учреждению.

Транспортирование пробирок с кровью и микропробирок с плаз­мой осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающим элементом, или в термосе со льдом при температуре +2-8°С.

ПРАВИЛА ВЗЯТИЯ, УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И

ТРАНСПОРТИРОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУННОГО

СТАТУСА (ДЛЯ ПРОТОЧНОГО ПИТОМЕТРА)

Необходимо, чтобы образцы крови были правильно взяты и во­время доставлены в лабораторию. Нарушения, допущенные на этом этапе, могут повлиять на результат исследования и его дальнейшую интерпретацию.

Забор крови необходимо осуществлять утром натощак (с момента последнего приема пищи должно пройти не менее 12 часов). В день накануне взятия крови пациенту лучше воздержаться от употребле­ния алкоголя, большого количества пищи, в особенности жирной, а также от чрезмерной физической нагрузки.

Забор крови необходимо осуществлять в положении пациента сидя или лежа. Жгут следует снять сразу же после попадания иглы в вену. Длительность наложения жгута не должна превышать 1 минуты. Взятие крови должно осуществляться до проведения диагностических и лечебных процедур. Необходимо не менее 4 мл крови. При проведении пациенту внутривенных вливаний, пункцию вены для взятия крови необходимо осуществлять па другой руке. При взятии пробы из арте­риальных или венозных катетеров, канюлю следует промыть изотони­ческим солевым раствором (физиологическим раствором), первые 5 мл крови следует выбросить, а затем взять пробу.

Кровь собирается в вакуумную пробирку, содержащую анти­коагулянт. В качестве антикоагулянта лучше всего использовать K₃3DTA (1,5 +/- 0,15 мг на мл крови). Во избежание образования сгустков необходимо хорошо перемешивать кровь с антикоагулян­том. Перемешивание осуществляется путем переворачивания про­бирки не менее 8 раз. Применение миксеров и встряхивание про­бирок недопустимо, так как это приводит к гемолизу и получению неверных результатов. Необходимо соблюдать правильное соотно­шение крови и ант и коагулянта. Недостаточное количество крови или переполнение пробирки может привести к искажению резуль­татов иммунофенотипирования.

На пробирке с образцом должны быть указаны идентифицирую­щие данные пациента и точное время забора крови. В сопроводи­тельных документах должны быть указаны фамилия, имя и отче­ство пациента, возраст, пол, дата и время забора крови.

После забора пробирки с кровью хранят при температуре +18-25°С. Следует избегать замораживания или перегревания образцов, так как нарушение температурного режима может повлиять на ре­зультаты иммунофенотипирования. Образцы крови должны быть доставлены в лабораторию как можно скорее, но не позднее 48 ча­сов после взятия крови.

Пробы биоматериала в лабораторию доставляет персонал, про­шедший инструктаж, назначенный ответственным за транспорти­ровку приказом по лечебно-профилактическому учреждению.

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции используются различные методы обнаружения культуры ВИЧ, ан­тител, антигенов и генного материала ВИЧ. Все эти методы облада­ют различной эффективностью, требуют различного оборудования и разного уровня подготовки.

Выделение и идентификация культуры ВИЧ является достовер­ным признаком инфицирования ВИЧ. Однако этот метод малодо­ступен, требует длительного времени, высокой квалификации ис­полнителей, специального оборудования. Кроме того, он достаточно дорог. Поэтому выделение вируса и его идентификация проводится только в научных целях или в исключительно сложных случаях.

Основные методы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции включают выявление вирусных антигенов и антител к ВИЧ. Стандартным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного анализа. Этот метод очень наде­жен, его чувствительность составляет более 99,5%. Принцип иммуноферментного анализа основан на выявлении комплекса антиген-антитело.

Иммуноферментные тесты, одновременно выявляющие как ан­тиген, так и антитела, имеют высокую чувствительность и выяв­ляют лиц как уже с выраженной инфекцией, так и лиц на ранних стадиях ВИЧ-инфекции.

Хотя тесты, используемые для скрининга, являются чувствительны­ми, у них отсутствует достаточная степень специфичности. Причинами ложноположительного результата ИФА могут быть наличие в сыворот­ке антител к аутоантигенам, болезни печени, онкозаболевания и так далее. Поэтому сыворотки, дающие воспроизводимо положительный результат в ходе скрининга, должны быть проверены с использованием подтверждающего метода (иммунный блот-Western blot).

Быстрые тесты для определения специфических антител к ВИЧ — это тесты, которые можно выполнить менее чем за 30 минут. При правильном исполнении быстрые тесты на антитела к ВИЧ являются точными и имеют широкое применение в целом ряде ситуаций. Об­ласти их применения: трансплантология, эпидемиологический над­зор — обследование труднодоступных групп населения, обследование крови в случае экстренного переливания препаратов крови и отсут­ствия обследованной на антитела к ВИЧ крови, тестирование па ВИЧ (если требуется немедленное начало медикаментозной профилактики ВИЧ в случае аварийной ситуации), тестирование беременных жен­щин с неизвестным ВИЧ-статусом в предродовом периоде.

Иммунный блот (ИБ) — подтверждающий метод для выявления специ­фических антител к различным антигенам ВИЧ 1-го и 2-го типов.

Вирусные антигены ВИЧ-1:

белки ядра (сердцевины) (gag): p55, p24, р17;

ферменты вируса (pol): р66, р51, р31.

Вирусные антигены ВИЧ-2:

структурные белки оболочки (env): gpl40, gp105, gp36;

белки ядра (сердцевины) (gag): р5б, р25, р18;

ферменты вируса (pol) p68.

Результаты, полученные в подтверждающем тесте, интерпрети­руются как положительные, неопределенные и отрицательные.

Положительными (позитивными) считаются пробы, в которых обнаруживаются антитела к 2 или 3 структурным белкам оболочки (гликопротеинам) ВИЧ.

Отрицательными (негативными) считаются сыворотки, в которых не обнаруживается антител ни к одному из антигенов (белков) ВИЧ.

Неопределенными (сомнительными) считаются сыворотки, в ко­торых обнаруживаются антитела к одному гликопротеину ВИЧ и/ или каким-либо протеинам ВИЧ.

При получении положительного результата в подтверждающем тесте (ИВ) делается заключение о наличии в исследуемом материале антител к ВИЧ. При получении отрицательного результата анализа в подтверждающем тесте (ИБ) выдается заключение об отсутствии анти­тел к ВИЧ. При получении неопределенного результата проводятся повторные исследования на антитела к ВИЧ.

Можно использовать дополнительные методы диагностики, такие как определение р24 антигена или ПЦР исследования. Если был выявлен антиген р24 или ДНК/РНК ВИЧ повторное обследование на наличие антител проводится через 2 недели после получения первого неопреде­ленного результата, и в дальнейшем через каждые 2 недели до получения положительного результата в подтверждающем тесте.

Наличие неспецифической реакции не дает основания для по­становки диагноза ВИЧ-инфекции, но доноров, имеющих такой ре­зультат, от донорства необходимо отстранить.

Результаты серологических исследований используются эпиде­миологами и практическими врачами для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, своевременного выявления источника инфекции, скорейше­го проведения противоэпидемических мероприятий и оказания помощи зараженным лицам. На основании только лабораторного анализа диа­гноз не может быть выставлен. Для вынесения диагностического заклю­чения необходимо учитывать данные эпидемиологического анамнеза, иммунологических тестов и результатов клинического обследования.

ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ВИРУСА

Полимеразная цепная реакция — метод, позволяющий опреде­лять специфические (вирусные) нуклеиновые кислоты или их фраг­менты с высокой степенью разрешения. В основе метода лежитмногоцикловои процесс, напоминающий естественную репликацию нуклеиновой кислоты.

Метод ПЦР не заменяет существующие методы диагностики, а дополняет их.

Выявление провирусной ДНК ВИЧ свидетельствует о наличии вируса в организме человека. ПНР позволяет определять генетический материал вируса даже в начальный период заболевания. Это исследование наиболее информативно в случае вертикальной трансмиссии, когда материнские ан­титела в крови ребенка до 18 месяцев присутствуют обязательно, а также у взрослых пациентов в инкубационном периоде. Оно позволяет в более короткие сроки подтвердить наличие или отсутствие ВИЧ-инфекции.