Анализ чувствительность стафилококка к антибиотикам

Антибиотик	Пенициллин	Стрептомицин	Левомицетин	Тетрациклин
Диаметр зоны задержки роста (в миллиметрах)

2.а) Метод дисков. Бумажные диски, пропитанные определенными антибиотиками, поме­щают на газон исследуемой бактериальной культуры в чашке Петри, По­севы инкубируют в течение 16-24 часов, после чего учитывают результаты опыта по образованию зон задержки роста бактерий.

По диаметру зон задержки роста ориентировочно судят о степени чувствительности бактерий к антибиотикам (рис. 2). Зона задержки роста до 15 мм указывает на слабую, до 25 мм - на среднюю и свыше 25 мм - на вы­сокую чувствительность. Более точные результаты получают при исполь­зовании метода серийных разведений.

б)Метод серийных разведений.Этот метод позволяет определить минимальную задерживающую концентрацию антибиотика для данного микроорганизма (МЗК) как на жидких, так и на плотных питательных средах.

МПБ разливают по 2 мл в серию пробирок. Готовят основной раствор антибиотика, для чего берут навеску антибиотика и растворяют в дис­тиллированной воде из расчета 1 мг антибиотика на мл растворителя.

Левомицетин предварительно растворяют в 96° этиловом спирте из расчета 0,25 мл спирта на 1 мг антибиотика; после полного растворе­ния добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы раствор содержал в 1 мл 1 мг антибиотика.

Тетрациклин и окситетрациклин растворяют в сантинормальном раст­воре соляной кислоты из расчета 1 мл на 1 мг антибиотика.

Эритромицин сначала растворяют в чистом метиловом спирте из расчета 1 мл на 10 мг эритромицина. После растворения добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы получить раствор, содержа­щий в 1 мл 1 мг антибиотика.

Исходный раствор антибиотика в количестве 2 мл вносят в первую пробирку с МПБ, перемешивают и получают определенную его концентра­цию.

Из первой пробирки 2 мл разведенного антибиотика переносят во вторую пробирку и после перемешивания переносят 2 мл в третью пробирку и т.д. до предпоследней, откуда 2 мл выливают. Последняя пробирка является контролем, в ней нет антибиотика и она свидетельству­ет о пригодности среды для роста культуры.

После разведения антибиотика во все пробирки вносят по 0,1 мл испытуемой бульонной культуры. Для этого используют 3-4-часовые или 18-часовые культуры, разведенные МПБ в 50 раз.

Пробирки помещают в термостат на 12-18 часов, но предваритель­ные результаты можно учитывать через 6-8 часов.

По истечении необходимого срока инкубации определяют максималь­ное разведение антибиотика, которое еще подавляет рост культуры. Концентрация антибиотика в последней пробирке с видимой задержкой роста и представляет собой минимальную задерживающую концентрацию антибиотика (МЗК) или минимальной подавляющей концентрацией (МПК).

Штамм считается чувствительным к антибиотикам, если МЗК препа­рата для данного штамма соответствует концентрации этого препарата, создаваемой в организме. Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл (рис. 1).

Минимальная подавляющая концентрация (МПК) - наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий

Рис. 1. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде.

в) Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (рис. 3). В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).

Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.

Контрольные вопросы

В чем сущность определения чувствительности бактерий к антибиотикам?

Какие методы используются для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам?

В чем заключается метод дисков?

Как учитывается чувствительность к антибиотикам методом дисков?

Что позволяет определить метод серийных разведений?

Что означает минимальная подавляющая концентрация?

В чем заключаются преимущества и недостатки Е-теста?

Какие существуют особенности механизма действия антибиотиков?

Какие типы лекарственной устойчивости вы знаете?

Что такое антибиотикорезистентность и механизмы ее формирования?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 13.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Микробиологическое исследование, позволяющее выявить инфицированность золотистым стафилококком и определить количество возбудителя.
Золотистые стафилококки (Staphylococcus aureus) – грамположительные условно-патогенные бактерии рода Staphylococcus, являющиеся наиболее частой причиной стафилококковых, в частности внутрибольничных, инфекций. Золотистые стафилококки в норме могут располагаться на коже, слизистой оболочке носа и реже в гортани, влагалище, кишечнике. Они встречаются у 30 % здоровых людей.
Если у человека слабая иммунная система или нарушен нормальный состав микрофлоры, то при повреждении кожи (слизистых оболочек) золотистый стафилококк может приводить к разнообразным местным и системным инфекционно-воспалительным поражениям:

• кожи (карбункулам, импетиго, фолликулиту),
• молочных желез (маститу),
• дыхательных путей и ЛОР-органов (тонзиллиту, гаймориту, отиту, фарингиту, лариноготрахеиту, пневмонии),
• мочевыводящих путей (уретриту, циститу, пиелонефриту),
• пищеварительной системы (энтеритоколиту, аппендициту, перитониту, парапроктиту, холециститу),
• костно-суставной системы (остеомиелиту, артриту).

В отдельных случаях возможна генерализация инфекции с развитием септикопиемии. Производимый золотистым стафилококком энтеротоксин вызывает пищевые отравления и синдром токсического шока. Основные источники инфекции: здоровые (носители) и больные люди, домашние и сельскохозяйственные животные, а также пища, содержащая возбудителя инфекции (чаще всего это сахаросодержащие молочные продукты). Инфицирование может происходить контактным и воздушно-пылевым путем. Возможно аутоинфицирование.
Для идентификации золотистого стафилококка проводится посев клинического материала на питательные среды, где при наличии S. aureus через 18-24 часа наблюдается рост колоний золотистого цвета.
Определение количества бактерий может потребоваться, например, чтобы понять, нужно ли проводить лечение: в некоторых случаях, если количество небольшое, лечение не проводится. Решение о его необходимости зависит от клинических проявлений, а также от количества стафилококка. При небольшом содержании микробов и отсутствии симптоматики лечение может вообще не понадобиться, т. к. и в норме на слизистой могут находиться эти микробы. Стафилококк в кишечнике обнаруживается постоянно, это не повод для лечения, но если его количество превышено, тогда нужны меры (бактерия может вызывать колики и расстройства). Стафилококк в мазке без симптомов вагинита также является нормой, в то время как большие количества стафилококка в мазке, наряду с повышением лейкоцитов, требуют лечения.
Наличие стафилококка не обязательно означает инфекцию, это может быть бессимптомное носительство, например при посеве мазков из носа и зева носительством считается количество бактерий до 103. Однако более высокие показатели говорят нам о золотистом стафилококке как о причине заболевания, и это уже далеко не бессимптомное носительство.
Многое зависит от возраста пациента. Например, золотистый стафилококк в количестве 104 является вполне нормальным показателем для детей старше 1 года, но у грудных детей в таком количестве уже потребует лечения.
В любом случае наличие стафилококка при отсутствии симптомов болезни – еще не повод к назначению лекарств.
Количество стафилококка может определяться до и после лечения. Если выясняется, что рост возбудителя обильный, значит, инфекция набирает обороты, предыдущая терапия была неудачной и срочно требуется новый курс лечения; умеренный и скудный рост микроорганизмов по результатам последних анализов говорит об успешности терапии. Кроме того, в дальнейшем необходимо контролировать количество стафилококков в течение 1 или 2 месяцев после пройденного лечения.
Отмечено также, что после пребывания больных в хирургической клинике стафилококк обнаруживался у них вдвое чаще, чем при поступлении. У больных, поступающих в стационары, наблюдается замена антибиотикочувствительных стафилококков на антибиотикоустойчивые.
Лечение больных стафилококковой болезнью препаратами пенициллина или другими давно применяемыми антибиотиками часто остаётся безрезультатным, поскольку такие препараты нередко только усугубляют тяжесть течения инфекции. Поэтому так важно установить, какие антибиотики будут эффективны при лечении стафилококка.

• Для определения целесообразности лечения.
• Для дифференциации бактерионосительства и опасного инфицирования.
• Для контроля за состоянием пациента после проведенного лечения.
• Для того чтобы подтвердить, что стафилококк является причиной возникшего заболевания (об этом свидетельствуют высокие показатели посева).

Что означают результаты?
Референсные значения: нет роста.
Золотистый стафилококк в мазке в небольших количествах является частью нор¬мальной микрофлоры человека. Значительное повышение стафилококка в мазке может быть симптомом воспалительного процесса, кожных инфекций (угри и пр.) и смертельно опасных заболеваний (пневмония, остеомиелит, эндокардит и др.). Результат посева интерпретирует врач исходя из того, в каком количестве выделены микроорганизмы. Также прилагается заключение о чувствительности стафилококка к различным антибиотикам, в зависимости от которого назначается лечение теми или иными препаратами.

Стафилококки относятся к группе условно-патогенных бактерий. Это микроорганизмы, которые присутствуют на коже и слизистых оболочках и на общем благоприятном фоне не оказывают негативного воздействия на организм — до тех пор, пока в порядке иммунитет. Как только происходит сбой, бактерии начинают атаковать. Чтобы выявить конкретный штамм стафилококка, ставший причиной воспалительного процесса, и его чувствительность к антибиотикам, важно знать, какие именно анализы вам потребуется сдать.

Врач назначил анализ на стафилококк: почему?

Стафилококки — это малоподвижные округлые бактерии, внешне напоминающие виноградные грозди. Их обнаружили еще 150 лет назад. Французский биолог Луи Пастер доказал взаимосвязь стафилококка и гнойного воспаления. Современным микробиологам известно около 20-ти типов бактерий этой группы, большинство из которых не наносят вреда здоровью. Существуют штаммы, опасные только для животных. Есть те, которые вызывают патологические реакции и у животных, и у человека. Наиболее часто гнойно-воспалительные процессы провоцируют S.aureus, S.saprophiticus и S.epidermidis . При ослаблении защитных сил организма они вызывают заболевания, общую совокупность которых называют стафилококковой инфекцией. Возникает она и в случаях, когда бактерии попадают в те органы, где их быть не должно.

Стафилококки обладают биохимической активностью. Они вырабатывают токсины, которые оказывают сильное воздействие на системы органов и тканей. Сложность профилактики и лечения обусловлена высокой устойчивостью бактерии к антибиотикам и факторам внешней среды. Микроорганизмы не боятся солнечных лучей, активно размножаются на воздухе, живут в воде и пищевых продуктах, полгода способны храниться в замороженном или высушенном состоянии, не погибают под воздействием спирта, хлорида натрия, перекиси водорода.

Путей заражения стафилококком несколько. Основные из них:

• Контактный. Факторы передачи — одежда, предметы обихода и гигиены, постельное белье, домашняя пыль, перевязочные материалы.
• Воздушно-капельный. Распространение происходит через воздух. Возможный фактор передачи — при вдыхании кондиционированного воздуха или воздуха, прошедшего по системе вентиляции.
• Пищевой. Стафилококк активно размножается в несвежих продуктах: молоке, кефире, консервах, сладостях и т.д.
• Парентеральный — через биологические жидкости: кровь, слюну, слезную жидкость, грудное молоко.

Человек часто не подозревает о наличии у него стафилококка и невольно становится разносчиком. Особенно это опасно, если по долгу службы ему приходится работать с большими группами людей. Речь идет о таких профессиях, как школьные учителя, продавцы, раздатчики готовых блюд в общепите, медицинские работники. Последние, впрочем, регулярно проходят обследование. Для остальных факт носительства может оставаться неизвестным на протяжении многих лет. Врачи условно выделяют группы лиц, которые в большей степени подвержены воздействию стафилококка. Среди них онкобольные, пациенты с диабетом, дети и пожилые люди, больные с открытыми ранами, травмами и ожогами, кормящие матери, военнослужащие, заключенные, работники образовательных и лечебных учреждений.

Симптомы, которые указывают на инфекцию, крайне разнообразны, сразу обнаружить истинную причину проблемы удается далеко не всегда. Между тем развивается она стремительно, переходя из одной стадии в другую. Стафилококковой инфекции в целом присущи симптомы интоксикации:

• подъем температуры тела;
• снижение аппетита;
• сонливость;
• слабость.

Болезнь имеет и местные проявления в зависимости от того, в какой части организма локализован процесс.

• кожа : гнойнички, фурункулы, абсцессы, воспаление пупка у новорожденных;
• кости и суставы : покраснения кожи, боли в руках и ногах при движении и надавливании;
• дыхательные пути : налет на миндалинах, боль в горле, насморк, сухой кашель, покраснение;
• оболочки сердца : резкий подъем температуры, шумы;
• ЖКТ : боли в животе, вздутие, жидкий стул, тошнота, рвота.
• мочеполовая система : частое и болезненное мочеиспускание, боль в спине.

Именно стафилококк в 95% случаев становится причиной остеомиелита — воспаления костного мозга с разрушением костных слоев. Если поражение переходит на суставы, возникает артрит. При попадании стафилококка к сердцу разрушается сердечный клапан, что влечет за собой закупорку периферических артерий, абсцесс миокарда, сердечную недостаточность. При поражении стафилококком головного мозга развивается абсцесс (образование гнойной полости), возникает менингит. Бактерии в дыхательной системе провоцируют воспаление легких и плевры. Существует понятие стафилококкового сепсиса — это состояние, для которого характерно поражение всех органов и систем. Оно требует неотложной помощи и несет прямую угрозу жизни. Все эти осложнения плохо поддаются терапии, часто оставляют последствия на всю жизнь или приводят к инвалидности.

Клиническая картина стафилококковой инфекции обширна. Симптомы часто схожи с признаками других заболеваний, не связанных с бактериальным заражением. Тем не менее в совокупности проявлений грамотный специалист способен заподозрить стафилококк, диагностировать наличие которого можно лишь лабораторно. Отсюда — важность своевременного и качественного анализа на стафилококк. Часто анализ является обязательным перед госпитализацией больного в стационар либо при наличии в больнице инфекции.

Выписать направление может терапевт, педиатр, врач общей практики, инфекционист или лор. В результате исследования определяют тип бактерии и степень устойчивости к антимикробным препаратам.

В числе известных медицине видов стафилококка чаще всего речь идет о трех из них:

• Золотистый стафилококк . Он вызывает инфекции у взрослых и детей практически в любом органе и участке тела, затрагивает слизистые оболочки, кожу и даже нервную ткань.
• Эпидермальный стафилококк. Наиболее опасен для людей с ослабленным иммунитетом, для больных с онкологией и ВИЧ, а также для недоношенных детей.
• Сапрофитный стафилококк. Провоцирует заболевания мочеполовой системы, встречается, как правило, у женщин.

В каждой группе несколько разновидностей. В зависимости от штамма, бактерии поражают те или иные органы. Решение о том, какие анализы на стафилококк сдавать пациенту, принимает только квалифицированный специалист, ориентируясь на жалобы и общую картину заболевания. Для диагностики в лаборатории проводят микробиологическое исследование биоматериала. Для анализа берут кровь, кал, мочу, мокроту, грудное молоко, жидкости из раны или уха и различные виды мазков: ректальный, урогенитальный, из носоглотки и полости рта. У каждой процедуры — свои особенности проведения, которые напрямую влияют на результаты. Для того чтобы исследование оказалось достоверным, к сдаче анализов на стафилококк необходимо подготовиться.

Анализ на золотистый и другие виды стафилококка проводят до начала антибактериальной терапии. Если она назначена по другому поводу, пациенту следует отказаться от приема антибиотиков (после консультации с врачом), чтобы не допустить ложноотрицательного результата исследования на стафилококк. За 48 часов, также по согласованию, прекращают прием мочегонных препаратов. В числе других рекомендаций:

• за 12 часов до исследования мокроты выпить максимально возможное количество воды, чтобы мокрота легко отхаркивалась и не была вязкой;
• не ходить в туалет за 3–4 часа до анализа мочи или урогенитального мазка;
• женщинам — не сдавать анализ мочи и урогенитальный мазок во время менструации и 2 дня до/после;
• при анализе кала — за 3 дня прекратить использование ректальных свечей, слабительных препаратов и средств, влияющих на перистальтику кишечника и окраску каловых масс. К числу таких препаратов относят пилокарпин, белладонну, сернокислый барий, висмут, железо.

Помимо подготовительных мероприятий, крайне важен правильный забор материала для анализа. Необходимо использовать специальные контейнеры, пробирки, тампоны и другие атрибуты лабораторного исследования. В некоторых случаях пациенту предоставляют право собрать материал в домашних условиях, обращая внимание на необходимость точного следования инструкции.

Самостоятельно собранный биоматериал у пациентов принимают, когда речь идет об анализе кала на стафилококк, исследованиях мочи и грудного молока. Общее правило: для сбора используют стерильную тару (пластиковый одноразовый контейнер с винтовой крышкой), которую доставляют в лабораторию максимально быстро. Современные медицинские центры при подготовке к исследованию выдают пациентам подробную инструкцию, как правильно собрать материал.

Требования к сбору кала для анализа на стафилококк:

• каловые массы должны быть естественными, не допускается применение слабительных препаратов;
• собирать кал на чистую поверхность (лист бумаги или полиэтилен). Не рекомендован сбор из унитаза;
• судно промыть с мылом под проточной водой, ошпарить кипятком и высушить;
• для забора использовать специальную ложечку. Контейнер достаточно наполнить на 1/3.

Требования к сбору грудного молока:

• перед сцеживанием вымыть руки с мылом. Область сосков обработать 70%-ным спиртом. Для каждой железы — отдельный тампон;
• первые 5–10 мл сцедить в отдельную посуду — они не подходят для анализа. Дальше сцеживают молоко в контейнер, не касаясь стенок руками или грудью;
• молоко из разных желез поместить в разные контейнеры.

Требования к сбору мочи:

• наружные половые органы следует предварительно ополоснуть водой. Женщинам — использовать 4 ватных шарика, смоченных в мыльном растворе, каждым проводя только один раз.
• первую струю мочи для анализа не использовать. В процессе сбора не прикасаться контейнером к телу. Емкость следует наполнять до середины.

Прочие виды анализов проводят непосредственно в лаборатории. Для определения стафилококка часто исследуют ротовую полость и носоглотку. Анализ из зева на стафилококк проводят при помощи мазка. Его берут натощак или через 3 часа после еды. Язык аккуратно прижимают шпателем, стерильным тампоном проводят между дужками миндалин по язычку и задней стенке глотки, не затрагивая губы и щеки. Затем тампон погружают в транспортную среду и отправляют в лабораторию. Аналогичны действия врача и при заборе материала для анализа из носа на стафилококк. Тампон вводят в носовой ход на глубину 2–3 см на уровне носовой раковины, прижимают к перегородке и несколько раз вращают.

Перед мазком не следует предварительно промывать рот или носоглотку. Если на слизистых оболочках имеются гнойники и язвенные образования, материал берут с области на стыке зараженной и здоровой ткани, поскольку там концентрируется наибольшее количество бактерий. Далее в лабораторных условиях производят посев. Частичку слизи переносят на подготовленную среду, в которой микробы быстро размножаются и образуют колонии. Это позволяет врачам определить разновидность бактерий, а также установить чувствительность к антибактериальным препаратам, что является решающим фактором при назначении лечения.

Бактериологический посев занимает в среднем 7 дней. В результатах анализов представлены данные о наличии или отсутствии роста бактерий. Отрицательный результат говорит об отсутствии стафилококковой инфекции. Положительный — о ее наличии или бессимптомном носительстве. В норме золотистого стафилококка ( S. aureus ) у человека быть не должно. Сапрофитный и эпидермальный могут присутствовать до определенных отметок. К примеру, количество бактерий при анализе кала на стафилококк у детей не должно превышать 10 4 степени КОЕ/г.

Итоговый диагноз пациенту ставят на основании общей картины заболевания, совокупности симптомов и положительного анализа на стафилококк. Недооценивать важность своевременной диагностики нельзя. Инфекция способна быстро распространяться, создавая необратимые проблемы для здоровья. Кроме того, с каждым годом растет число штаммов, имеющих устойчивость к препаратам, которые еще недавно использовали для лечения, поэтому при каждом новом симптоме анализы необходимо сдавать заново.

Для опре­де­ле­ния ста­фи­ло­кок­ко­вой ин­фек­ции, в за­ви­си­мос­ти от пред­по­ла­га­е­мых мест ее ло­ка­ли­за­ции, мо­гут по­тре­бо­вать­ся раз­лич­ные био­ма­те­ри­а­лы — кровь, слизь из но­со­глот­ки или по­ло­вых ор­га­нов, мо­ча, кал. Не­за­ви­си­мо от то­го, ка­кое кон­крет­но ла­бо­ра­тор­ное ис­сле­до­ва­ние вам на­зна­чи­ли, во из­бе­жа­ние лож­ных или не­точ­ных ре­зуль­та­тов, сле­ду­ет со всей от­вет­ст­вен­ностью от­нес­тись к про­цес­су под­го­тов­ки и сда­чи био­ма­те­ри­а­ла на ана­лиз, за­про­сив ин­струк­цию в ла­бо­ра­то­рии.

При оценке чувствительности Staphylococcus spp. в первую очередь необходимо тестировать препараты, имеющие основное клиническое значение: бета-лактамы, макролиды, фторхинолоны, аминогликозиды и ванкомицин.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности Staphylococcus spp. (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 14.

Таблица 14.

Бета-лактамы

Препаратами выбора для лечения стафилококковых инфекций (вызванных как Staphylococcus aureus, так и коагулазанегативными стафилококками) являются бета-лактамные антибиотики, следовательно, в первую очередь необходимо определять чувствительность стафилококков к этим препаратам.

Устойчивость стафилококков к бета-лактамным АБП связана либо с продукцией бета-лактамаз, либо с наличием дополнительного пенициллино-связывающего белка - ПСБ2а. Выявление и дифференцировка этих двух механизмов резистентности позволяет надежно прогнозировать активность всех бета-лактамных антибиотиков без непосредственной оценки чувствительности к каждому из этих препаратов. При этом необходимо учитывать следующие закономерности:

• Штаммы Staphylococcus spp., лишенные механизмов резистентности, чувствительны ко всем бета-лактамным АБП.
• Бета-лактамазы (пенициллиназы) Staphylococcus spp. способны гидролизовать природные и полусинтетические пенициллины за исключением оксациллина и метициллина. Чувствительность или резистентность к бензилпенициллину является индикатором активности природных и полусинтетических амино-, карбокси- и уреидопенициллинов. Остальные бета-лактамы с потенциальной антистафилококковой активностью (антистафилококковые пенициллины, цефалоспорины I, II и IV поколений и карбапенемы) сохраняют активность в отношении бета-лактамазпродуцирующих штаммов.
• Штаммы Staphylococcus spp, обладающие ПСБ2а, клинически устойчивы ко всем бета-лактамным АБП. Маркером наличия ПСБ2а является устойчивость к оксациллину и метициллину. Такие штаммы исторически получили название метициллинорезистентных стафилококков (methicillin-resistant Staphylococcus spp -MRSS). Другими терминами для обозначения подобных штаммов являются MRSA - methicillin-resistant S.aureus и MRSE - methicillin-resistant S.epidermidis.
• Метициллин в настоящее время в клинической практике и в лабораторной диагностике не применяется, его практически полностью вытеснил оксациллин, соответственно появился термин "оксациллинорезистентность", являющийся полным синонимом термина "метициллинорезистентность".

Таким образом, определение чувствительности Staphylococcus spp. к бета-лактамным АБП должно включать выполнение двух тестов:

• Определения чувствительности к бензилпенициллину или выявления продукции бета-лактамаз (пенициллиназ).
• Определения чувствительности к оксациллину или выявления ПСБ2а или кодирующего его гена mecA.

Определение чувствительности к бензилпенициллину или выявление продукции бета-лактамаз (пенициллиназ)

Определение чувствительности Staphylococcus spp. к бензилпенициллину несколько затруднено тем фактом, что синтез бета-лактамаз у этого микроорганизма является индуцибельным процессом (продукция фермента усиливается после контакта с антибиотиком). В результате этого при использовании стандартных методов серийных разведений и ДДМ возможно получение результатов ложной чувствительности.

Решением данной проблемы может быть использование метода непосредственного выявления бета-лактамаз, основанного на использовании дисков с нитроцефином. Нитроцефин представляет собой хромогенный цефалоспорин, который легко гидролизуется под действием всех бета-лактамаз с образованием окрашенного продукта.

Для проведения исследования используют чашку, на которой оценивали чувствительноcть исследуемого штамма Staphylococcus spp. к пенициллину и/или оксациллину ДДМ. С границы зоны ингибиции роста вокруг диска с оксациллином бактериологической петлей забирается незначительное количество культуры и наносится на предварительно увлажненный диск с нитроцефином. Диск инкубируют при комнатной температуре до 1 ч.

Появление красного окрашивания свидетельствует о продукции бета-лактамаз исследуемым штаммом микроорганизма.

Штамм, продуцирующий бета-лактамазу, рассматривают как устойчивый к природным и полусинтетическим пенициллинам (за исключением оксациллина) независимо от конкретных результатов тестирования к перечисленным АБП.

При определении чувствительности к оксациллину стандартными методами необходимо учитывать некоторые особенности:

• для приготовления инокулюма используют только прямой метод суспендирования колоний;
• длительность инкубации до момента учета результатов определения чувствительности к оксациллину должна составлять не менее 24 ч.

• Необходимо использовать диски, содержащие 1 мкг оксациллина.
• При учете результатов необходимо обращать внимание даже на единичные мелкие колонии стафилококков, обнаруженные в пределах зоны подавления роста.

• В питательную среду целесообразно добавлять NaCl (до конечной концентрации 2 %).

• Штаммы стафилококков, резистентные к оксациллину, должны рассматриваться как устойчивые ко ВСЕМ бета-лактамным АБП.
• Результаты определения чувствительности стафилококков к оксациллину и к другим бета-лактамным АБП могут быть противоречивыми, при этом результаты определения чувствительности к оксациллину являются решающими.
• Определять чувствительность стафилококков к бета-лактамным АБП, кроме бензилпенициллина и оксациллина, нецелесообразно.
• Для метициллинорезистентных стафилококков характерно наличие ассоциированной резистентности к АБП других групп. Выявление у стафилококков множественной резистентности при чувствительности к оксациллину требует проведения повторных исследований.
• Следует обратить внимание на различия в критериях метициллинорезистентности для S.aureus и коагулазанегативных стафилококков.
• При получении сомнительных результатов необходимо использовать дополнительные методы (скрининг на агаре - метод приведен ниже, прямое выявление гена mecA или белка ПСБ2а).

• При выделении пенициллино- и метициллино-чувствительных штаммов стафилококков микроорганизм считается чувствительным ко всем бета-лактамным АБП, а препаратами выбора будут природные и аминопенициллины.
• При выявлении продукции бета-лактамаз и чувствительности к оксациллину микроорганизм является резистентным к природным пенициллинам, амино-, карбокси- и уреидопенициллинам, но чувствителен к оксациллину, ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам I - II поколений, которые являются препаратами выбора в данном случае. В отношении данных штаммов будут также активны цефалоспорины IV поколения и карбапенемы, однако преимуществами в сравнении с препаратами выбора они не обладают.
• При выявлении метициллинорезистентности штамм считается устойчивым ко ВСЕМ бета-лактамным антибиотикам, для лечения необходимо использовать препараты других групп, из которых препаратами выбора считаются гликопептиды.

Наиболее надежным методом выявления метициллинорезистентнсти у стафилококков является непосредственное определение наличия гена mecA молекулярно-генетическими методами (с помощью полимеразной цепной реакции - ПЦР). Кроме того, разработан коммерческий метод выявления дополнительного пенициллиносвязывающего белка - ПСБ2а в реакции агглютинации.

В то же время скрининг на агаре для выявления метициллинорезистентности является высоко чувствительным и специфичным методом, легко выполнимым в условиях рутинной работы микробиологической лаборатории, однако он может быть использован только для штаммов S.aureus.

Для проведения скрининга готовят чашки с агаром Мюллера-Хинтон, содержащие 4 % NaCl и 6,0 мкг/мл оксациллина. Хлористый натрий вносят в питательную среду в необходимом количестве до автоклавирования. Рабочий раствор оксациллина добавляют в питательную среду после автоклавирования и охлаждения среды до 45 - 50 °С. Для приготовления рабочего раствора оксациллина используют субстанцию АБП с известной активностью.

Микробную взвесь следует готовить только методом прямого суспендирования из нескольких однотипных изолированных колоний стафилококка, выросших на чашке с неселективным питательным агаром, в стерильном физиологическом растворе и доводить до мутности 0,5 по Мак-Фарланду (1,5 x 10 8 КОЕ/мл).

Для инокуляции чашек с агаром можно использовать два метода: с помощью микропипетки или с помощью стерильного ватного тампона.

• готовят разведение 1:100 стандартного инокулюма, соответствующего стандарту мутности 0,5 по Мак-Фарланду, для получения бактериальной взвеси, содержащей 1,5 x 10 6 КОЕ/мл (например, добавить 0,1 мл стандартной суспензии к 9,9 мл стерильного физиологического раствора);
• с помощью микропипетки наносят каплю (10 мкл) разведенной стандартной суспензии на поверхность агара с оксациллином.

• стерильный ватный тампон погружают в пробирку со стандартизированной суспензией (0,5 по Мак-Фарланду), затем отжимают избыток влаги о стенку пробирки;
• культуру наносят тампоном либо на ограниченную поверхность (диаметром 10 - 15 мм), либо на всю поверхность агара с оксациллином в чашке Петри.

Штаммы S.aureus инкубируются при температуре 35 °С в течение полных 24 ч, а коагулазанегативных стафилококков - в течение 48 ч.

После инкубации чашки тщательно просматривают в проходящем свете:

• появление видимого роста более 1 колонии или вуалеобразного роста на месте нанесения культуры означает устойчивость данного штамма к оксациллину (метициллину);
• при отсутствии роста на месте нанесения культуры исследуемый штамм учитывается как чувствительный к метициллину (оксациллину).
• при сомнительных результатах, а также для штаммов, выделенных у больных с клинически неэффективной терапией и у больных с серьезными инфекциями, необходимо провести развернутое исследование с определением МПК к оксациллину и гена mecA.

• Исследование проводят при обязательном контроле роста испытуемых культур на агаре Мюллера-Хинтон с 4 % NaCl без оксациллина (культуру наносят так же, как на агар с оксациллином).
• Параллельно с исследуемыми тестируют также контрольные штаммы: S.aureus ATCC 38591 - резистентный; S.aureus ATCC 29213 - чувствительный.

Макролиды и линкозамиды являются альтернативными препаратами для лечения стафилококковых инфекций. В исследование необходимо включать:

• Одного из представителей 14-ти и 15-членных макролидов. Полная перекрестная резистентность между отдельными представителями.
• Клиндамицин. Полная перекрестная резистентность между 16-членными макролидами и линкозамидами.

Приведенный выбор препаратов определяется закономерностями перекрестной резистентности между антибиотиками указанных подгрупп.

В последнее время отмечается повышение интереса к фторхинолонам как к препаратам для лечения стафилококковых инфекций (особенно кожи и мягких тканей). Новые представители этой группы АБП (антипневмококковые фторхинолоны - левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин и др.) обладают повышенной активностью в отношении Staphylococcus spp. в сравнении с традиционными препаратами. Между перечисленными подгруппами препаратов нет полной перекрестной резистентности. Антипневмококковые препараты часто сохраняют активность в отношении штаммов, устойчивых к другим фторхинолонам.

На практике необходимо учитывать некоторые особенности интерпретации результатов, полученных in vitro. Так, при детекции устойчивости к гентамицину выделенный штамм следует рассматривать как устойчивый ко всем аминогликозидам. В этой связи гентамицин должен включаться в набор для тестирования в обязательном порядке. В тоже время крайне редко могут встречаться штаммы, устойчивые к другим аминогликозидам при чувствительности к гентамицину.

Ванкомицин является одним из препаратов выбора (наряду с оксазолидинонами) для лечения инфекций, вызываемых оксациллинрезистентными штаммами. Появление сообщений об устойчивости стафилококков к гликопептидам требует внимательного отношения к оценке результатов исследования.

Оксазолидиноны являются важным достижением в лечении инфекций, вызываемых оксациллинрезистентными штаммами, в том числе и устойчивыми к гликопептидам. В то же время, необходимо иметь ввиду, что уже известно о формировании устойчивости к антибиотикам этой группы.

• Ко-тримоксазол.
• Хлорамфеникол.
• Фузидиевая кислота.
• Тетрациклины.
• Рифампицин.

Значение перечисленных препаратов в лечении стафилококковых инфекций, вызванных метициллинчувствительными штаммами, невелико, так как они уступают по активности бета-лактамам. Их клиническая эффективность при инфекциях, вызываемых оксациллинрезистентными штаммами, изучена недостаточно.

Рифампицин, ко-тримоксазол и фузидиевую кислоту нельзя рекомендовать как средство монотерапии из-за высокой частоты селекции резистентности в процессе лечения.

Формировать конкретный набор антибиотиков для оценки антибиотикочувствительности стафилококков наиболее целесообразно на основании данных о частоте распространения в стационаре метициллинрезистентности. При отсутствии или низкой частоте метициллинрезистентности вполне достаточно ограничиться оценкой чувствительности к оксациллину (в плане надзора), макролидам и, возможно, еще к 1 - 2 препаратам, реально применяемым в конкретном стационаре для лечения стафилококковых инфекций. В случае же высокой частоты распространения метициллинрезистентности в исследование необходимо включать достаточно широкий круг антибиотиков.