Латекс агглютинация для стафилококка biomerieux

Реакция агглютинации латекса (РАЛ), или реакция латекс-агглютинации, разработана давно, однако она не нашла достаточно широкого применения в медицине и в ветеринарии.

Тем не менее усиливающаяся тенденция использовать в качестве носителей антигенов и антител инертные синтетические материалы привела к оживлению интереса к РАЛ и широкому изучению возможностей ее применения.

Принцип метода. Механизм РАЛ аналогичен РИГА, в которой используют сенсибилизированные антигенами или антителами эритроциты человека или животных. Для постановки РАЛ применяют сенсибилизированные частицы полистирольного латекса, которые в присутствии гомологичного реагента склеиваются. Обычно эта реакция проходит очень быстро (3…8 мин), что позволяет применить ее в качестве экспресс-метода для выявления антигенов и антител.

Преимущества РАЛ в том, что частицы латекса в отличие от эритроцитов не имеют перекрестно реагирующих антигенов, поэтому она специфичнее РИГА.

Материалы и реагенты. 1. Суспензия латекса. Для приготовления диагностикумов обычно используют частицы латекса диаметром 0,81…1 мкм. При применении более крупных частиц диаметром 0,22…0,3 мкм затруднен учет реакции и технологический процесс получения диагностикумов резко усложняется, а частиц более 1 мкм хотя не влияет на активность латексных диагностикумов, но существенно увеличивает частоту неспецифических реакций.

Для постановки РАЛ лучше использовать очищенные латексы с гомогенными частицами правильной сферической формы. Густота суспензии латекса обычно составляет 1 %, но может достичь в отдельных случаях 1,3…1,4 %.

3. Антитела. Для сенсибилизации частиц латекса пригодны гипериммунные сыворотки, полученные при иммунизации лабораторных животных (кроликов, крыс, мышей и др.). Повышению специфичности РАЛ и уменьшению числа ложноположительных и перекрестных реакций способствует применение очищенных иммуноглобулиновых фракций.

Методика исследования. Основные этапы постановки РАЛ. В настоящее время РАЛ обычно ставят на стеклянных или полистироловых пластинках, используя коммерческие диагностикумы или препараты. Реже применяют пластинки с лунками для постановки РИГА или пробирочный вариант реакции. Манипуляции выполняют в определенной последовательности.

1. Делают ряд серийных разведений исследуемого материала. Сыворотки крови необходимо предварительно прогреть в течение 30 мин при 56 °С или 20 мин при 60 °С. При постановке РАЛ на пластинках для РИГА при разведении материала используют петли микротитратора. На плоские ровные пластины наносят по одной капле соответствующих разведений.

2. Добавляют к каждому разведению равный объем суспензии сенсибилизированного латекса. Смешивают 1 каплю исследуемого материала и диагностикум, в лунки вносят по 15, 25 или 50 мкл ингредиентов реакции.

При постановке РАЛ в пробирочном варианте используют 0,25 мл исследуемого материала и 0,05 мл (или 0,1 мл) диагностикума.

3. Помещают пластинки на вращающийся столик или в шуттель-аппарат на 3…5 мин, после чего производят регистрацию результатов реакции.

Учет результатов. Независимо от вида диагностикума и количества антител (антигена) в исследуемом материале результаты РАЛ могут быть учтены уже через несколько минут после смешивания реагентов. При наличии в исследуемом образце искомого микроорганизма склеивающиеся частицы латекса образуют агглютинат, хорошо видимый невооруженным глазом. Можно использовать лупы с небольшим увеличением. При отрицательных результатах реакции суспензия латекса остается гомогенно-мутной, без глыбок агглютината и участков просветления. При малой или низкой активности диагностикума, а также невысокой концентрации антигена пластинки лучше инкубировать при 37 °С, что несколько ускоряет образование агглютината.

Результат реакции оценивают по трехбалльной системе:

Ставят несколько контролей: 1) исходное разведение исследуемого материала + суспензия несенсибилизированного латекса (отрицательный контроль); 2) нормальная сыворотка, не содержащая антител + суспензия сенсибилизированного латекса (проверка специфичности диагностикума); 3) гомологичная иммунная сыворотка + суспензия сенсибилизированного латекса (проверка активности диагностикума).

При постановке РАЛ с антительными латексными диагностикумами в контрольных положительной и отрицательных реакциях используют соответствующий антигенсодержащий материал.

Техника приготовления диагностикумов. Сенсибилизация латекса антигенами. Для приготовления антигенного латексного диагностикума желательно иметь в распоряжении растворимые антигены. В этом случае хорошие результаты получают при использовании буферных растворов (например, глицинового или боратного с pH 8,2). В таком буфере готовят раствор антигена в концентрации 2,5…5,0 мг/мл к 1 объему суспензии латекса. Если раствор антигена приготовлен на изотоническом растворе натрия хлорида, то буфер добавляют к смеси латекс — антиген.

Сенсибилизацию проводят в течение 2 ч при 37 °С в термостате или (лучше) на водяной бане. По истечении этого времени сенсибилизированный латекс осаждают центрифугированием в течение 5…10 мин при частоте оборотов 2000…2500 мин -1 и ресуспензируют в этом же буферном растворе до получения 1%-й суспензии.

Сенсибилизация латекса антителами. Суспензию латекса смешивают с равным объемом иммунной сыворотки или очищенной гамма-глобулиновой фракции в соответствующем буферном растворе. Смесь инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре или при 37 °С, центрифугируют в течение 30 мин при частоте оборотов 3…5000 мин -1 и дважды промывают осадок 0,01 М трис-солянокислым буфером с добавлением 200 мг/л поливинилпирролидона. Сенсибилизированный латекс ресуспензируют в этом же буферном растворе с поливинилпирролидоном и 0,05 % азида натрия и хранят в холодильнике при 2…4 °С.

При выборе оптимальной дозировки антител для сенсибилизации латекса следует учитывать, что одна его частица диаметром 0,8 мкм может адсорбировать на своей поверхности до 7,5 ∙ 10 4 молекул гамма-глобулина.

Необходимо отметить, что во многом требуется предварительно эмпирическим путем подбирать оптимальные условия для получения высококачественного латексного диагностикума. Режим сенсибилизации зависит от сорта и размера частиц латекса, pH и вида буферных растворов и ряда других факторов.

Для уменьшения частоты ложноположительных результатов рекомендуется к готовой суспензии сенсибилизированных частиц латекса добавлять нормальную сыворотку того вида животного, который был использован для приготовления гипериммунной сыворотки.

Получение латексных диагностикумов с помощью белка А стафилококка. Применение для изготовления диагностикумов на основе частиц латекса, покрытых белком А стафилококка, позволяет использовать для сенсибилизации латекса любые иммунные сыворотки без какой-либо их предварительной обработки.

Раствор белка А (1 мг/мл) готовят на дистиллированной воде с добавлением 0,05 % азида натрия. Перед применением его разводят в 200 раз 0,1 М глициновым буфером (pH 8,2), содержащим 1 % хлорида натрия. Стандартную коммерческую суспензию латекса разводят в 15 раз изотоническим раствором хлорида натрия, смешивают с равным объемом разведенного раствора белка А, инкубируют при постоянном перемешивании в течение 2…4 ч при 20 °С, а затем 16…18 ч при 4 °С. Частицы латекса, покрытые белком А, осаждают центрифугированием при частоте вращения 6000 мин -1 в течение 30 мин и дважды промывают половинным объемом глицинового буфера с добавлением 0,02 % поливинилпирролидона. Полученную суспензию после добавления 0,05 % азида натрия можно хранить при 4 °С в течение 4 мес.

Иммунную сыворотку разводят до титра глициновым буфером и смешивают с равным объемом суспензии латекса, покрытого белком А. Инкубацию и промывку сенсибилизированного антителами латекса проводят по методике, описанной выше.

Эту же методику можно использовать и для сенсибилизации латекса гамма-глобулиновыми фракциями, выделенными из иммунных сывороток посредством их насыщения сульфатом аммония. В этом случае продолжительность сенсибилизации антителами частиц латекса, покрытых белком А, можно сократить до 2 ч, исключив длительный 2-й этап, проводимый при 4 °С. Приготовленный таким образом диагностический препарат в 4…16 раз активнее обычного антигельного латексного диагностикума.

Практическое использование. К сожалению, в практических ветеринарных лабораториях РАЛ практически не используют, несмотря на то что она по чувствительности и специфичности превосходит многие классические серологические методы.

В настоящее время имеются сообщения об успешном применении РАЛ для диагностики туляремии, бруцеллеза, ряда вирусных инфекций. При использовании данных диагностикумов чувствительность РАЛ на стекле составляет 10 6 м. т./мл, а при постановке в полистироловых пластинках — 1,8 ∙ 10 4 м. т./мл (бруцеллез) и 1,25 ∙ 10 5 м. т./мл (туляремия). Кроме того, разработаны латексные диагностикумы для выявления возбудителей иерсиниоза, псевдотуберкулеза, листериоза, сальмонеллеза. Имеются также сведения об успешных испытаниях специально разработанного для ветеринарии латексного антигенного диагностикума для выявления антител к возбудителю туберкулеза.

Безусловные преимущества РАЛ: 1) простота постановки; 2) отсутствие какого-либо специального оборудования; 3) достаточно высокие чувствительность и специфичность.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Латексная агглютинация

Наборы для идентификации и дифференциации микроорганизмов из клинического материала или из чистой культуры методом латексной агглютинации.

Выпускаются в двух форматах:

1) Жидкие

Латексный реагент представлен в жидкой форме, хранение при + 2-8° С 1 год

Латексный реагент нанесен на реакционную карточку и лиофилизирован, хранение при + 2-25° С до 2 лет

Артикул

Название (русское/английское)

Фасовка

Описание

Бактериальный менингит

Набор Wellcogen на менингококковые инфекции/Wellcogen Bacterial Antigen Kit

Быстрый тест для прямого определения антигенов в жидкостях тела методом латексной агглютинации (цереброспинальной жидкости, сыворотке, моче, крови, культуре с питательной среды):

- Streptococcus гр. B

- H. influenzae тип b

- N. meningitidis групп A, C, Y, W135

- N. meningitides гр. B/E.coli K1.

• Время реакции – 3 минуты
• Чувствительность – 97% *
• Специфичность – более 98%
• В состав набора входят все необходимые компоненты

*для Н. influenzae тип b

Набор Wellcogen для определения H. influenzae b/Wellcogen Haemophilus influenzae b Test Kit

Прямое определение антигенов в жидкостях тела (цереброспинальной жидкости, сыворотке, моче, крови, культуре с питательной среды)

Набор Wellcogen для определения N. meningitidis A, C, Y, W 135/Wellcogen Neisseria meningitidis A, C, Y, W135 Test Kit

Прямое определение антигенов в жидкостях тела (цереброспинальной жидкости, сыворотке, моче, крови, культуре с питательной среды)

Набор Wellcogen для определения N. meningitidis B/E. coli K1/Wellcogen Neisseria meningitidis B/E. coli K1

Прямое определение антигенов в жидкостях тела (цереброспинальной жидкости, сыворотке, моче, крови, культуре с питательной среды)

Набор Wellcogen для определения стрептококков группы B/Wellcogen Strep B Rapid Latex Agglutination Test

Прямое определение антигенов в жидкостях тела (цереброспинальной жидкости, сыворотке, моче, крови, культуре с питательной среды)

Набор Wellcogen для определения Streptococcus pneumoniaе/Wellcogen Streptococcus pneumoniae Test Kit

Прямое определение антигенов в жидкостях тела (цереброспинальной жидкости, сыворотке, моче, крови, культуре с питательной среды)

Streptococcus

Набор для диагностики стрептококков групп A, B, C, D, F и G /PathoDxtra Strep Grouping Kit

Быстрый тест для дифференциации групп стрептококков A, B, C, D, F и G по Лансфильду с первичных чашек с культурой.

• Мгновенная экстракция без инкубации для восстановления
• Работа напрямую с колониями, без разведения в пробирках
• Сокращение времени проявления результатов
• Не требует дополнительных реагентов
• Идентификация всех клинически значимых стрептококков, включая группу D
• Возможность дополнить набор наиболее расходуемыми реагентами

Набор для диагностики стрептококков групп A/PathoDxtra Strep Group A Latex

Предназначен только для использования с набором DR0700M

Набор для диагностики стрептококков групп B/PathoDxtra Strep Group B Latex

Предназначен только для использования с набором DR0700M

Набор для диагностики стрептококков групп C/PathoDxtra Strep Group C Latex

Предназначен только для использования с набором DR0700M

Набор для диагностики стрептококков групп D/PathoDxtra Strep Group D Latex

Предназначен только для использования с набором DR0700M

Набор для диагностики стрептококков групп F/PathoDxtra Strep Group F Latex

Предназначен только для использования с набором DR0700M

Набор для диагностики стрептококков групп G/PathoDxtra Strep Group G Latex

Предназначен только для использования с набором DR0700M

Набор Streptex для диагностики групп стрептококков A, B, C, D, F и G (ферментная экстракция)/Streptex

Набор для идентификации стрептококков групп A, B, C, D, F, G по Лансфильду с использованием ферментной экстракции

Набор для диагностики стрептококков групп A, B, C, F и G (кислотная экстракция)/Streptex Rapid

Набор для идентификации стрептококков групп A, B, C, F, G по Лансфильду с использованием кислотной экстракции

Набор для быстрой диагностики стрептококков групп A, B, C, F и G (кислотная экстракция)/Streptex Acid Extraction Kit

Набор для быстрой кислотной экстракции для использования с Streptex Rapid Latex Agglutination Test для идентификации стрептококков групп A, B, C, F, G по Лансфильду

Набор DrySpot для диагностики Streptococcus pneumonia/Pneumo

Сухой латексный тест для подтверждения Streptococcus pneumoniae в культурах на чашках или положительных культурах крови.

Staphylococcus и MRSA (метициллин-резистентный стафилококк)

Набор DrySpot для идентификации Staphylococcus aureus (MRSA)/Dryspot Staphytect Plus

Сухой латексный тест для идентификации S. aureus после первичного посева

Плазма кроличья для выявления коагулазы (лиофилизированная)/Coagulase Plasma (lyphohilized)

Реагент для выявления фермента коагулазы у стафилококков

Микробиологическая диагностика стрептококковыхинфекцийотражена в схеме 2. Выполняются следующие методы исследования.

Бактериоскопический метод– выявление в мазке из гноя патогенных кокков, располагающихся в виде небольших цепочек. Типичное расположение в виде цепочек характерно для чистых культур стрептококка (рис. 2 цветная вкладка).

Схема 2. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций
Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи.
Микроскопический метод. Выявление грамположительных кокков в виде цепочек в мазках из материала от больного. Бактериологический метод. 1. день. Посев материала на чашки кровяным МПА, пробирки или флаконы с сахарным МПБ. 2 день -учет характера роста колоний (на кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ –равномерное помутнение). В мазке из колоний в окраске по Граму – кокки в виде цепочек. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для получения чистой культуры. Пересев с сахарного МПБ на кровяной МПА	3 день - идентификация выделенной культуры стрептококка, дифференциация основных видов, определение чувствительности к антибиотикам. Выделение чистой культуры с кровяного МПА. 4 день.Заключение о виде стрептококка. Идентификация культуры, выделенной из сахарного МПБ 5 день.Заключение о виде стрептококка, выделенного из сахарного МПБ. Серологический метод Реакция нейтрализации (РН) для определения антистрептолизина-О (гемолизина) и антигиалуронидазы в сыворотке крови больных стрептококковыми инфекциями.

Бактериологический метод.Исследуемый материал засевают на кровяной МПА в чашках Петри. После выращивания в термостате при 37 0 С в течение суток учитывают характер роста колоний (колонии очень мелкие, величиной с булавочную головку, круглые, мутноватые, матовые). Слизистые колонии типичны для свежевыделенных штаммов, стрептококка, матовые – для вирулентных стрептококков с высоким содержанием М-протеина, блестящие – для невирулентных штаммов. На кровяном МПА стрептококки вызывают α–гемолиз (зеленоватая зона вокруг колоний) или β-гемолиз (полностью прозрачная зона гемолиза). Негемолитические стрептококки обычно непатогенны. Из типичных для стрептококка колоний готовят мазок в окраске по Граму и после микроскопии (Streptococcus pyogenes окрашивается по Граму положительно, располагается в виде цепочек) делают пересев в пробирки с сахарным МПБ и кровяным МПА. На 3 день учитывают характер роста (на сахарном МПБ рост стрептококка в виде придонно-пристеночного осадка, сама среда прозрачна), готовят мазок в окраске по Граму и проводят идентификацию выделенной культуры стрептококка по антигенным свойствам. Серогруппу стрептококков определяют в реакциях преципитации, латекс-агглютинации или коагглютинации с целью выявления группоспецифического полисахаридного антигена А, используя группоспецифические сыворотки (обычно групп A, B, C, F, G). Большинство патогенных для человека стрептококков являются β-гемолитическими и относятся к группе A. Серовар выделенной культуры стрептококка выявляют с помощью реакции агглютинации (выявление типового протеинового антигена М, по которому выделяют около 100 сероваров) с типоспецифическими стрептококковыми сыворотками.

Для идентификации β-гемолитических стрептококков применяют PYR-тест (на пирролидониламидопептидазу), CAMP-тест (на белок синергидного гемолиза), тест Фогес-Проскауэра (на образование ацетоина), чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД на диск), галотолерантность (рост в присутствии 6,5% хлорида натрия), гидролиз гиппурата натрия, ферментацию трегалозы, сорбита и т.д. α -гемолитические стрептококки идентифицируют, используя тесты на чувствительность к желчи, оптохину, на гидролиз эскулина и т.д. (табл. 3).

PYR -mecm. В МПБ, содержащий 0,01 % L-пирролидонил- β –нафтиламин, вносят петлю агаровой культу­ры стрептококка, инкубируют при 37 0 С в течение 4 ч. По­ложительная реакция характеризуется появлением ярко-крас­ного окрашивания после внесения 1 капли специального реактива.

Таблица 3 .Дифференциальные признаки стрептококков

Свойства	Микроорганизмы
S. pyogenes	S. agalactiae	Стрептококки групп C и G	S. bovis
Вид гемолиза	Β	β, α	β	α ,
Гидролиз гиппурата натрия	-	+	-	-
CAMP-тест	-	+	-	-
PYR-тест	+	-	-	-
Желчно-эскулиновый тест	-	-	-	+
Рост в солевом МПБ	-	+	-	-
Чувствительность к бацитрацину	+	-	-	-
Чувствительность к сульфаметоксазолу и триметоприму	-	-	+	+

Обозначения:(+) - постоянный признак, (-) – отсутствие признака

Исследование крови.Для выделения гемокультуры посев обычно производят в сахарный бульон. При нали­чии стрептококка на дне флакона появляется хлопьевидный при­донный осадок, а в мазках обнаруживаются длинные цепочки стреп­тококков. Для выделения чистой куль­туры и определения характера гемолиза делают пересев в чашку с кровяным агаром. Через сутки (3-й день исследования) появляют­ся типичные мелкие колонии, окруженные зоной гемолиза. Даль­нейший ход исследования аналогичен описанному выше.

Генодиагностика. Разработан метод ДНК-ДНК-гибридизации для обнаружения специфических фрагментов ДНК стрептококка в исследуемом материале, что дает основание поставить предварительный диагноз стрептококковой инфекции.

Серодиагностика(определение антител к гемолизину – стрептолизину-О) проводится при подозрении на ревматизм. Сущность реакции заключается в нейтрализации антителами сыворотки крови больного гемолитической активности стрептококкового стрептолизина-О. Титр антистрептолизина-О у здоровых людей – до 250 АЕStO. При ревматизме с первых дней болезни титр антистрептолизина-О составляет 500 АЕStO и выше.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

+375 показать номер +375296404126

• Условия оплаты и доставки
• График работы
• Контакты

  Идентификационные латексные тесты высокой производительности

  Готовые к использованию

  Реагенты SLIDEX ® обеспечивают чрезвычайно быструю идентификацию бактерий и идеально подходят для ветеринарных лабораторий.

  Набор реагентов SLIDEX ® предназначен для эффективной и быстрой идентификации бактерий как при прямом посеве, так и при анализе образцов животных.

  Латексные частицы присутствуют на всех реагентах SLIDEX ® , которые покрыты антителами. Различные тестируемые антигены приклеиваются к антителам и вызывают четкую видимую агглютинацию всего за 30 секунд или до нескольких минут. Идентификация производится всего за несколько минут.

  Быстрая диагностика инфекционных заболеваний позволяет фермерам, животноводам и ветеринарным лабораториям осуществлять более эффективные планы действий в случае заражения. Предоставляя надежные результаты в течение нескольких минут, тестовые наборы реагентов SLIDEX ® обеспечивают защиту и безопасность животных и пациентов.

  Быстрота

  • Тестовые наборы SLIDEX ® можно использовать через несколько минут после выделения микроорганизма
  • Получение результатов от 30 секунд до нескольких минут

  Высокая чувствительность и специфичность

  • Надежные результаты испытаний
  • Легкая интерпретация результатов

  Простота в использовании

  • Тестовые наборы готовы к использованию
  • Оптимизированный рабочий процесс

  Наш ассортимент тестовых наборов SLIDEX ® включает в себя тесты для быстрой идентификации.

  Стафилококков

  Тестовые наборы SLIDEX ® для обнаружения метициллин - резистентного золотистого стафилококка (МРЗС)

  Этот тест основан на производстве низкоаффинного пенициллинсвязывающего белка PBP2a.

  • Сенсибилизированный латекс
  • Контроль латекса
  • Экстракционный реагент 1
  • Экстракционный реагент 2
  • Одноразовые карты и палочки для размешивания

  Высокая производительность

  • Чувствительность 99,6%
  • 100% специфичность

  Простой учёт результатов

  • Прозрачные реакции агглютинации

  Быстрота

  • На 24 до 48 часов быстрее, чем при обычных методах скрининга резистентности стафилококков к оксациллину

  Стрептококки

  Тестовый набор SLIDEX ® STREPTO PLUS представляет собой тест латексной агглютинации для идентификации антигенов группы Ланцефильда A, B, C, D, F и G.

  • 6 флаконов-капельниц с латексной суспензией, сенсибилизированной стрептококками групп A, B, C, D, F и G
  • 50 одноразовых карт с 6-тью реакционными полями
  • Положительный контроль
  • Экстракционный фермент
  • 6 x 50 сменных палочек для размешивания
  • 1 флакон-капельница латексной суспензии, сенсибилизированной группой A стрептококки
  • 10 одноразовых карт с 6-тью реакционными полями
  • Положительный контроль
  • · Экстракционный фермент
  • · 50 одноразовых палочек для размешивания

  1 флакон-капельница латексной суспензии, сенсибилизированной группой В стрептококки

  10 сменных лотков с 6-тью реакционными полями

  · 50 одноразовых палочек для размешивания

  Пневмония

  Тестовый набор SLIDEX ® PNEUMO является высокопроизводительным тестом выявления микроорганизмов, который может обнаруживать все серотипы стрептококков пневмонии.

  Пластинчатая реакция агглютинации ставится на гладкой поверхности стекла, фарфора. Поверхность пластинки должна быть тщательно обезжирена, чтобы хорошо растекалась капля сыворотки, физиологического раствора.

  Реакция применяется: 1) для серологической идентификации микробов на этапах бактериологического исследования и для окончательной серологической идентификации выделенных культур микробов кишечного семейства с помощью поливалентных и монорецепторных сывороток; 2) для ускоренной серологической диагностики инфекционных болезней путем обнаружения антител, например при бруцеллезе (реакция Хеддльсона), туляремии.

  Агглютинация на стекле относится к методам экспресс диагностики. V-антиген и иммунную сыворотку берут высококонцентрированными и взаимодействие между ними происходит при регулярном покачивании. Реакция наступает быстро, через несколько минут, что выгодно отличает ее от реак­ции в пробирках.

  Для постановки пластинчатой реакции на стекло наносят каплю цельной или слегка разведенной иммунной сыворотки, к ней добавляют каплю концентрированного антигена, в виде живой культуры, капли перемешивают петлей или легким покачиванием стекла. При положительном результате уже через несколько минут жидкость в капле просветляется, а по краям появляются хлопья склеившихся бактерий. Реакция сопровождается контролем антигена и антитела.

  Существуют и другие варианты постановки реакции агглютинации: капельный, микроскопический, ускоренный по Ноблю.

  Реакция агглютинации отличается высокой чувствительностью. Она положительна даже при содержании 0,1-0,01 мг антител в 1 мл. Чувствительность этой реакции может быть повышена, если увеличить массу и объем реагентов, адсорбируя их на поверхности инертных носителей. Носителями антигена или антител могут быть естествен­ные клетки: эритроциты, лейкоциты, бактериальные клетки, а также созданные искусственно: латекс, полистирол, бентонит, частицы угля. Основное требование, предъявляемое к носителям - возможность прочно соединяться с молекулами антигена или антитела и не давать спонтанной агглютинации. Такая реакция агглютинации называется непрямой агглютинацией. Различают несколько модификаций непрямой агглютинации:

  а) Непрямая или пассивная агглютинация (РНГА, РПГА)

  Кроме того, реакция непрямой гемагглютинации может быть использована дня обнаружения растворимых антигенов с помощью известных антител, адсорбированых на поверхности эритроцитов.

  РНГА по своей чувствительности и специфичности превосходит многие другие серологические реакции.

  Латекс-агглютинация - это реакция, в которой в качестве известного носителя используются частицы латекса. Латекс – водный раствор млечного сока каучуконосных деревьев или синтетических каучуков. Частицы латекса нагружают молекулами антигена или антитела и они приобретают способность склеиваться соответствующими анти­телами или антигенами. Если на латексе адсорбированы растворимые антигены, то эти частицы используются для обнаружения антител в исследуемой сыворотке и наоборот, если на латексе адсорбированы антитела, то частицы используют для обнаружения антигена. Чаще всего, метод используется для определения ревматоидного фактора или HBs-антигена.

  Ставят реакцию на стекле, смешивая нагруженный антителами латекс и исследуемый антиген, при положительной реакции уже через 5 - 10 минут образуются видимые невооруженным глазом агглютинаты, которые затем увеличиваются в размере.

  в) Реакция коагглютинации

  В реакции коагглютинации в качестве инертного носителя используется культура золотистого стафилококка (штамм CowanI). Белок А, находящийся на поверхности оболочки этого стафилококка, способен связывать Fc-фрагмент иммуноглобулина G (Ig G1, G2, G4) оставляя свободными активные центры антитела. Эти центры взаимодействуют с соответствующими антигенами, вызывая склеивание стафи­лококков. Реакция применяется для обнаружения и типирования корпускупярных и растворимых антигенов. Для постановки реакции выпус­кают коммерческие стафилококковые реагенты (т.е. стафилококки нагруженные антителами диагностических иммунных сывороток). К реагенту добавляют 0,01 - 0,1 мл выделенной культуры, перемешивают покачиванием стекла и через 10 - 30 минут инкубации при комнатной температуре учитывают как обычную реакцию агглютинации.

  Историческая справка

  Впервые метод реакции латекс-агглютинации (РЛА) был предложен в 1956 году и использован для определения ревматоидного фактора с помощью полистирольных латексных микросфер с узким распределением частиц по размеру, покрытых гамма-глобулином человека. Сообщалось, что взаимодействие антигенов, находящихся в сыворотке крови пациента, с гамма-глобулином, адсорбированным на поверхности гидрофобных микросфер суспензии, привело к агглютинации полимерных частиц и образованию крупных агломератов, легко различимых невооруженным глазом. В последующие годы метод РЛА получил широкое распространение, как в клинических диагностических тестах, так и в биохимических и иммунологических исследованиях. Особенно широкое применение РЛА наблюдается в инфекционной патологии.

  Описание метода реакции латексной агглютинации

  Реакция латексной агглютинации используется в клинической химии в течение многих лет как простой, быстрый и недорогой метод определения белков, гормонов и других биологически активных соединений. Белки, являясь поливалентными антигенами, вступают в реакцию с антителами с образованием иммунных комплексов, или агглютинатов. Как правило, иммунные комплексы слабо визуализируются не только невооруженным глазом, но и с помощью фотометрических методов. Использование дисперсионных полимеров (латексов), сенсибилизированных антителами или антигенами, позволяет значительно облегчить детекцию реакции агглютинации, которая в этом случае называется реакцией латексной агглютинации.

  Носители для метода реакции латексной агглютинации

  Наиболее часто для получения диагностических препаратов используют полистирольные микросферы, несущие на своей поверхности различные функциональные группы (карбоксильные, эпоксидные, альдегидные и др.) и полиакролеиновые микросферы, содержащие на своей поверхности альдегидные функциональные группы, способные вступать в реакцию с первичными аминогруппами, образуя основание Шиффа Применение инертных синтетических носителей для иммобилизации антител (или антигенов) является широко распространенным методическим подходом в иммуноанализе.

  Полимерные микросферы с узким распределением частиц по размерам и функциональными группами на поверхности представляют большой интерес для биологии и медицины, в частности для использования в качестве носителей биолигандов вместо эритроцитов при создании диагностических тест-систем на различные виды заболеваний. Замена эритроцитов на полимерные микросферы является решением проблем, связанных с недостатками эритроцитарных диагностикумов, а именно:

  • 1)​ эритроциты получают из крови животных, содержание которых трудоемко и дорогостояще
  • 2)​ эритроциты содержат много антигенных детерминант, которые реагируют с компонентами сывороток человека и животных, что обуславливает протекание неспецифических реакций и приводит к ложноположительным результатам
  • 3)​ свойства эритроцитов часто зависят от источника и способа их выделения
  • 4)​ диагностикум на основе клеток одних и тех же животных не дает постоянный титр и после длительного хранения не сохраняет прежнюю степень агглютинации.

  Для замены эритроцитов, полимерные микросферы должны обладать определенными свойствами: скорость седиментации 3 – 8 мм/час, диаметр частиц порядка 5 мкм., агрегативная устойчивость в воде и буферных растворах высокой ионной силы, наличие в поверхностном слое функциональных групп, доступных для ковалентного связывания с функциональными группами белков.

  Одним из преимуществ применения полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов является возможность получения полимерных частиц с заданным комплексом свойств. Для устранения проблем, связанных с применением эритроцитов, используются полимерные микросферы с определенными свойствами:

  • 1)​ монодисперсное распределение по размерам
  • 2)​ сферическая форма
  • 3)​ устойчивость к электролитам в широком интервале pH
  • 4)​ способность присоединять биологические макромолекулы без значительного изменения их функциональной активности
  • 5)​ воспроизводимые свойства и характеристики

  Однородность частиц по размерам позволяет достаточно точно определить площадь поверхности носителя и установить степень ее покрытия биолигандом, кроме того, она обусловливает сходный характер их поведения во время агглютинации, что облегчает “прочтение” результатов реакции латекс-агглютинации(РЛА). Впервые, для создания диагностических тест-систем были использованы полистирольные микросферы. Полистирол, благодаря своей оптической прозрачности, высокой адсорбционной способности, прочности и хорошей воспроизводимости свойств, успешно используется в качестве носителя.

  Главной проблемой полимерных микросфер, используемых при создании диагностикумов является неспецифическая агглютинация(частицы отрицательного контроля образуют ореол из частиц вокруг центра дна лунки) , причины которой и факторы ее вызывающие во многом еще не ясны. Наибольшее распространение в качестве способов уменьшения неспецифического связывания нашли значительное разбавление образцов, добавление детергентов, экранирование поверхности частиц низкомолекулярными белками. Однако применение данных методов чаще всего приводит к уменьшению чувствительности и точности реакции латексной агглютинации.

  При тщательной отработке методики получения латексных диагностикумов, соблюдении оптимальных условий их приготовления и постановки самой реакции, РЛА может приближаться к самым современным иммунологическим методам.

  РЛА сходна с РНГА по принципу сорбции антител на поверхности более крупных частиц.

  Преимущества метода РЛА

  Реакция РЛА — экспресс-метод диагностики инфекционных болезней (время проведения — до 10 мин, возможно обнаружение антигена в небольшом объёме исследуемого материала). Для постановки РЛА используют стеклянные или темнопольные пластины.

  РЛА в качестве сигнального экспресс-теста для выявления антигенов микроорганизмов удобна при использовании в практических лабораториях, а также при проведении массовых обследований. К преимуществам РЛА, как метода серологической диагностики бактериальных и вирусных инфекций, можно отнести следующие моменты:

  • - высокую специфичность и чувствительность;
  • - отсутствие необходимости в сложной аппаратуре для постановки и реакции и регистрации результатов;
  • - сведение до минимума количества компонентов реакции;
  • - возможность получения инертных носителей с заданными характеристиками.

  Относительная дешевизна метода реакции латексной агглютинации (РЛА), простота и возможность постановки теста практически в любых условиях делают его очень удобным как при одиночных, так и при массовых исследованиях даже в небольших клинических мало оборудованных лабораториях.

  Применение метода реакции латексной агглютинации

  РЛА применяют для индикации антигенов Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae типа b( Neisseria meningitidis в СМЖ, выявления стрептококков группы А в мазках из зева, в диагностике сальмонеллёзной инфекции, иерсиниозов и других заболеваний. Чувствительность метода — 1-10 нг/мл (103-106 бактериальных клеток в мл). Недостаток метода — возможность получения артефактов, особенно в присутствии ревматоидных факторов и продуктов фибринолиза плексы с участием комплемента — преципитаты. Простейший пример качественной реакции преципитации — образование непрозрачной полосы преципитации в пробирке на границе наслоения антигена на иммунную сыворотку (реакция кольцепреципитации). Реакцию преципитации проводят в гелях агара, агарозы. Их используют для выявления и изучения свойств разнообразных антигенов и антител.

  Материалы и реагенты для метода реакции латексной агглютинации