Бактериологическое исследование материала на листериоз

Принципы микробиологической диагностики листериоза. Диагностика листерий. Бактериоскопический, бактериологический, серологический методы диагностики листерий. Лечение листериоза. Профилактика листериоза.

Основу распознавания листериоза составляют выделение и идентификация возбудителя.

Материалы для исследования на листерии — кровь, СМЖ, слизь из зева, пунктаты увеличенных лимфатических узлов, у новорождённых дополнительно — меко-ний, пупочная кровь; секционный материал (кусочки мозга, печени, селезёнки, лимфатические узлы). Посевы рекомендуют делать в первые 7-10 сут болезни. Кровь и СМЖ засевают на плотные среды (глюкозный, глкжозо-печёночный или КА с глюкозой). Выросшие колонии отбирают для дальнейших исследований по наличию гемолитической активности (на средах с кровью) либо по способности приобретать сине-зелёную окраску при косом освещении.

Обычно ставят РА с листериозным диагностикумом. Реакция специфична и положительна со второй недели с последующим нарастанием титра AT; последние сохраняются не менее 1

2лет после выздоровления (реакция может быть использована для ретроспективного анализа).

Для биологической диагностики листериоза лучше всего использовать белых мышей, иммуносупрессированных введением кортизона (4

5 мг в/м за 4 ч до заражения). После гибели животного (обычно на 2-6-е сутки) проводят посев материала из различных органов. Следует помнить, что листе-рии размножаются в мёртвых тканях, и для избежания диагностических ошибок часть патологического материала следует поместить в стерильные пробирки и хранить в течение 5

10 сут при температуре 4-6° С, а затем подвергнуть повторному исследованию.

Основу лечения и профилактики листериоза составляет проведение адекватной антибиотикотерапии (цефалоспорины, аминогликозиды). Ведущее значение в профилактике листериоза имеют соответствующие ветеринарно-санитарные мероприятия. Определённый вклад вносят своевременное проведение дератизации и немедленное изъятие и уничтожение продуктов, испорченных грызунами (или подозрительных продуктов!). Больных лиц следует госпитализировать, а за населением неблагополучного пункта устанавливают наблюдение.

докторант 1 курса КазНАУ,

Республика Казахстан, г. Алматы

докторант 1 курса КазНАУ,

Республика Казахстан, г. Алматы

докторант 1 курса КазНАУ,

Республика Казахстан, г. Алматы

докторант 1 курса КазНАУ,

Республика Казахстан, г. Алматы

докторант 1 курса КазНАУ,

Республика Казахстан, г. Алматы

BACTERIOLOGICAL DIAGNOSIS OF LISTERIOSIS OF BIRDS

Zhumagul Kirkimbaeva

dr. prof. of Kazakh National University,

Nurzhan Sarsembayeva

dr. prof. of Kazakh National University,

Sholpan Mustafina

candidate of veterinary Science, a senior fellow at the Kazakhstan-Japan Innovation Center,

Nailya Bekturova

doctoral student Kazakh National University,

Dinara Bolatbekova

master student Kazakh National University,

АННОТАЦИЯ

Проведено бактериологическое исследование патологического материала от павших птиц. Результаты анализа клиники, патологоанатомических признаков, а также биологических свойств выделенной культуры доказывает принадлежность их к виду Listeria monocytogenes. Культура Listeria monocytogenes обладала типичными биологическими свойствами: культуральные свойства на жидкой, твердой и дифференциально-диагностической питательных средах, морфология бактериальных клеток на окрашенных по Граму мазках, характерное сбраживание углеводов, каталазная активность суточной культуры.

ABSTRACT

A bacteriological examination of pathological material from dead birds has been conducted. The results of the analysis of clinic, pathological features, as well as the biological properties of the selected culture proves that they belong to the species – Listeria monocytogenes. Culture of Listeria monocytogenes had the typical biological properties: cultural properties on the liquid, solid and differential diagnostic nutrient media, morphology of bacterial cells on Gram-stained smears, characterized by the digestion of carbohydrates, cat alase activity of daily culture.

Ключевые слова: листериоз, токсикоинфекция, диагностик, клинические признаки, бактериологическое исследование, питательные среды.

Keywords: listeria, toxicoinfection, diagnosis, clinical signs, bacteriological research, culture media.

Современное птицеводство является высокодоходной отраслью, оно дает народному хозяйству и населению страны ценное сырье и продукты питания. Поставлены задачи по обеспечению возрастающих потребностей населения в мясе и доведение уровня производства мяса и продукции из него до уровня потребления сравнимого с развитыми европейскими странами [1, с. 192].

Приоритетными должны стать показатели конкурентоспособности отечественной продукции, соответствия их качества международным требованиям, что обеспечит эффективность отрасли в условиях открытой мировой системы торговли, в области птицеводческой деятельности.

При этом пристальное внимание уделять безопасности получаемых продуктов птицеводства, так как пищевые токсикоинфекции в птицеперерабатывающей промышленности по-прежнему представляют весьма актуальную проблему. Эта задача остаётся не менее важной в связи с созданием Таможенного союза и вступлением Казахстана в ВТО.

Наибольшую опасность для потребителя представляет продукты птиц, больной инфекционными болезнями, в том числе листериозом. К настоящему времени листериоз птиц зарегистрирован в более чем 50 странах мира, где он наносит весьма существенный экономический ущерб и осложняет эпидемиологическую обстановку [4].

Листерия – это грамположительная факультативно-анаэробная палочка, не образующая спор, она выделяется из почвы, воды, пыли, сточных вод и др. широко распространены в природе и носителями являются десятки видов домашних животных и диких млекопитающих, птиц. Большинство носителей листерий по внешним признакам выглядят вполне здоровыми.

В настоящее время экспресс-диагностика листериоза основана на ПЦР. При определении специфических антител доступными в настоящее время методами имеют место как ложноотрицательные, так и ложноположительные результаты исследований [2].

Цель исследований: изучить ситуацию по листериозу в Алматинской области на птицефабриках путем выделения и идентификации возбудителя болезни, вызвавшей гибель птиц.

Материалы и методы исследования. Работа по мониторингу листериоза бактериологическими методами выполнена в Казахстанско-Японском инновационном центре, а также на птицефабриках Алматинской области РК, проводили исследования по обнаружению возбудителя листериоза за период 12.12.2015 по 12.02.2016 г.

Диагностические исследования проводились с использованием бактериологических методов. Материалом для бактериологического исследования служили грудные и бедренные мышцы, мозг, а также внутренние органы (печень, сердце) и корм. Микробиологические показатели определяли в образцах мяса, а также печени и мозге в свежем виде сразу после убоя. Микробиологический анализ проводили согласно СТ РК ГОСТ Р 51921-2002 и методическому пособию.

В паренхиматозных органах павших птиц наблюдались характерные патологоанатомические изменения: изменен цвет паренхимы печени, мягкой консистенции; селезенка кровенаполнена, темного цвета; паренхима почки мягкой консистенции, цвет изменен, сосуды серозной оболочки мозга инъецированы, сами оболочки разрыхлены, тусклые, местами на них видны кровоизлияния.

Для бактериологического исследования пробы были в соответствии с ГОСТ 21237-75.

Посевы суспензии из головного мозга и паренхиматозных органов на физиологическом растворе в соотношении 1:5 делали на питательные среды МПБ (мясо-пептонный бульон), МПА (мясо-пептонный агар). Посевы культур выращивали в термостате при 25°С. Из головного мозга и печени готовили мазки-отпечатки. Мазки из суточных колоний листерий и мазки-отпечатки окрашивали по Граму [3, c. 90].

Предназначенные для идентификации 24 – часовые бульонные культуры, выращенные при 25˚С, бактериологической петлей засевали частым штрихом на 2 пробирки МПА, так, чтобы получить рост по всей поверхности агара, выращивали при комнатной температуре 24–30 часов.

Через 24 ч культивирования посевов в термостате при 25°С в МПБ наблюдалось легкое равномерное помутнение бульона, на МПА выросли колонии мелкие, росинчатые, блестящие, вязкой консистенции, в проходящем свете наблюдали нежный рост колоний – мелкие выпуклые беловатые колоний как беловатый налет на агаре (Рис. 1).

Рисунок 1. Рост листерий на МПА

Рисунок 2. Рост листерий на кровяном агаре

Через 24 ч при появлении сплошного роста колоний бактериологической петлей производили, пересев на селективную диагностическую среду Palkam и кровяной агар. Через 24 часа инкубирования на селективной среде Pаlcam отмечался обильный рост мелких, серовато-зелёных или зелёных колоний, диаметром 0,5–1,0 мм. При появлении сплошного роста колоний листерий производили, пересев бактериологической петлей из зон наибольшего почернения среды штрихами на 2–3 чашки Петри с селективной дифференциально-диагностической средой для получения изолированных колоний. На кровяном агаре у выделенных культур обнаруживали зону гемолиза различной интенсивности (Рис. 2). Бактериальную массу из выросших изолированных колоний использовали для приготовления препаратов и окрашивания по Граму.

В окрашенных по Граму препаратах бактерии рода листерия установлены в виде коротких палочек, располагающихся одиночно и попарно. Возбудитель листериоза представляет собой грамположительные с закругленными концами палочки, которые могут быть полиморфными. Характерной особенностью листерий является то, что некоторые бактерий располагаются по отношению друг к другу в виде римской цифры V или параллельно. Суточная культура листерий, выделенная от бройлера, представлена на рис. 3.

Рисунок 3. Культура листерий в мазке, окрашенном по Граму

При посеве выделенных культур на углеводные среды получены следующие результаты.

Таблица 1.

Биохимические свойства выделенных культур листерий

Листериоз является инфекционным заболеванием, которое вызывает самые вирулентные пищевые инфекции. Листериоз распространен среди животных и людей. Характеризуется множеством источников инфекции, разнообразными путями и факторами ее передачи, множественными формами проявления и высокой летальностью. Листериозом в мире заболевает тысячи человек, от 20 до 30% из которых умирает. Смертность от тяжелых распространенных форм заболевания достигает 90 — 100%. Своевременная диагностика листериоза позволяет назначить адекватное лечение что, обеспечивает больному полное излечение.

Рис. 1. На фото больной с листериозным менингитом.

Полиморфизм клинических проявлений и невозможность выявления в ряде случаев источника инфекции создает исключительные трудности при установлении диагноза по клинико-эпидемиологическим данным. В связи с этим решающее значение приобретает лабораторная диагностика листериоза. Предварительный диагноз устанавливается на основании бактериоскопического исследования, окончательный диагноз требует бактериологического подтверждения или ПЦР.

Для исследования используются:

• Образцы крови, носоглоточная слизь, отделяемое из глаз, пунктат из лимфатических узлов, фекалии.
• У женщин, родивших мертвого ребенка или с признаками листериоза исследованию подлежат плацента, околоплодные воды, отделяемое родовых путей.
• У новорожденных исследуется меконий.
• У больных с подозрением на листериозный менингит исследуется спиномозговая жидкость.
• От трупов берется разнообразный биологический материал.
• Фекалии и мазки из ротоглотки берутся для установления бактерионосительства.

Диагностика листериоза с помощью простой и люминесцентной микроскопии

Рис. 2. Вид листерий под микроскопом. Бактерии располагаются поодиночке или парами, реже — короткими цепочками. При окраске по Граму листерии окрашиваются в розовый цвет.

Рис. 3. Листерии в свете микроскопа, дающего трехмерное увеличение, выглядят как цилиндры.

Рис. 4. Листерии в макрофагах.

Снижение работы клеточного иммунитета приводит к распространению инфекции по всему организму. В органах и тканях образуются специфические гранулемы — листериомы. Их специфический состав определяется при микроскопировании мазка или биопата.

Рис. 5. Гранулемы в печени (фото слева). Гранулема (листериомы) в головном мозге (фото справа).

Лабораторная диагностика листериоза с помощью бактериологического исследования

Листерии растут при комнатной температуре на обычных питательных средах — слабощелочных и нейтральных. Посевы рекомендуется делать в первые 7 — 10 суток заболевания. Инкубация продолжается 3 недели при температуре 37 °С. При посеве на глюкозно-кровяной агар отбирают типичные колонии (прозрачные или роговидные), дающие гемолиз.

Рис. 6. Колонии листерий при посеве на мясопептонном агаре напоминают капельки росы. В проходящем свете колонии приобретают перламутровый оттенок.

Рис. 7. При росте листерий на хромогенном агаре колонии приобретают синюю окраску.

Рис. 8. При росте на оксфордском агаре вокруг колоний образуется черный ореол.

Рис. 9. При росте листерий в мясопептонном бульоне образуется помутнение с легкой опалесценцией.

Диагностика листериоза с помощью биологических проб

Биологические пробы основаны на заражении лабораторных животных биологическим материалом, взятого от больного, с целью обнаружения бактерий. Заражению подвергают белых мышей, кроликов, морских свинок, степных пеструшек.

Рис. 10. На фото зараженные листериозом белые мыши. В центре здоровый мышонок. Справа и слева от него мыши-сосунки с параличом передних лапок.

Рис. 11. На фото слева листериоз у кролика, развившийся после внутривенного заражения. На фото справа воспалительная реакция, развившаяся на месте внутрикожного введения листерий.

Антитела к листериям

Антитела к листериям определяются с помощью серологических реакций: реакции агглютинации (РА), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции связывания комплемента (РСК) с листериозным антигеном с постановкой в парных сыворотках. При наличии листериоза у больного нарастание титра регистрируется в 4 раза и более. Реакции проводятся дважды с 2-х недельным перерывом.

В связи с антигенным родством листерий и стафилококков, возможно получение ложноположительных результатов.

Через 2 недели от начала заболевания в крови больного выявляются антитела IgG, которые присутствуют в крови на протяжении всего периода заболевания. Длительное время антитела сохраняются в крови при хроническом течении листериоза.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — экспрессный и высокочувствительный метод диагностики листериоза. Существует прямой и непрямой метод РИФ. При определении антител прямым методом к взвеси микробов, зафиксированной на предметном стекле, добавляется сыворотка, меченная флуорохромом. При образовании комплекса антиген-антитело при освещении сине-фиолетовыми (ультрафиолетовыми) лучами бактерии светятся ярко-зеленым цветом в люминесцентном микроскопе.

Рис. 12. Свечение листерий при проведении реакции иммунофлюоресценции.

Кровь на листерии

Анализ крови на листерии является эффективным способом определения листериозной инфекции. При различных формах листериоза в организме больных, прежде всего, активизируется система мононуклеарных фагоцитов — макрофагов. Они захватывают и уничтожают бактерии и вирусы, живущие внутриклеточно, считывают информацию об их строении и передают ее Т-лимфоцитам. В дальнейшем В-лимфоциты начинают вырабатывать антитела, уничтожающие патоген. При заболевании количество моноцитов в периферической крови возрастает. При септической форме листериоза их количество достигает 70% (при норме 3 — 11%).

Рис. 13. На фото моноциты — самые крупные клетки периферической крови.

Внутрикожная проба на листериоз

Для диагностики листериоза используется внутрикожная (аллергическая) проба. Листериозный антиген вводится внутрикожно. Через 24 часа проводится изучение реакции. В случае наличия листерий в организме исследуемого на месте введения листериозного антигена коже появляется папула (инфильтрат) 10 и более миллиметров.

Внутрикожная проба ставиться на 6 — 9 день от момента заболевания.

В случае появления единичных случаев листериоза диагностика заболевания должна проводиться с использованием бактериологического метода и метода ПЦР.

Дифференциальная диагностика листериоза

Дифференциальная диагностика листериоза проводится с учетом развившейся клинической формы заболевания.

• Листериозные ангины следует отличать от стрептококковых ангин.
• Острые формы листериоза следует отличать от инфекционной эритемы, инфекционного мононуклеоза, острого токсоплазмоза, заболеваний крови.
• Нервные формы листериоза следует отличать от бактериальных менингитов разной этиологии — пневмококковых, менингококковых, стафилококковых.
• Листериоз беременных следует отличать от вялотекущих пиелоциститов и пиелонефритов.

Листериоз – зооантропонозная болезнь животных и человека, характеризующаяся поражением нервной системы, септическими явлениями, абортами и маститами.

Listeria monocytogenes

Этот вид является типовым для бактерий данного рода. Для микроорганизмов этого вида характерными являются следующая группа признаков. Это неспорообразующие, короткие палочки правильной формы диаметром 0,4-0,5 мкм и длиной 0,5-2 мкм, с закругленным концами. Иногда встречаются клетки с слегка изогнутыми концами. Расположение в мазках либо поодиночке, либо в коротких цепочках, возможно в виде частокола или же римской буквы V.

В мазках можно увидеть и групповое расположение, параллельное вдоль длинной оси. В мазках из инфицированного пат. материала или из жидкой среды встречаются листерии кокковой формы диаметром 0,4-0,5 мкм и длиной 0,4-0,6 мкм. Они могут быть ошибочно приняты за стрептококки. В более зрелых или необработанных культурах могут встречаться формы в виде волокон длиной до 6-20 мкм.

Окраска по Граму положительная. Но в старых культурах теряют способность к сохранению окраски по Граму. Некислотоустойчивы.

Листериозная палочка во время культивирования при комнатной температуре всегда подвижна. При температуре +37°С жгутики как правило, не образуются и листерии оказываются неподвижными.

Листериозная культура данного вида является аэробной и факультативно анаэробной. Температурный диапазон роста от +1 до +4°С. Однако, культура остается жизнеспособной и при более высоких температурах (до 70-71°С). Температурный оптимум 25-37°С. Листерии способны расти и размножаться в диапазон рН от 6 до 9, но сохраняют свою жизнеспособность при величине рН 5-11. Оптимальные условия роста при рН 7,0-7,4. В анаэробных условиях, на кровяном агаре при температуре 35-37°С и рН 7,2-7,4 суточный рост листерий проявляется в виде росинчатых колоний. В аэробных условиях, на питательном агаре, оптимальном температурном диапазоне, 24-48-часовые листериозные колонии имеют диаметр 0,5-1,5 мм, круглые, полупрозрачные в виде капли, выпуклые с ясно очерченной поверхностью и сплошной гранью. При обычном освещении колонии обладают серо-голубоватым цветом. Размер 3-7-дневных колоний достигает диаметра 3-5,5 мм, колонии снепрозрачным центром и неправильной формы. В полужидкой среде 0,25%-ного агара суточный рост идет вдоль укола. В МПБ рост идет медленно, но через 28-48 часов появляется нежное, опалесцирующее помутнение. Через 7 дней на дне пробирки образуется осадок, который при встряхивании образует поднимающуюся вверх косичку. Бактерии обладают гемолитической активностью. Слабая, едва уловимая гемолитическая активность может быть усилена использованием САМР-теста. Листериозная культура в большинстве случаев является каталазоположительной и оксидазоотрицательной, но необходимо учитывать, что если питательные среды содержат низкие концентрации мясного и дрожжевого экстракта, то возможна отрицательная каталазная реакция. Активность каталазы подавляется на средах, содержащих высокую (более 10%) концентрацию глюкозы.

Реакция с метилротом и Фогес-Проскауэра положительна.

Листерии не разжижают желатин, не гидролизуют казеин и молоко. Индол не продуцируют, на обычных питательных средах не образуют сероводород. Расщепление сахаров сопровождается образованием кислоты, но не газа.

Листерии могут расти в сложных средах, содержащих до 10% NaCl. В течение года остаются жизнеспособны при 16% содержании поваренной соли (рН-6,0), некоторые штаммы выживают даже 20% содержании NaCl.

Необходимо отметить, что хотя вышеперечисленные свойства листерий достаточно типичны, но возможны их изменения, связанные с определенными питательными средами или выделением новых штаммов.

Штаммы данного вида различаются по антигенному составу и включают следующие серовары: 1/2а, 1/2в, 1/2с, 3а, 3в, 3с, 4а, 4ав, 4с, 4d, 4е и серовар 7. Вызывает менингоэнцефалит, септицемию, эндокардит, аборты, абсцессы и гнойные ранения местного характера.

Лабораторная диагностика

Материалы для исследования – кровь, спинномозговая жидкость, слизь из зева, пунктаты увеличенных лимфатических узлов, у новорожденных дополнительно – меконий, пупочная кровь; секционный материал — кусочки мозга, печени, селезенки, лимфатические узлы. Посевы рекомендуется делать в первые 7-10 сутки болезни; кровь (10мл) и СМЖ (2-5 мл) засевают на 100-150 мл глюкозного, глюкозо-печеночного или глюкозо-глицеринового бульона; инкубируют при температуре 37°С до 3 недель. При посеве на глюкозо-кровяной агар отбирают типичные колонии (прозрачные или роговидные), дающие гемолиз. Также можно проводить посев на триптозный агар и просматривать чашки под микроскопом при косом освещении — суточные колонии листерий имеют сине-зеленую окраску.

Материалы для исследования.В бактериологическую лабораторию направляют не менее 200 грамм исследуемого субстрата, упакованного в водонепроницаемую тару и желательно в первые 1-3 часа после отбора. Если время доставки образцов свыше указанного срока, то материал допускается направлять в замороженном виде в термосе со льдом.

Порядок исследования материала. Бактериологическое исследование проводят в соответствии с прилагаемой ниже схемой, а идентификацию выросших колоний - по тестам, указанным в таблице 12. Оптимальным решением является постановка на исследование не одной пробы исследуемого образца, а целой серии в 10-12 проб.

Читайте также:

• Какое сочетание симптомов характерно для сальмонеллеза
• Мазок из зева и носа на наличие патогенного стафилококка в инвитро
• Об отстранении непривитых от полиомиелита детей от посещения детских дошкольных учреждений
• Бактериофаг стафилококковый в набережных челнах
• Мед и ботулизм малышева