Реферат на тему лабораторная диагностика вич инфекции

Опортунистические заболевания - тяжелые, прогрессирующие болезни, которые развиваются на фоне нарастающей иммуносупрессии и не встречаются у человека с нормально функционирующей иммунной системой (СПИД-индикаторные заболевания).

а) первая группа - это заболевания, которые присущи только тяжелому иммунодефициту (уровень СД4+

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Все инфекционные заболевания нуждаются в своевременной точной диагностике. ВИЧ и СПИД — не исключение. Поставленный вовремя диагноз позволяет принять необходимые терапевтические меры и продлить пациенту жизнь. Как же определить наличие или отсутствие заболевания с максимальной точностью?

Диагностика ВИЧ-инфекции и СПИДа

Сегодня, наверное, каждый человек слышал о ВИЧ и СПИДе и знает, что эти заболевания очень опасны, что передаются они в основном во время незащищенного барьерным способом полового акта. А между тем, первые случаи инфицирования были зафиксированы не так давно — в 1978 году (у нескольких мужчин-гомосексуалов из США и Швеции). Сам вирус был открыт в 1983 году.

В первую очередь ВИЧ атакует и разрушает лимфоциты (Т-лимфоциты, или хелперы). Они отвечают за иммунный ответ организма, распознавание и уничтожение инфицированных клеток. В результате заболевший теряет способность противостоять инфекциям.

У здорового человека количество Т-лейкоцитов составляет 1200–3000 клеток/мкл. После ВИЧ-инфицирования число клеток снижается. При этом заболевший продолжает чувствовать себя нормально. Данный период болезни может длиться на протяжении многих лет. Но наступает момент, кода количество клеток-хелперов достигает критической отметки. Это может проявиться следующими проблемами:

• кандидоз полости рта и ЖКТ;
• опоясывающий лишай (герпес);
• неделями не спадающая высокая температура;
• ночная потливость;
• диарея;
• частые ОРЗ и ОРВИ и др.

Если число Т-лимфоцитов снижается до 200 клеток/мкл, то диагностируют СПИД. Организм больного в таком состоянии не может сопротивляться даже простейшим микроорганизмам — от дрожжей до вирусов. У здорового человека к ним развивается резистентность, тогда как страдающего СПИДом они могут довести до летального исхода. Чаще всего возбудителями смертельных заболеваний становятся токсоплазма, криптоспоридии, цитомегаловирус. Кроме того, снижение лимфоцитов провоцирует образование злокачественных опухолей.

При отсутствии должного лечения пациенты с ВИЧ-инфекцией не переступают порог выживаемости в 10 лет. Грамотно и своевременно назначенная терапия затормаживает развитие болезни, в разы увеличивая продолжительности жизни больного. ВИЧ-положительный человек в таком случае может дожить до преклонных лет.

Основной метод диагностики инфекции — анализ крови. С момента заражения до появления антител в крови проходит 1–3 месяца.

Разные виды лабораторных анализов венозной крови, взятой натощак, позволяют обнаружить наличие или отсутствие ВИЧ-инфекции в крови. Рассмотрим виды этих исследований.

• Скрининговое исследование иммуноферментными (ИФА) методами представляет собой выявление антител к антигенам ВИЧ-типов: ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Уже со второй недели после инфицирования могут появиться антитела, хотя они способны обнаружиться и позже — через несколько месяцев. В последующее время количество антител растет и сохраняется в крови пациента. При наличии антител в большинстве случаев клинические признаки ВИЧ не проявляются 2–10 лет.
  Отметим, что данный тест не всегда точен, возможен ложноположительный результат. В любом случае при положительном результате назначается повторный анализ через 2-3 недели.
• Верификационное исследование методом иммуноблота проводится, если описанный выше анализ дважды дал положительный результат. Данное исследование сочетает анализ ИФА и метод электрофореза, который позволяет разделить по молекулярному весу входящие в состав вируса антигены. Данное исследование имеет максимальную точность.

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени дает возможность определить концентрацию вирусной РНК в плазме крови. Тест проводят в целях ранней диагностики возможного инфицирования после случая повышенного риска (на 7–10 день после предположительного инфицирования).
  Также данный анализ назначается для оценки эффективности применяемой терапии, для решения вопроса о начале антиретровирусной терапии, о проведении кесарева сечения у инфицированных беременных за 4 недели до родов.
  Такое исследование крови проводят новорожденным детям инфицированных матерей. Полученный дважды положительный ответ говорит о заражении ребенка.

Поводом пройти исследование на ВИЧ-инфекцию может стать множество причин. Тест необходим перед оперативным вмешательством, в случае планирования беременности, риск приобретения данной инфекции несут случайные половые контакты. Отдельная категория граждан (врачи, педагоги, работники пищевых производств, продавцы пищевой продукции и др.) обязана проходить тест в рамках оформления медицинской книжки, являющейся обязательным условием допуска к работе.

Что касается тревожных симптомов, то обычно врачи назначают анализ на ВИЧ при следующих состояниях:

• Резкая потеря веса.
• Диарея, длящаяся более трех недель.
• Лихорадка неясного происхождения.
• Увеличение лимфатических узлов в разных областях.
• Лейкопения и лимфопения.
• Тяжелые инфекционные заболевания: пневмония, кандидоз внутренних органов, туберкулез, манифестный токсоплазмоз, частые случаи обострения герпесвирусной инфекции и другие.

Специальной подготовки перед сдачей венозной крови не требуется. Единственное — это воздержание от приема пищи в течение 8–10 часов. Также накануне рекомендуется избегать физических и эмоциональных нагрузок, отказаться от употребления алкоголя.

Вся процедура забора венозной крови занимает не более пяти минут. После взятия материала место укола дезинфицируют и заклеивают специальным пластырем. Так как анализ берется натощак, во избежание головокружения после забора крови следует выпить сладкий чай или съесть кусочек шоколада.

В государственных поликлиниках, чтобы получить направление на анализ, придется сначала посетить участкового терапевта. В частных же медицинских центрах нужно просто заполнить заявку на анализ. Для этого в клинике попросят предъявить паспорт или какой-либо другой документ, удостоверяющий личность (миграционная карта, водительские права, военный билет и т. д.). Документ позволит идентифицировать результаты анализа. Впрочем, тест на ВИЧ можно сделать и анонимно. В этом случае заявке и образцу крови, который отправляется на анализ в лабораторию, присваивается номер, известный лишь пациенту и медицинскому персоналу. Однако результаты анонимных исследований не могут быть представлены для госпитализации, в женские консультации и не могут быть зарегистрированы в ОРУИБ (Отдел регистрации и учета инфекционных болезней).

Следует помнить, что интерпретировать результаты исследования и поставить точный диагноз способен только врач. Полученный результат ни в коем случае не может быть поводом для самолечения, к тому же одни и те же результаты у разных пациентов могут говорить о противоположной клинической картине.

Показывает объем выявленной РНК вируса иммунодефицита человека, выраженный в C/ml (копии/мл). Интерпретировать результаты следует следующим образом:

1. РНК не выявлена, либо значение ниже предела чувствительности метода (20 копий/мл).
2. Меньше 20 копий/мл — РНК выявлена в концентрации на пределе чувствительности метода, характеристика с удовлетворительной точностью невозможна.
3. От 20 до 10 6 копий/мл — полученное значение находится в пределах линейного диапазона, результат достоверен.
4. Больше 10 6 копий/мл — РНК выявлена в указанной концентрации, выходящей за верхний предел линейного диапазона.

Анализы на ВИЧ можно сдать в частных клиниках. В этом случае стоимость скринингового исследования иммуноферментными методами в среднем составит от 400 до 800 рублей. Срок выполнения исследования — один рабочий день, хотя возможна и срочная диагностика, в таком случае ответ будет получен через 2 часа.

Верификационное исследование методом иммуноблота обойдется в 3000–5000 рублей. Результаты станут известны через 3–7 рабочих дней.

Полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени представляет собой более сложный анализ, поэтому его стоимость намного выше — она составляет 10 000–12 000 рублей. Результаты исследования готовятся в среднем 10–14 рабочих дней.

Согласно законодательству все иммунные анализы в государственных медицинских учреждениях проводятся бесплатно. В обязательном порядке проверку на ВИЧ-инфекцию проходят беременные женщины, пациенты, готовящиеся к оперативному вмешательству и госпитализации. В остальных случаях направление на данное исследование назначается по усмотрению врача.

Пройти анализ на ВИЧ-инфекцию сегодня не составляет сложности. Сама процедура практически безболезненна и занимает считанные минуты. Современное оборудование и методики проведения теста позволяют получить максимально точные результаты.

Во­пре­ки не­ко­то­рым мне­ни­ям, ВИЧ не яв­ля­ет­ся при­го­во­ром. Ин­фи­ци­ро­ван­ные лю­ди спо­соб­ны про­жить дол­гую, пол­но­цен­ную жизнь. Они мо­гут иметь семью, де­тей, без опа­се­ний об­щать­ся с окру­жа­ю­щи­ми. Глав­ное при этом вы­пол­нять осо­бые пра­ви­ла ги­ги­е­ны и бы­то­во­го по­ве­де­ния, знать, как свес­ти к ми­ни­му­му риск за­ра­же­ния до­мо­чад­цев. А в слу­чае воз­ник­но­ве­ния со­мни­тель­ных или спор­ных си­ту­а­ций — об­ра­щать­ся к спе­ци­а­лис­там: вра­чам, пси­хо­ло­гам. Но ни в ко­ем слу­чае не за­мы­кать­ся и не ста­вить на жиз­ни крест.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

Диагностика ВИЧ-инфекции включает в себя два этапа: установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией и определение стадии заболевания. За определением стадии неразрывно следует и выяснение характера течения заболевания, а затем и формирование прогноза у данного больного, а также выбор тактики лечения. Как известно, диагностика любого инфекционного заболевания основана на сопоставлении эпидемиологических, клинических и лабораторных данных, и преувеличение значения одной из групп этих данных может привести к диагностическим ошибкам.

Обоснование впервые устанавливаемого клинического диагноза ВИЧ-инфекции При обнаружении подозрительного на ВИЧ-инфекцию пациента производится его первичное обследование, целью которого является подтверждение клинического диагноза ВИЧ-инфекции, установление стадии болезни, выявление имеющихся у больного вторичных и сопутствующих заболеваний для определения тактики дальнейшего ведения. Проведению первичного обследования должно предшествовать консультирование больного по вопросам ВИЧ-инфекции. Целью консультирования является психологическая подготовка пациента к адекватному восприятию диагноза ВИЧ-инфекции и адаптации его к перспективе жизни с ВИЧ-инфекцией. Консультирование проводится специально подготовленным специалистом. После подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции оно проводится специалистом с высшим медицинским образованием, желательно лечащим врачом. При первичном обследовании, помимо осмотра лечащего врача, включающего сбор анамнеза и физикальное обследование, рекомендуется проводить исследование крови на антитела к ВИЧ, если это не было сделано ранее или имеется необходимость уточнения диагноза. Проводится также общий анализ крови (с определением гемоглобина, эритроцитов, тромбоцитов, гематокрита, лейкоцитарной формулы), биохимический анализ крови (билирубин и его фракции, аланиновая аминотрансфераза, аспарагиновая аминотрансфераза, щелочная фосфатаза, лактатдегидрогеназа, амилаза или липаза, глюкоза), общий анализ мочи, кожно-аллергическая проба (туберкулиновая), исследование крови на маркеры вирусных гепатитов В и С, сифилиса, исследование кала на яйца глистов и простейшие, рентгенография органов грудной клетки, УЗИ органов брюшной полости и почек, ЭКГ, осмотр специалистов (дерматолога, гинеколога, невропатолога, оториноларинголога, психиатра, окулиста, стоматолога). При возможности проводится определение количества CD4-лимфоцитов, определение количества РНК вируса в крови (вирусной нагрузки). При впервые устанавливаемом у данного больного клиническом диагнозе ВИЧ-инфекции следует сначала обосновать диагноз ВИЧ-инфекции на основании эпидемиологических, клинических и имеющихся лабораторных данных, затем определить стадию заболевания, указав ее характерные проявления. У детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, диагноз ВИЧ-инфекция (?) (под вопросом) устанавливается на основании эпидемиологических данных (рождение от инфицированной матери). Диагноз ВИЧ-инфекция (?) снимается у такого ребенка в возрасте 18 месяцев при отсутствии обнаружения у него за период наблюдения клинических и лабораторных свидетельств в пользу ВИЧ-инфекции. Диагноз ВИЧ-инфекция у ребенка, родившегося от ВИЧ-инфицированной матери, может быть подтвержден в более ранние сроки в случае, если у него обнаруживаются клинические или лабораторные признаки ВИЧ-инфекции. Примеры На основании эпидемиологического анамнеза (половой контакт с ВИЧ-инфицированным), генерализованной лимфаденопатии, обнаружения антител к белкам ВИЧ (гп 41, 160) можно диагностировать ВИЧ-инфекцию. Учитывая отмеченный в анамнезе повторный опоясывающий лишай, наблюдающуюся в настоящее время лихорадку, длящуюся более месяца, белые налеты на слизистой полости рта, поражения ногтей ног, можно предположить у больного стадию вторичных заболеваний (ЗБ.) Диагноз: ВИЧ-инфекция стадия 3Б. Кандидоз полости рта ?, грибковые поражения ногтей ?. Далее следует наметить план обследования. На основании эпидемиологического анамнеза (парентеральное употребление наркотиков), генерализованной лимфаденопатии, обнаружения антител к белкам ВИЧ (гп 41, 160) диагноз - ВИЧ-инфекция. Учитывая наличие у больного пневмонии неясной этиологии, одышку, напоминающих саркому Капоши элементов на голове и половых органах, длящейся более 2 месяцев лихорадки, можно диагностировать стадию 3В ВИЧ-инфекции. Диагноз: ВИЧ-инфекция, стадия 3В, саркома Капоши ?, пневмоцистная пневмония? Далее следует наметить план обследования. На основании эпидемиологического анамнеза: переливания 3 недели назад крови от ВИЧ-инфицированного донора, наличия лихорадки, сопровождаемой фарингитом и пятнистой сыпью на туловище можно поставить диагноз - ВИЧ-инфекция, стадия 2А. Далее следует наметить план обследования. На основании отсутствия эпидемиологических данных о возможности инфицирования у девочки 12 лет, отсутствии у нее клинических проявлений ВИЧ-инфекции, несмотря на обнаружение антител к протеинам ВИЧ с молекулярным весом 17кд и 24кд, диагноз ВИЧ-инфекции сомнителен. Рекомендуется повторить обследование на антитела к ВИЧ через 3 месяца. На основании отсутствия клинических признаков ВИЧ-инфекции и лабораторных свидетельств в пользу ВИЧ-инфекции у ребенка 2 лет, родившегося от ВИЧ-инфицированной матери, диагноз: ВИЧ-инфекция(?) снимается.

Своевременная диагностика ВИЧ-инфекции позволяет предотвратить осложнения, связанные с поздней стадией ВИЧ-инфекции, снизить риск трансмиссии ВИЧ-инфекции, своевременно назначить ВААРТ, снизить заболеваемость и летальность ВИЧ-инфицированных больных.

Однако ранняя диагностика ВИЧ-инфекции является проблемой во всем мире. Так по данным центра по контролю заболеваемости, Атланта, у 41% ВИЧ- инфицированных больных СПИД развивается в течение 1 года после установления диагноза, что затрудняет предотвращение неблагоприятных исходов. Все диагностические тесты на ВИЧ можно условно разделить на 2 группы:

1. Тесты, позволяющие установить факт инфицирования ВИЧ

2. Тесты, позволяющие контролировать течение (мониторинг) ВИЧ-инфекции у инфицированного человека (установить стадию ВИЧ-инфекции, определить показания к началу терапии, оценить эффективность терапии).

3. Установление факта инфицированности ВИЧ.

1. Серологические тесты:

* определение антител к ВИЧ (ИФА, иммуноблот)

* определение антигена Р24

2. Молекулярно-генетические тесты:

* Определение РНК вируса

* Определение ДНК провируса

Прямые тесты на ВИЧ. Диагноз ВИЧ-инфекции можно поставить не только на основании косвенных признаков (наличия антител к ВИЧ), но и на основании прямых доказательств присутствия вируса. К прямым тестам относят:

* Выделение вируса в культуре клеток -- исследование, которое приберегают для особых случаев: оно требует специального оборудования и подготовки; в клинической практике не используется.

* Тест на антиген р24 (скрининг-тесты четвертого поколения помимо антител к ВИЧ выявляют и антиген р24);

* Вирусные нуклеиновые кислоты (то есть генетический материал ВИЧ) провирусную кДНК в лейкоцитах, вирусную РНК.

В связи с возможностью получения ложнопозитивных и ложнонегативных результатов при серологическом тестировании на ВИЧ у части обследуемых применяются молекулярно-генетические методы тестирования - определение вирусной РНК или провирусной ДНК ВИЧ методом ПЦР.

Пациенты, которым проводится диагностика ВИЧ с использованием ПЦР:

* больные с агаммаглобулинемией

* острая ретровирусная инфекция

* Доноры, иностранные граждане, лица с клиническими симптомами заболеваний (лихорадка, лимфаденопатия, потеря массы тела, рецидивы пневмоний, серозный менингит неустановленной этиологии, энцефалит неустановленной этиологии, нейропатии, слабоумие и др.). Больные с подозрением или подтвержденным диагнозом (рецидивы бактериальных инфекций, кандидоз, криптококкоз, туберкулез, сепсис, саркома, мононуклеоз, образования головного мозга, лимфомы и др.). Новорожденные с задержкой развития, аномалии, маловесные, масса менее 2500. Больные парентеральными гепатитами, беременные, реципиенты препаратов крови, жидкостей, дети, рожденные ВИЧ-инфицированными, дети на гособеспечении, лица с ИППП, наркоманы, пенитенциарная система, наличие эпидпоказаний, анонимно.

Исследования, позволяющие осуществлять мониторинг ВИЧ-инфекции:

1. Определение уровня лимфоцитов CD4+B сыворотке крови (иммунограмма методом моноклональных антител)

2. Определение вирусной нагрузки ВИЧ в крови инфицированного (ПЦР)

3. Определение мутаций резистентности ВИЧ к антиретровирусным препаратам (ПЦР, генетический анализ ВИЧ).

Данный метод позволяет определить состояние иммунной системы инфицированного человека. Уровень СD4+лимфацитов является одним из важнейших лабораторных показателей для решения вопроса о назначении ВААРТ и для оценки эффективности проводимой терапии. Нормальные диапазоны уровня СD4+лимфоцитов у взрослых находятся в пределах 500-1400 в 1 мкл. В случае отсутствия возможности определения показателя СD4+лимфоцитов (исследования являются дорогостоящими и требуют специально оборудованной лаборатории) при решении вопроса о назначении APT допустимо ориентироваться на абсолютное количество лимфоцитов в общем анализе крови. Показанием к назначению ВААРТ является абсолютное количество лимфоцитов менее 1,0х 10 /л.

Определение вирусной нагрузки (ВГ) ВИЧ в крови инфицированного (ПЦР). Исследование так называемой вирусной нагрузки сегодня в клинической практике незаменимо: оно позволяет как оценивать прогноз, так и следить за эффективностью лечения. Знание исходного (до начала ВААРТ) уровня ВН пациента является дополнительным критерием начала ВААРТ. Считается, что уровень ВН выше 100 000 копий/мл -- пороговый уровень для старта терапии у взрослых и детей старше 1 года жизни. Мониторинг ВН на фоне ВААРТ является критерием эффективности терапии. Так, при эффективной терапии уровень ВН должен снижаться и достигать неопределяемого уровня (менее 50 копий/мл).

2.2 Техника выполнения методов диагностики

Наиболее часто на практике используются три варианта твердофазного иммуноанализа - непрямой иммуноанализ, прямой иммуноанализ и иммуноанализ сэндвич-типа. Различия между этими типами иммуноанализа заключаются в следующем. В непрямом варианте иммуноанализа на первой стадии на поверхность лунок полистирольного планшета сорбируется антиген. После удаления несвязавшихся молекул антигена добавляется образец, содержащий специфичные к данному антигену антитела. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело детектируются с помощью антивидовых антител, конъюгированных с какой-либо меткой (Рис. 1А). В прямом варианте иммунанализадетекция сорбированного антигена осуществляется непосредственно с помощью специфичных антител, конъюгированных с меткой (Рис. 1Б). В иммуноанализесэндвич-типа на первой стадии на поверхность планшета сорбируется не антиген, а антитела, специфичные к исследуемому антигену (антитела подложки). После удаления не связавшихся молекул антител добавляется образец, содержащий антиген. Для детекции образовавшегося комплекса антитела подложки-антиген добавляются вторые антитела, специфичные к другому, пространственно удаленному, эпитопу антигена, конъюгированные с какой-либо меткой. Использование в иммуноанализе сэндвич-типа антител, специфичных к двум различным эпитопам антигена, позволяет добиться высокой чувствительности и специфичности при определении антигена даже в таких гетерогенных образцах, как плазма крови (рис. 2). Непрямой иммуноферментный анализ (indirect ELISA). Метод непрямого иммуноаналза характеризуется осуществлением 3-х стадийного процесса, на первой стадии которого антиген адсорбируется на специально подготовленном пластике, на второй с антигеном взаимодействуют специфичные к нему антитела, а на третьей в систему вводят антивидовые антитела, конъюгированные с ферментом, обуславливающим проведение индикаторной ферментативной реакции. В данной методике в качестве фермента используют пероксидазу хрена. Реакция проводится в специальных 96-луночных планшетах.

1. Сорбция антигена

В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антиген 0,1-0,5 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) не связавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0.1% Tween-20 (PBSТ).

Для блокирования мест неспецифического связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре. 3. Раститровка специфических антител

Раститровку можно проводить как по горизонтальным, так и по вертикальным рядам планшета. Необходимо отметить, что раститровка антител проводится в том случае, если необходимо подобрать оптимальную концентрацию антител или определить титр. В том случае, если оптимальная концентрация и/или титр антител определены, то используют рекомендованное для данных конкретных антител разведение. При раститровке в первую лунку ряда вносят готовое разведение антител - в среднем 1-10 мкг в лунку, далее проводят последовательное разведение антител в лунках. Инкубацию со специфическими антителами проводят в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 3 раза. 4. Добавление антивидовых антител, конъюгированных с ферментной меткой

В качестве детекторных (вторичных) антител используются антивидовые поликлональные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Чаще всего используются козьи или кроличьи антитела, специфичные к целой молекуле или к Fc-фрагментам специфических антител. Концентрация детекторных антител как правило указывается производителем в виде разведения исходного раствора (например, 1:1000). Инкубация со вторичными антителами проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз. Пероксидаза хрена катализирует реакцию окисления субстрата перекисью водорода. В качестве субстрата пероксидазы хрена используется о-фенилендиамин (ОФД). В результате прохождения реакции образуется окрашенный продукт окисления ОФД. Раствор субстрата: К 10 мл субстратного буфера (0.1 М Na-цитратный буфер, рН 4.5) добавить 0.01 мл 30% перекиси водорода и 0.2 мл 50-х раствора ОФД (340 мг ОФД в 10 мл этилового спирта; хранить при -20С). Инкубация проводится в течение 10 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

5. Остановка ферментативной реакции

Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 0.5 М Н2SО4.В лунки с рабочим раствором ОФД после инкубации вносят по 50 мкл раствора 0.5 М серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.

6. Измерение оптической плотности

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при л=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.

Прямой иммуноферментный анализ:

Методика прямого иммуноанализа имеет лишь небольшие отличия по сравнению с методикой непрямого иммуноанализа. Так, стадии 1 и 2 одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте иммуноанализа на стадии 3 используют специфические антитела, конъюгированные с ферментной меткой. При необходимости также можно проводить раститровку специфических антител, конъюгированных с ферментной меткой, аналогично описанному ранее для неконъюгированных антител. Стадия 4 опускается, а дальнейшие стадии (5-7) проводятся аналогично описанному выше для непрямого варианта иммуноанализа.

В данном варианте иммуноанализа используется пара антител, специфичных к пространственно удаленнымэпитопам исследуемого антигена. 1. Сорбция антител подложки

В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антитела подложки 1-2 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0.1% Tween-20 (PBSТ).

Для блокирования мест неспецифического связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.

3. Инкубация с антигеном

В лунки планшета с преадсорбироваными антителами вносят по 50 мкл исследуемого раствора либо стандартных разведений антигена. Разведения антигена должны быть приготовлены на основе PBST, поскольку Tween-20 снижает неспецифическое связывание белковых молекул друг с другом и с поверхностью планшета. И исследуемый раствор, и стандартные разведения антигена вносят попарно (либо по 3 повторности), используя по две (три) лунки на каждое разведение белка. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании.

Отмывка осуществляется раствором PBST 3 раза.

4. Инкубация с антителами, конъюгированными с ферментной меткой

В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора специфических антител, конъюгированных с ферментной меткой. Оптимальная концентрация конъюгированных антител как правило указывается производителем (обычно используют концентрацию 2-4 мкг/мл). Инкубация с антителами, содержащими ферментную метку, проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.

5. Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта

В лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании. 6. Остановка ферментативной реакции

Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 0.5 М Н2SО4.В лунки с рабочим раствором ОФД после инкубации вносят по 50 мкл раствора 0.5 М серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.

7. Измерение оптической плотности

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при л=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.

Общий объем реакции - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл. Проводится в ЗОНЕ 2 - комнате для подготовки и проведения ПЦР-амплификации.

4. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема (5-40 мкл, 40-200 мкл).

6. Одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 мл или 0,2 мл.

7. Одноразовые наконечники до 100 мкл с фильтрами в штативах для автоматических пипеток с переменным объемом.

8. Отдельный халат и одноразовые перчатки.

9. Емкость для сброса наконечников.

10. Холодильник на 2- 8 °С; морозильник на минус 20 °С для хранения выделенной ДНК.