Генетико молекулярная диагностика сальмонеллезов

Лабораторная диагностика брюшного тифа и паратифов. проводится с учетом патогенеза заболевания. Основными методами лабораторной диагностики являютсябактериологический и серологический.

При сальмонеллезах иммунитет нестойкий непродолжительный.

С первого для заболевания исследуют кровь на гемокультуру (бактериологический метод). Для этого 5-10 мл крови больного засевают в колбы с 50-100 мл питательной элективной среды с желчью – среды Раппопорта. Желчь нейтрализует бактерицидные свойства сыворотки крови. После инкубирования в термостате производят пересев на среды Эндо, Левина, Плоскирева (для получения изолированных колоний и чистых культур из них). Прозрачные бесцветные колонии отсевают на среду Ресселя (Олькеницкого), на которой учитывают ферментацию сальмонеллами глюкозы и отсутствие ферментации лактозы.

Чистую культуру идентифицируют по биохимическим свойствам(сахаролитическим - по результатам посева на среды Гисса и протеолитическим - тестами на индол, Н2S, NH3 в посевах на МПБ) и антигенной структуре. Для сероидентификации ставят реакцию агглютинации на стекле с поливалентной О-сывороткой к сальмонеллам групп А, В, С, Д, Е. Положительный результат свидетельствует о принадлежности выделенной культуры к роду Salmonella. Затем определяется О-серогруппа в реакциях агглютинации с отдельными О-сыворотками (входящими в поливалентную сыворотку). Для определения серовара (вида возбудителя) устанавливают Н-антигены с монорецепторными Н-сыворотками первой, а затем второй фазы. Для полноты идентификации выделенную культуру проверяют на лизабельность поливалентным брюшнотифозным фагом.

S. typhi, кроме того, фаготипируют (определяют фаговар) Vi-фагами для установления эпидемиологической цепочки.

Для ранней ускоренной диагностики перспективным является иммунофлюоресцентный метод, позволяющий выявить специфический антиген в исследуемом материале ( крови, костном мозге).

Со второй недели заболевания проводятбактериологические исследования с испражнениями(получение копрокультуры), мочой(получение уринокультуры), желчью.

Испражнения (мочу, желчь) непосредственно, а также после проведения их через среды обогащения засевают на одну из дифференциально-диагностических сред (Эндо, Левина, Плоскирева) так, чтобы выросли изолированные колонии. Из бесцветных колоний получают чистые культуры, которые идентифицируют так же, как и гемокультуру.

Серодиагностика(выявление антител в сыворотке больного) осуществляется с конца первой - начала второй недели заболевания путем постановки реакции агглютинации Видаля с О-, Н-брюшнотифозными и А- и В-паратифозными диагностикумами.

Более чувствительной является РНГА (реакция непрямой гемагглютинации) с О-, Н-, Vi-эритроцитарными диагностикумами.

Положительная реакция агглютинации с О- и Н-антигенами свидетельствует о наличии заболевания, а положительная реакция только с Н-антигенами может быть и у переболевших, и у привитых, так как О-антитела накапливаются в разгар заболевания и исчезают к моменту выздоровления, а Н-антитела появляются к концу заболевания и сохраняются у переболевших длительное время. Диагностический титр реакции Видаля 1:200. По нарастанию титра агглютининов в динамике можно отличить имеющуюся инфекцию от реакции на прививку. В последнем случае нарастания титра антител не будет.

Для серологического исследования реконвалесцентов и выявления бактерионосителей широко используют реакцию пассивной Vi-гемагглютинации. Vi-антитела после полного выздоровления исчезают, но при наличии брюшнотифозного носительства они присутствуют постоянно. Выявление Vi-антител в титре 1:40 и выше имеет диагностическое значение: такие лица подлежат многократному бактериологическому обследованию.

Основным методомлабораторной диагностики является бактериологический. Исследуют рвотные массы, промывные воды желудка, дуоденальное содержимое, (желчь) кровь, мочу, фекалии, гной или экссудат из воспалительных очагов, пищевые продукты. Засевают на среды обогащения (селенитовый или 20% желчный бульон), а затем на висмут-сульфит агар (высокоселективная среда), Плоскирева (среднеселективная) Эндо, Левина.

Схема микробиологических исследований аналогична таковым при выделении и идентификации гемо-и копрокультуры при брюшном тифе.

Из серологических методов применяют реакцию агглютинации с О- и Н-диагностикумами, иногда с аутоштаммами бактерий, выделенными от больных; более чувствительна РНГА с эритроцитарными диагностикумами.

Возможно использование биологического метода путем вскармливания белых мышей зараженными пищевыми продуктами. S. enteritidis и S. typhimurium вызывают гибель мышей через 1-2 суток. Посевы крови из сердца и материала из внутренних органов дает рост сальмонелл.

Для экспресс-диагностики применяют иммунофлюоресцентный метод исследования (обнаружение антигенов возбудителя с помощью иммунных сывороток, обработанных флюорохромами).

|	следующая лекция ==>
Патогенез, клиника сальмонеллезов	|	Лечение сальмонеллезов

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ

СИБИРИ И ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ им. Будкера

Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов

Новосибирск - 2011 г.

Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов/ Россельхозакадемия. ГНУ ИЭВСиДВ, РАН. Сибирское отделение ИХБФМ, ИЯФ, НГУ - Новосибирск, 20с.

Современные методы выявления, идентификации сальмонелл, мониторинга сальмонеллезной инфекции позволяют существенно изменить эпизоотическую и эпидемическую ситуацию.

В данных методических рекомендациях дан обзор современных методов исследования сальмонелл и контроля эпизоотического процесса при сальмонеллезах

Данные рекомендации рассчитаны на сотрудников НИУ и специалистов по лабораторной диагностике.

Методические рекомендации подготовили: канд. биол. наук , , канд. вет. наук , к. в.н. (ГНУ ИЭВСиДВ), канд. биол. наук , , (ИХБФМ СО РАН) А. Дудников ИЯФ (СО РАН), , НГУ, канд. вет. наук (НГАУ)

Работа выполнена в рамках интеграционного проекта СО РАН №16

Рецензент: д-р вет. наук

1. Таксономия сальмонелл

2.1 Молекулярные механизмы образования О антигенов.

3 Определение факторов патогенности и антибиотикорезистентности

3.1 Структурная организация факторов патогенности в геноме сальмонелл

3.2 Выявление гена SpvC

3.3 Гены Rck и PagC

3.4 Тестирование на наличие генов устойчивости к аминогликозидам StrA и StrB

3.5 Нитроцефиновый тест

4.Флюориметрические методы исследований сальмонелл для исследования фагоцитоза

5. Определение антибиотикорезистентности в микропланшетном формате

6. Молекулярная эпизоотология

6.1 VNTR типрирование

6.2 Дискриминация штаммов и изолятов с использованием метода PFGE

6.3 ПЦР мониторинг для контроля эффективности противоэпизоотических мероприятий

7.Методические подходы, для контроля сальмонеллезов, на птицефабрике

8. Бактериологические методы изоляции возбудителя

9. Серологический мониторинг сальмонеллоносительства

10. Методические подходы к снижению реинфекции и рецидивирования сальмонеллоносительства

11. Эпизоотологические методы борьбы с антибиотикорезистентностью

12.Повышение эффективности антибиотикотерапии

13. Постантибиотические дисбактериозы как фактор реинфицирования.

14.Изучение радиорезистентности сальмонелл

15. Фаготипирование изолятов сальмонелл

Введение : Вид Salmonella enterica включает в себя более 2500 сероваров, характеризующихся различной устойчивостью к антибиотикам, гостальной специфичностью, токсичностью, патогенностью, вирулентностью, природными резервуарами и т. д. В то же время идентификация серовара только иммунохимическими методами не представляется достаточно адекватной, т. к. патогенность внутри отдельного серовара сальмонелл может варьировать благодаря наличию плазмид, мутаций и рекомбинации в хромосомной ДНК. Изменение антигенной структуры сальмонелл может происходить за счет незначительных генетических изменений в относительно небольшом числе генов, и, соответственно, иммунохимические методы типирования не в полной мере отражают генетическую изменчивость того или иного изолята сальмонелл.

Целью исследования было усовершенствовать систему изоляции и типирования сальмонелл при мониторинге сальмонеллоноситества для свинокомплексов и птицефабрик.

1. Таксономия сальмонелл

Все серовары сальмонелл относятся к двум видам: S. bongori и S. enterica. Последний разделяется на 5 подвидов, обозначаемых собственными именами и цифрами: enterica (I), salamae (II), arizonae ( IIIa ), diarizonae ( IIIb ), houtenae ( IV ) и indica ( V ). Для человека патогенны первые два подвида, причем подвид enterica (I) включает в себя большую часть известных в настоящее время сероваров микроба (1400 из 2500). В этиологии внекишечного сальмонеллеза основную роль играют S. typhimurium (34%) и S. enteritidis (21%). Далее следуют следующие серовары: S. panama (6%). S . choleraesuis (5%) и S . virchow (5%). На долю остальных приходится 29% [1, 2]. Смертность при внекишечных формах сальмонеллеза у человека варьирует от 7% для инфекций костно-суставной системы до 60-80% для инфекций дыхательной системы и ЦНС [3].

2. Определение антигенной структуры

2.1 Молекулярные механизмы образования О антигенов.

Сальмонеллы серогрупп А, B , D характеризуются иммунодоминантными антигенами имеющими в своем составе паратозу, абеквозу и тивелозу. Наличие гена rfbJ абеквоза синтаза, обеспечивает синтез О антигена на основа GDP -абеквозы а ген rfbS паратоза-синтаза необходим для синтеза О антигенов групп B и D дальнейшая конверсия GDP паратозы с использованием продукта гена rfbE GDP -тивелоза-эпимераза конвертирующая паратозу в тивелозу необходимую для синтеза О антигена группы D (рисунок 1).

Рис1. Финальные этапы путей синтеза углеводных единиц полисахаридных О-антигенов сальмонелл различных серогрупп абеквозы, паратозы и тивелозы.

Рис. 2 ( A ) Структуры О - антигенов S . enterica групп B , D 1, D 1 соответствующих фаготипам P 27, D 2, D 3, and E 1. Абревиатуры: Abe , абеквоза; Gal , галактоза; Man , манноза; Rha , рамноза; Tyv , тивелоза. .

( B ) Представлен эпитоп O антигена S . enterica серовара Zuerich группы D 3.Утолщенная линия окружающая олигосахаридную единицу символизирует значимость углевода в структуре эпитопа, тонкая линия отмечает важные сахара в комбинации, прерывистая линия отмечает дополнительные углеводы, которые могут легко утрачиваться в процессе экспрессии эпитопов ( modified after Nghiem et al . [28]).

О – единицы S . enteric группы D 2 ( O 9,46) отличаются от группы D 1 ( O 9,12) мономерными комбинациями остатков маннозы( reviewed by Kauffmann ), галактозил-маннозная связь при полимеризации О антигена у сальмонелл группы D 1 формируется в положениях 1 – 2, а у группы D 2 [7.] в положении 1-6 О - единица S . enterica E 1 ( O 3,10) имеет такую же олигосахаридную единицу как у группы D 2, но без тивелозы [9].

Гены обеспечивающие синтез О антигенов локализуются совместно в хромосоме в составе генного кластера rfb [4]. Гены кодирующие синтез сахаров и трансферразы необходимы для синтеза повторяющихся олигосахарилдных единиц О антигена. Ген именуемый wzx (ранее rfb X ) кодирует протеин входящий в состав 12 потенциальных трансмембранных сегментов, найден во всех кластерах генов О-антигена сальмонелл. Wzx – протеины из различных О антигенных кластеров обладают структурной гомологией но имеют незначительное сходство по аминокислотному составу [6]. Предполагается, что Wxz обеспечивает перенос из цитоплазмы на периплазматическую зону цитоплазматической мембраны.

Жгутиковые антигены H 1 и H 2 (фаза 1 и 2) кодируются генами fli C и flj B соответственно. Как правило, эти гены локализуются на разных участках хромосомы, но только один из генов экспрессируется клетками благодаря механизму регуляции оперона flj BA [5].

2.2 Антигенспецифичная ПЦР

Подробный анализ структуры антигенов сальмонелл и генов ответственных за синтез антигенов, сделал возможныпм создание ПЦР тестов для определения серотипов сальмонелл. В таблице 1 приведены структуры праймеров и примеры тестов для определения серотипа сальмонелл метобом ПЦР [10].

Таблица 1. Структруы праймеров и размеры ампликонов для определение серотипов сальмонелл методом ПЦР.

Ген

Нуклеотидная последовательность

Ампликон п . н .

Номенклатура МЗРФ (Приказ №804н): A26.06.077.000.01 "Определение антител к сальмонеллам (Salmonella) методом реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в крови"

Биоматериал: Сыворотка крови

Срок выполнения (в лаборатории): 3 р.д. *

Описание

Выявление специфических антител (к О-антигенам сальмонелл, Vi-антигену возбудителя брюшного тифа), которые вырабатываются иммунной системой человека в ответ на инфицирование соответствующими возбудителями.

Брюшной тиф вызывается Salmonella Typhi (обладает поверхностным соматическим Vi-антигеном). Заболевание характеризуется достаточно тяжелым и длительным течением, а также развитием таких опасных осложнений, как кишечное кровотечение и перфорация кишечника. Источником инфекции являются только больные люди и бактерионосители (антропоноз). Механизм передачи возбудителя - фекально-оральный. Инкубационный период составляет от 3 до 21 дня. В этот период пациент может не подозревать, что он инфицирован, поэтому способен активно заражать окружающих при несоблюдении правил личной гигиены. Течение заболевания длительное. На фоне неадекватного лечения развивается хронизация процесса и брюшнотифозное бактерионосительство.

Сальмонеллезы – группа инфекций, возбудителями которых являются энтеробактерии рода Salmonellaразличных серогрупп (по типу О-антигена выделяют серогруппы А, В, С1, С2, D, E).

Сальмонеллезы характеризуются значительным полиморфизмом клинического течения с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта. Инкубационный период при сальмонеллезной инфекции составляет от нескольких часов до 5-7 суток.

Сальмонеллезы встречаются во всех регионах мира. В настоящее время - это один из наиболее распространенных зоонозов (группа инфекционных заболеваний, возбудители которых паразитируют в организме животных и для которых животные являются естественным резервуаром обитания) во многих странах. Заболеваемость сальмонеллезами повсеместно имеет тенденцию к росту. Особенно это касается крупных городов с централизованной системой продовольственного снабжения.

Источниками инфекции являются в основном домашние животные и птицы (свиньи овцы, куры, утки гуси), однако определенное значение играет и человек (больной, или бактерионоситель) как дополнительный источник. Наибольшую опасность человек, как источник инфекции, представляет для детей первого года жизни. Бактерионосители могут представлять опасность и для взрослых в том случае, если они имеет отношение к приготовлению пищи, раздаче ее или продаже пищевых продуктов.

Сальмонеллезная инфекция широко распространена среди диких птиц (голуби, воробьи, скворцы, чайки и др.). При этом птицы могут загрязнять жилые помещения и продукты питания.

Основной путь заражения при сальмонеллезе - алиментарный, обусловленный употреблением в пищу продуктов, в которых содержится большое количество сальмонелл. Обычно это наблюдается при неправильной кулинарной обработке, когда инфицированные продукты, в основном мясные (мясной фарш, изделия из него, студень, мясные салаты, вареные колбасы), блюда с использованием сырых яиц, находились в условиях, благоприятных для размножения сальмонелл. В последние годы отмечается значительный рост заболеваемости сальмонеллезом, связанный с распространением возбудителя через мясо птицы и яйца. Во многих странах этот путь заражения сейчас является ведущим.

Для диагностики заболевания используют бактериологические, молекулярно-генетические и серологические методы исследования. Лабораторным критерием диагноза заболевания является выявление воз­будителей (сальмонелл) в исследуемых образцах (испражнениях, моче, крови, рвотных массах, желчи, дуоденальном содержимом, промывных водах больных, а в ряде случаев - в спинномозговой жидкости и секционном материале). Серологическая диагностика сальмонеллезов является вспомогательным методом исследования. Значимость метода возрастает при отрицательных результатах бактериологического и молекулярно-генетического методов, при позднем обращении пациента за медицинской помощью, предшествующей антимикробной терапии, затяжном течении заболевания, хронизации процесса.

Показания к назначению

• для обследования пациентов с клинической картиной кишечной инфекции (тошнота, рвота, жидкий стул, общее недомогание, повышение температуры);
• для выявления больных сальмонеллезом;
• для выявления бактерионосителей Salmonella Typhi, в том числе среди работников пищевых предприятий;
• для оценки эффективности вакцинации после брюшного тифа (информативно не ранее 7 дня после вакцинации);
• при обследовании пациентов, контактировавших с больными сальмонеллезом и брюшным тифом.

Подготовка к исследованию

Специальной подготовки к исследованию не требуется. Взятие крови проводится натощак или не ранее, чем через 4 часа после необильного приема пищи. Допустимо пить чистую не минеральную и не газированную воду. Чай, кофе, сок запрещаются.

Интерпретация результатов/Информация для специалистов

Результат исследования – качественный.

Референсные значения: не обнаружено.

Использование РПГА для диагностики сальмонеллезов имеет вспомогательное значение, так как в крови практически здоровых людей могут присутствовать антитела к антигенам сальмонелл. Существенно большее диагностическое значение имеет нарастание уровня антител в динамике заболевания, для чего сыворотку нужно брать сразу после выявления больного, а затем в конце первой или в начале второй недели болезни.

Интерпретация результатов исследования

Отрицательный результат: 1) нет инфицирования возбудителями; 2) низкий уровень антител в ранний период инфекции (исследование рекомендуется повторить через неделю); 3) низкий уровень антител на фоне проводимой антимикробной терапии.

Положительный результат: 1) текущая или перенесенная в прошлом сальмонеллезная инфекция; 2) хроническое бактерионосительство; 3) в ряде случаев возможен ложноположительный результат, вызванный перекрестной реакцией с антигенами других микроорганизмов или типов сальмонелл.

Где сдать анализ?

Адреса медицинских центров, в которых можно заказать исследование, уточняйте по телефону 8-800-100-363-0
Все медицинские центры СИТИЛАБ в г. Москва >>

Код	Наименование	Срок	Цена	Заказ
45-20-114	Ат к Yersinia enterocolitica IgG	от 5 р.д.	700.00 р.
45-20-115	Ат к Yersinia enterocolitica IgA	от 5 р.д.	700.00 р.
45-20-404	Ат к Shigella sonnei (шигелла Зонне, РПГА, суммарные)	от 3 р.д.	530.00 р.
45-20-405	Ат к Shigella flexneri (шигелла Флекснера, РПГА, суммарные)	от 3 р.д.	530.00 р.
45-20-407	Ат к Yersinia pseudotuberculosis (РПГА, суммарные - псевдотуберкулёз)	от 3 р.д.	600.00 р.

* На сайте указан максимально возможный срок выполнения исследования. Он отражает время выполнения исследования в лаборатории и не включает время на доставку биоматериала до лаборатории.
Приведенная информация носит справочный характер и не является публичной офертой. Для получения актуальной информации обратитесь в медицинский центр Исполнителя или call-центр.

Сальмонеллезы - инфекционные болезни, возбудителями которых являются представители рода Salmonella . Они характеризуются значительным полиморфизмом клинического течения с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта, возможной генерализацией и различной степенью выраженности симптомов общей интоксикации и обезвоживания.

Род Salmonell а входит в семейство Enterobacteriaceae и состоит из микроорганизмов, родственных по фенотипическим и генотипическим свойствам. Ферментативные свойства сальмонелл положены в основу их подразделения на подвиды. Согласно последним данным род Salmonell а представлен двумя видами – S . enterica и S . bongori .

Сальмонеллы вида S . enterica делятся на несколько подвидов.

Деление на подвиды имеет определенное эпидемиологическое значение так как основным, естественным резервуаром сальмонелл подвидов 1 и 2 служат теплокровные животные, а для представителей остальных подвидов ( IIIa , IIIb , IV , VI и вида S . bongori ( V ) – хладнокровные животные и окружающая среда.

Сальмонеллы каждого подвида разделяются на серологические варианты по О- и Н- антигенной характеристике. Современная схема Кауфмана-Уайта насчитывает 2579 серологических вариантов.

Сальмонеллы – лактозонегативные грамотрицательные палочки. Подвижные, имеют по всей поверхности клетки жгутики, D -глюкозу ферментируют с образованием кислоты и газа. Ферментируют рамнозу, ксилозу, арабинозу, мальтозу, дульцит, сорбит, трегалозу, маннит. Сальмонеллы – оксидазонегативные, каталазопозитивные, продуцируют сероводород и не расщепляют мочевину.

Они являются факультативными анаэробами, хорошо растут на обычных питательных средах. Оптимальной температурой роста является 37 о С. При температуре ниже 5 о С их рост полностью прекращается.

Сальмонеллы обладают сравнительно высокой степенью устойчивости к воздействию различных факторов внешней среды. В жидкой среде при прогревании до 70 о С они погибают через 5-10 минут, а при кипячении моментально.

В то же время они хорошо сохраняются в различных пищевых продуктах (молоке, мясе, на поверхности и внутри яиц и др.). Соление и копчение оказывают на сальмонеллы относительно слабое действие.

Факторами передачи возбудителей инфекции при сальмонеллезах являются, как правило, продукты животного происхождения, в том числе молоко и молочные продукты.

В настоящее время чаще всего заболевания возникают при употреблении в пищу инфицированных яиц или продуктов, в состав которых входят яйца, в том числе кремово-кондитерских изделий. Ряд заболеваний связан с инфицированным сальмонеллами мясом и мясопродуктами. Чаще всего это мясо домашних птиц (куры, утки, гуси, индейки), а также крупного рогатого скота и свинина. Известны вспышки сальмонеллеза, связанные с употреблением рыбы и рыбных продуктов, в том числе рыбы горячего копчения и сельди пряного посола.

Инфицированными могут быть и продукты растительного происхождения (овощи, фрукты, ягоды), а также дрожжи, кондитерские красители и даже наркотические средства (марихуана).

Наибольшую опасность как возможные факторы передачи возбудителя инфекции представляют такие продукты и блюда, которые после приготовления не подвергаются термической обработке и могут храниться длительное время, в том числе и при комнатной температуре.

Следует учитывать и то, что даже при интенсивном размножении сальмонелл в пищевых продуктах они не изменяют ни вкуса, ни запаха, ни их внешнего вида.

Основными критериями эпидемиологической значимости определенных продуктов питания является обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах или других объектах внешней среды.

Следует подчеркнуть, что в последние 20 лет во всем мире и в нашей стране широко распространилась Salmonella е nteritidis . Представители этого серовара вызывают пищевые вспышки сальмонеллеза при низкой дозе указанных микроорганизмов в продукте, а заболевания отличаются, как правило, более манифестным клиническим течением.

В настоящее время известны ряд схем, используемых в различных странах для выделения сальмонелл. В идеале для этого должны быть выбраны высокочувствительные и специфичные методы. В то же время эти методы должны быть простыми, быстрыми и недорогими.

Основными объектами окружающей среды, подлежащими исследованию на наличие сальмонелл, являются все пищевые продукты, а также остатки пищи, употребленной заболевшими, исходные продукты и полуфабрикаты, которые использовали при ее приготовлении, суточные пробы готовой пищи и другие подозреваемые в качестве фактора передачи возбудителя инфекции. А так же, смывы с различных предметов на эпидемиологически значимых объектах, в лечебно-профилактических учреждениях, вода (питьевая, открытых водоисточников, сточная), воздух и почва.

Лабораторным критерием диагноза является выделение возбудителя (сальмонеллы) из испражнений, мочи, крови, рвотных масс и промывных вод больных, а при необходимости и из желчи, дуоденального содержимого, спинномозговой жидкости и секционного материала.

Сложности с выделением сальмонелл связаны с наличием в кишечной флоре 10 11 конкурентных микроорганизмов 300-400 видов, травмированием клеток при их транспортировке. Для преодоления этого при выделении сальмонелл обязательно используются среды обогащения: селенитовую, магниевую среды, RVS булон, а в качестве дифференциально-диагностических сред среды висмут-сульфит агара, SS -агар, XLD , Мак-Конки, Плоскирева.

Необходимо учитывать, что при исследовании различных материалов на инфицированность сальмонеллами отличаются только начальные этапы анализа (правила взятия материала, его обработка, выбор адекватных питательных сред). Начиная с отбора колоний на дифференциально-диагностических средах, последующие этапы бактериологического исследования идентичны.

После 18-20 часового инкубирования чашек с дифференциально-диагностическими средами (висмут-сульфит агар 48 час.) производится учет характера роста с отбором подозрительных колоний на одну из сред для первичной идентификации (Клиглера, Ресселя, Олькеницкого). У подозрительных культур изучают их ферментативные характеристики, позволяющие определить родовую и видовую принадлежность выделенных бактерий.

В дополнение к микробиологическому методу диагностики могут быть использованы серологический и молекулярно-генетический методы.

Большое диагностическое значение имеет нарастание уровня антител в динамике заболевания, для чего сыворотку нужно брать сразу после выявления больного, а затем в конце первой или в начале второй недели болезни. В более поздние сроки заболевания титр антител снижается, что также может служить диагностическим критерием.

Условно-диагностическим титром считается титр не ниже 1:320 для взрослых, 1:80 для детей до 6 мес. и 1:160 для детей старше 6 мес.

Положительным нарастанием титра антител считается их 4-х кратное увеличение по отношению к одному и тому же антигену.

При обработке сыворотки крови цистеином IgM -антитела инактивируются, тогда как IgG -антитела резистентны к этому препарату. В результате в РПГА выявляются только IgG -антитела, тем самым повышается специфичность реакции.

Достаточно высокий титр в РПГА с цистеином указывает на возможное хроническое сальмонеллоносительство или переболевание сальмонеллезом в течение последних 1-2 мес.

Молекулярно-генетические методы исследования в отношении микроорганизмов рода Salmonella обладают рядом особенностей, которые необходимо учитывать при определении оптимальной области их применения и правильной интерпретации получаемых результатов:

· Объектом детекции является ДНК возбудителя, обнаружение которой не является доказательством жизнеспособности микроорганизма.

· Аналитическая чувствительность различных тест-систем на основе метода ПЦР колеблется в пределах 100-500 бактериальных клеток/мл, и в ряде случаев может уступать аналитической чувствительности микробиологического исследования с использованием сред селективного обогащения.

· При работе с продуктами питания обнаружение ДНК сальмонелл требует дополнительного микробиологического исследования для выявления культуры возбудителя.

Таким образом, молекулярно-генетический метод исследования является дополнительным к микробиологическому методу диагностики.

На правах рукописи

Золотарева Лилия Васильевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ И СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ САЛЬМОНЕЛЛЕЮВ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Кировском государственном медицинском институте Министерства здравоохранения РФ

доктор медицинских наук, профессор доктор технических наук

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Э.С.Горовиц О. А.Тимашева

Ведущая организация - НИИ микробиологии МО РФ, г. Киров

заседании диссертационного совета К 200.46.01 Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

/■Сг'. ССА- 1998 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Широкое распространение сальмонеллезов во многих, в том числе высокоразвитых странах, и связанный с этим огромный экономический и социальный ущерб вызывают настоятельную необходимость всестороннего изучения данной проблемы (Сатаров С. с соавт., 1997; Schmid Н. et al., 1996; Yang С.Н. et al., Holtby J. et al.. 1997).

Несмотря на огромное количество научных исследований, проводимых во всем мире и посвященных сальмонеллезной инфекции, до последнего времени не решены многие кардинальные вопросы патогенеза и лабораторной диагностики.

Встречаясь в любом возрасте, сальмонеллез поражает, преимущественно, детей, особенно раннего возраста, у которых он часто протекает длительно, с развитием тяжелых форм, нередко заканчивается летальным исходом и осложняет эпидемиологическую ситуацию в детских стационарах (Учапкин В.Ф. с соавт., 1996; Милютина J1.H. с соавт.. 1997; Новок-шонов A.A. с соавт., 1997; Andersson V. et al., 1995).

Разнообразие клинической каргины сальмонеллеза, зачастую, вызывает трудности в постановке диагноза и своевременном проведении комплекса необходимых лечебных и противоэпидемических мероприятий. В связи с этим ведущее значение в диагностике сальмонеллезной инфекции отводится лабораторным методам исследования: бактериологическому и серологическому, в частности реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Однако эти методы имеют ряд существенных недостатков, значительно снижающих их эффективность. К ним относятся: низкая чувствительность, большая трудоемкость, длительность исследования, использование дорогостоящих диагностикумов и питательных сред, приготовленных на основе мясных, казеиновых, рыбных, растительных и других гидролизатов и экстрактов, получаемых из ценного пищевого сырья (Блинова Л.П. с соавт., 1994; Амерханова H.H. с соавт., 1995; Куликова И.Н. с соавт., 1996; Турьянов М.Х. с соавт., 1998).

Следует отметить, что к настоящему времени разработаны и предложены к внедрению в клиническую практику многочисленные методы, позволяющие выявлять противосальмонеллезные антитела в сыворотке крови и специфические антигены в различных биосубстратах больных (Doran J.L. et al., 1994; Jackson A.A. et al. 1995; Gast R.K. et al.. 1997; Wegener H.C. et al., 1997). Однако использование большинства из них ограничено из-за недостаточной специфичности и чувствительности, подтверждения диагноза только в поздние сроки заболевания или из-за сложности постановки, отсутствия стандартных коммерческих препаратов. реагентов, оборудования, или из-за больших экономических затрат. Кроме того, до сих пор продолжаются поиски непищевого сырья для приготовления микробиологических питательных сред.

Анализ данных специальной литературы и высказанные выше предпосылки позволили сформулировать цель и определить задачи работы.

Цель настоящей работы - разработка и апробация нового оригинального метода - реакции гидрозольной агглютинации для серодиагностики сальмонеллезов, а также усовершенствование бактериологической диагностики этой инфекции.

Конкретные задачи исследования:

1. Разработать гидрозольные антигенный и антительный диагно-стикумы для серодиагностики сальмонеллезной инфекции.

2. Дать сравнительную оценку эффективности реакции гидрозольной агглютинации и реакции пассивной тем агглютинации при выявлении сывороточных противосальмонеллезных антител.

3. Изучить возможность применения гидрозольного антительного диагностикума с целью обнаружения антигенов сальмонелл в исследуемом материале.

4. Оценить эффективность новых питательных сред, приготовленных на основе отходов пушного производства и предназначенных для выделения сальмонелл, по сравнению с контрольными средами.

Научная новизна работы.

Впервые для диагностики сальмонеллеза предложены гидрозольные антигенный и антительный диагностикумы. В реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА) определены диагностические титры и изучены частота обнаружения и величина титров противосальмонеллезных антител у больных острыми кишечными инфекциями. Проведено сравнительное изучение эффективности использования реакции гидрозольной агглютинации и реакции пассивной гемагглютинации при диагностике сальмонеллезной инфекции. Впервые показана возможность использования гидрозольного антительного диагностикума для выявления антигенов сальмонелл в исследуемом материале. Впервые для обнаружения сальмонелл предложены новые питательные среды, приготовленные на основе отходов пушного производства, и доказана эффективность их применения.

Практическое значение. На основании полученных результатов исследования показано, что простота и экспрессность постановки, экономичность, достаточная чувствительность и специфичность реакции гидрозольной агглютинации со специфическими антигенным и антительным диагностикумами позволяют рекомендовать ее для серодиагностики сальмонеллезов. Определены оптимальные сроки проведения серологического обследования больных сальмонеллезом в зависимости от их возраста. Предложенные питательные среды на новой оригинальной основе, не отличающиеся по физико-химическим характеристикам, ростовым

свойствам и высеваемости от контрольных, могут быть успешно использованы для выделения сальмонелл.

Внедрение в практику. Материалы исследований внедрены и используются в практической деятельности врачей городской инфекционной больницы г. Кирова, в учебном процессе на лечебном и педиатрическом факультетах Кировского государственного медицинского института.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Реакция гидрозольной агглютинации при выявлении в сыворотках крови противосальмонеллезных антител по своим основным характеристикам не уступает реакции пассивной гемагглютинации.

2. Реакция гидрозольной агглютинации с антительным диагности-кумом может быть использована для обнаружения антигенов сальмонелл в материале от больных острыми кишечными инфекциями.

3. Питательные среды, приготовленные на новой основе из отходов пушного производства, по своему химическому составу, ростовым свойствам и высеваемости в отношении сальмонелл соответствуют контрольным средам.

Апробация диссертационного материала. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях "Острые инфекционные заболевания" (Киров-Екатеринбург, 1993), "Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины" (Киров, 1997), "К 75-летию санитарно-эпидемиологической службы" (Киров, 1997), III Международном конгрессе "Иммунореабилигация и реабилитация в медицине" (Эйлат-Израиль, 1997), VIII съезде педиатров России (Москва, 1998), на заседании проблемной комиссии "Медико-биологических дисциплин" Кировского государственного медицинского института.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 таблицами и 3 рисунками: состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 2 глав собственных исследований, а также заключения с обсуждением полученных результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 221 наименование работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Под нашим наблюдением в период с 1996 по 1998 год находились 152 больных сальмонеллезом в возрасте от 3 мес. до 65 лет. Дети первого года жизни составляли 27%, 1-3 лет - 20,4%, 3-15 лет -18,4%, взрослые -34,2%. У 39 детей в возрасте от 3 мес. до 3 лет заболевание развилось в условиях соматических стационаров и было вызвано антибиотикорези-стентным вариантом сальмонеллы тифимуриум. У остальных больных заражение сальмонеллами энтеритидис и тифимуриум произошло во внебольничных условиях.

Диагноз устанавливали на основании тщательного изучения анамнеза, совокупности клинико-эпидемиологических данных, результатов бактериологического и серологических исследований.

При формировании клинического диагноза у взрослых применяли принципы классификации, предложенные сотрудниками Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии (Покровский В.И. с соавт., 1989), в соответствии с которыми выделяли клиническую форму, вариант и течение заболевания. По рекомендациям Н.И.Нисевич с соавт. (1990) у больных детей определяли тип, форму, тяжесть и течение заболевания. Все находившиеся под нашим наблюдением больные сальмонеллезом перенесли гастроинтестинальную форму. Желудочно-кишечная форма в зависимости от степени выраженности местных проявлений, интоксикационного и дегидратационного синдромов была у 33,5 % больных тяжелой, у 52,0% - среднетяжелой и у 14,5% - легкой. В большинстве случаев^,2%) больные поступили в стационар в первые два дня болезни, в 14,5% - на третий день и лишь 3,3% - на четвертый день и позднее.

Показатели обследованных из основной группы сравнивали с соответствующими показателями 87 больных острой дизентерией, 276 - острыми кишечными инфекциями (ОКИ) неустановленной этиологии и 140 здоровых. От 655 обследованных лиц было доставлено в лабораторию 1520 проб фекалий. При этом было проведено 3774 бактериологических исследований. В серологических реакциях исследованы 746 проб сывороток крови и 342 пробы селенитового бульона. В том числе от 152 больных сальмонеллезом, вызванным сальмонеллами тифимуриум и энтеритидис, было получено 437 проб фекалий и 243 пробы сывороток крови. У здоровых людей исследованы 140 проб фекалий и 140 проб сывороток крови.

В бактериологических исследованиях была изучена возможность применения мясо-костного фарша тушек пушных зверей (лисиц, норок, песцов), являющихся отходом пушного производства, в качестве основы микробиологических питательных сред. На основе гидролизата мясокостного фарша тушек пушных зверей было приготовлено и изучено 1 ]

серий новых питательных сред, которые сравнивались с соответствующими сухими питательными средами, выпускаемыми в промышленных условиях.

Проверка качества питательных сред (опытных и контрольных) проводилась в соответствии с "Методическими рекомендациями по контролю качества некоторых наиболее важных питательных сред, применяемых при бактериологическом исследовании по поводу острых кишечных инфекций", составленными совместно лабораторией кишечных инфекций Ленинградского института Эпидемиологии и Микробиологии им.Пастера (Л., 1979) и бактериологической лабораторией Кировской областной санэпидстанции (1979), и "Методическими указаниями по применению физико-химических методов контроля питательных сред"(М., 1977).

Бактериологическое обследование и взятие проб для серологическо-кого анализа проводили в динамике: при поступлении больных в стационар (1-3 день болезни), в период разгара заболевания и перед выпиской из стационара.

Бактериологическое исследование включало прямой параллельный посев испражнений на опытные и контрольные среды Эндо и Плоскирева и обогатительную среду - селенитовый бульон. У всех выделенных штаммов сальмонелл изучены культурально-морфологические свойства, определены серовариант, антибиотикочувствительность и фаголизабельность.

Для экспрессности выявления антигенов сальмонелл в среде обогащения (селенитовом бульоне) использовали реакцию гидрозольной агглютинации с антительным диагностикумом, постановку которой проводили аналогично постановке реакции агглютинации на стекле (Биргер М.О., 1982).

Для титрования сывороток крови на О-антитела к сальмонеллам группы В и Д использованы: а) реакция пассивной гемагглютинации: б) реакция гидрозольной агглютинации с антигенным диагностикумом.

Все материалы обработаны статистически. При оценке степени достоверности средних данных использовали I - критерий Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения диагностической ценности разработанной нами серологической реакции была проведена сравнительная оценка эффективности реакции гидрозолыюй агглютинации с антигенным гидрозольным диагностикумом и реакции пассивной гемагглютинации с эритроцитар-ным диагностикумом. С помощью обоих методов была изучена частота обнаружения сывороточных противосальмонеллезных антител, а также их уровень у 140 здоровых людей, 152 больных сальмонеллезом, 87 боль-

ных дизентерией и 276 больных ОКИ неустановленной этиологии в возрасте от 3 месяцев до 60 лет.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что у части здоровых людей в сыворотке крови обнаруживались в небольших титрах про-тивосальмонеллезные антитела. При этом в РГЗА, в сравнении с РПГА, они выявлялись, в среднем, в 1,5 раза (43,6+4.2% и 28,5±3„8% соответственно), а у детей в возрасте до 1 года - достоверно в 2 раза (25,0+3,8% и 12,5±4,1% соответственно) чаще. Было установлено также, что в разных возрастных группах определялись специфические антитела к различным серотипам сальмонелл. Так, у детей раннего возраста обнаруживались специфические антитела к сальмонелле тифимуриум в 3 раза чаще, а у взрослых - в 6,5 раз (Р 0,05

Взрослые 80 5,0±2,4 11,3±3,5 >0,05

Всего 276 5,1±1.3 13,4±2,0 0,05). Выявленное некоторое повышение средних геометрических титров у больных, по-видимому, обусловлено появлением у них в небольшом количестве перекрестно реагирующих антител. В то же время средние геометрические титры противосальмонеллезных антител у больных сальмонеллезом превышали аналогичные показатели в РПГА у здоровых и больных ОКИ несальмонеллезной этиологии соответственно в 5,4-4,1 раза ( в РГЗА - 6,3 и 4,9). При этом в РГЗА наиболее выраженные отличия, в 7 раз (Р 2000 1,4+0,5 1,5±0,3

6. 500-1600 13,4±1,1 15,5±0,9

8. 80-300 1.2±0,3 1,1±0,2

пептидов фракции 5-7 42.5±1.2 37.1+1,3

Исключение составили фракции 1 и 4, в первой из которых содержание пептидов было в опытных пробах выше, чем в контрольных (в 1,3 раза), а в четвертой, наоборот, ниже (в 3.3 раза). Аналогичные результаты были получены и при изучении содержания ионов металлов, а также углеводного и жирнокислотного составов.

Следовательно, сопоставление химического состава сравниваемых питательных основ не выявило достоверных различий между ними по большинству параметров.

Следующим этапом нашей работы было изучение качества (8 серий) опытных сред Эндо и Плоскирева, приготовленных из новой питательной основы по общепринятым технологическим методикам. В качестве контрольных использовали коммерческие среды, приготовленные по прописям на этикетках. По составляющим компонентам, кроме питательной основы, опытные и контрольные среды не отличались между собой. Опыты ставили с патогенными и непатогенными микробами кишечной группы, при этом использовали полученные из ГИСК им. Л.А.Тарасевича музейные тест-штаммы сальмонеллы энтеритидис (269), сальмонеллы тифи-муриум (47), эшерихии коли (АТСС 25922).

В результате проведенных исследований по проверке качества опытных сред Эндо и Плоскирева было установлено, что через 16-20 часов термостатирования (при температуре 37°С) на чашках с высевами из одного и того же разведения вырастало близкое количество колоний возбудителя. Между числами колоний по посевам из разных разведений сохранялись правильные десятикратные соотношения.

Сопоставляя полученные результаты определения ростовых свойств опытных и контрольных питательных сред Эндо и Плоскирева, мы не выявили различия между сальмонеллами энтеритидис и тифимуриум. В то же время во всех разведениях микробов количество колоний кишечной палочки как на опытных, так и на контрольных средах было достоверно меньше, чем количество сальмонелл.

Кроме ростовых свойств новой питательной среды Плоскирева, также необходимо было изучить и ее ингибирующую активность в отношении непатогенных микроорганизмов кишечной группы. Для сравнения была использована среда Эндо, необладающая ингибирующими свойствами.

При определении ингибирующих свойств питательной среды Плоскирева в отношении тест-штаммов сальмонелл энтеритидис и тифимуриум нами было обнаружено, что при посевных дозах 500, 50, 5 м.т./мкл опытная среда Плоскирева в 1,2 раза больше задерживала рост сальмонелл энтеритидис и тифимуриум, чем опытная среда Эндо, а контрольная - в 1,1раза. Было установлено также, что во всех разведениях (Ю-5, Ю-6, Ю-7) микроорганизмов ингибирующая активность сред Плоскирева была более выражена (Р Золотарева, Лилия Васильевна

кандидата медицинских наук

Пермь, 1998

ВАК 03.00.07