Методы микробиологической диагностики брюшного тифа и паратифов а и

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Реакция Видаля. Со второй недели заболевания в крови больных накапливаются антитела против возбудителя инфекции. Для их выявления исследуют сыворотку крови больного в реакции агглютинации. В качестве антигена используют убитые культуры сальмонелл - диагностикумы.

Для постановки реакции Видаля используют сыворотку больного, набор диагностикумов, изотонический раствор натрия хлорида.

Кровь (2-3 мл) из мякоти пальца или локтевой вены собирают в стерильную пробирку и доставляют в лабораторию. В лаборатории пробирку ставят в термостат на 20-30 мин для образования сгустка, затем пастеровской пипеткой обводят сгусток, чтобы отделить от стенки пробирки, и ставят на 30-40 мин на холод. Отделившуюся сыворотку отсасывают и используют для постановки реакции агглютинации с диагностикумами из сальмонелл тифа и паратифов. Для получения сыворотки кровь можно отцентрифугировать.

При возникновении инфекционного процесса - брюшного тифа или паратифов - в организме вырабатываются О- и Н-антитела к одноименным антигенам возбудителя.

О-антитела появляются первыми и исчезают довольно быстро. Н-антитела сохраняются долго. То же самое происходит и при вакцинации, поэтому положительная реакция Видаля с О- и Н-антигенами свидетельствует о наличии заболевания, а реакция только с Н-антигенами может быть и у переболевших (анамнестическая реакция), и у привитых (прививочная). Исходя из этого, реакцию Видаля ставят раздельно с О- и Н-антигенами (диагностикумы).

Так как клинически брюшной тиф и паратифы А и В сходны, то для выявления природы заболевания сыворотку больного испытывают одновременно с диагностикумами из сальмонелл тифа и паратифа А и В.

Реакцию Видаля широко используют, так как она проста и не требует специальных условий.

Поставить реакцию можно двумя способами: капельным и объемным (см. главу 12). В практике чаще используют объемный метод. При постановке линейной реакции агглютинации количество рядов должно соответствовать количеству антигенов (диагностикумы). Возбудителем заболевания считают микроорганизм, диагностикум из которого агглютинировался сывороткой больного. Иногда отмечают групповую агглютинацию, так как возбудители тифа и паратифов обладают общими групповыми антигенами. В этом случае положительным считают результат реакции в ряду, в котором агглютинацию отмечают в большем разведении сыворотки (табл. 36).

Таблица 36. Возможный результат реакции агглютинации

Примечание. В практике реакцию Видаля ставят с четырьмя диагностикумами: брюшного тифа "О" и "Н", а паратифов А и В - с диагностикумами "ОН".

Если агглютинация возникает только в небольших разведениях сыворотки - 1:100, 1:200, то для отличия реакции при заболевании от прививочной или анамнестической прибегают к повторной постановке реакции агглютинации через 5-7 дней. У больного титр антител повышается, а у привитого или переболевшего не изменяется. Таким образом, нарастание титра антител в сыворотке крови служит показателем заболевания.

В ответ на внедрение в организм возбудителей брюшного тифа, обладающих Vi-антигеном, в крови больного появляются Vi-агглютинины. Их определяют со 2-й недели болезни, но титр их обычно не превышает 1:10. Обнаружение Vi-антител связывают с наличием в организме возбудителей брюшного тифа, поэтому определение этих антител имеет большое эпидемиологическое значение, так как позволяет выявить бактерионосителей.

Реакция Vi-гемагглютинации. Это наиболее чувствительная реакция для выявления антител.

Принцип реакции заключается в том, что эритроциты человека (I группы) или барана после специальной обработки могут адсорбировать на своей поверхности Vi-антиген и приобретают при этом способность агглютиниповаться соответствующими Vi-антителами.

Эритроциты с адсорбированными на поверхности антигенами называют эритроцитарными диагностикумами.

Для постановки реакции Vi-гемагглютинации берут:

1) сыворотку крови больного (1-2 мл); 2) эритроцитарный сальмонеллезный Vi-диагностикум; З) Vi-сыворотку; 4) О-сыворотку; 5) изотонический раствор натрия хлорида.

Реакцию ставят в агглютинационных пробирках или в пластмассовых пластинах с лунками.

Кровь у больного берут так же, как для реакции Видаля. Получают сыворотку. Из сыворотки готовят двукратные серийные разведения, начиная с 1:10 до 1:160.

По 0,5 мл каждого разведения вносят в лунку и прибавляют по 0,25 мл эритроцитарного диагностикума. Реакцию ставят в объеме 0,75 мл.

Контролем служат: 1) стандартная агглютинирующая монорецепторная сыворотка + диагностикум - реакция должна быть положительной до титра сыворотки; 2) диагностикум в изотоническом растворе натрия хлорида (контроль) - реакция должна быть отрицательной.

Содержимое лунок тщательно перемешивают, ставят в термостат на 2 ч и оставляют при комнатной температуре до следующего дня (на 18-24 ч).

Учет начинают с контроля. Реакцию оценивают в зависимости от степени агглютинации диагностикума.

Результаты учитывают по четырехкрестной системе:

++++ эритроциты полностью агглютинированы - осадок на дне лунки в виде "зонтика";

+++ "зонтик" меньше, не все эритроциты агглютинировались;

++ "зонтик" маленький, на дне лунки имеется осадок из неагглютинированных эритроцитов;

- реакция отрицательная; эритроциты не агглютинировались и осели на дно лунки в виде пуговки.

1. В какой период заболевания ставят реакцию Видаля?

2. Какие ингредиенты необходимы для постановки реакции Видаля?

3. С какими диагностикумами ставят реакцию Видаля?

4. Какая из серологических реакций является самой чувствительной при диагностике тифопаратифозных инфекций?

5. Каким диагностикумом пользуются при постановке реакции Vi-гемагглютинации?

6. Какой сывороткой определяют наличие Vi-антигена у исследуемой культуры?

7. Какое значение имеет определение Vi-фаготипа?

Возьмите у преподавателя О- и Н-диагностикумы из сальмонелл тифа, паратифа А и паратифа В и сыворотку больного. Поставьте реакцию Видаля.

Питательные среды

Среды ЭМС, Плоскирева, висмут-сульфитный агар выпускаются медицинской промышленностью в виде сухого порошка. Их готовят согласно указаниям на этикетке: отвешивают определенное количество порошка, наливают соответствующее количество воды, кипятят и разливают в стерильные чашки Петри.

Среда Рассела. В 950 мл дистиллированной воды добавляют 40 г сухой питательной среды и прибавляют 5 г питательного агара. Нагревают до кипения и растворения порошков. В 50 мл дистиллированной воды растворяют 1 г х. ч. глюкозы и добавляют к приготовленной смеси. Среду разливают в стерильные пробирки по 5-7 мл, стерилизуют текучим паром (2 дня по 2 мин) и скашивают так, чтобы оставался столбик. Среду Рассела с маннитом и сахарозой готовят так же.

Среда Олькеницкого из сухого агара. 2,5 г сухого питательного агара расплавляют в 100 мл дистиллированной воды. В остуженный до 50° С агар прибавляют все ингредиенты, указанные в рецептуре (этикетке). Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют текучим паром (3 дня по 20 мин) и затем скашивают. Готовая среда должна быть бледно-розового цвета.

Лабораторная диагностика. Самым ранним и основным методом диагностики брюшного тифа и паратифов является бактериологический — получение гемокультуры или миелокультуры. С этой целью исследуют кровь или пунктат костного моз­га. Кровь лучше засевать на среду Рапопорт (желчный бульон с добавлением глюко­зы, индикатора и стеклянного поплавка) в соотношении 1: 10 (на 10 мл среды 1 мл крови). Посев следует инкубировать при температуре 37 С С не менее 8 дней, а с уче­том возможного наличия L-форм — до 3—4 нед.

Для идентификации выделенной культуры сальмонелл используют (с учетом их биохимических свойств) диагности­ческие адсорбированные сыворотки, содержащие антитела к антигенам 02 (S. para­typhi А), 04 (S. paratyphi В) и 09 (S. typhi). Если выделенная культура S. typhi не аг­глютинируется 09-сывороткой, ее необходимо проверить с Vi-сывороткой.

Бактериологическое исследование испражнений, мочи и желчи проводят для подтверждения диагностики, контроля бактериологического выздоровления при выписке реконвалесцентов и для диагностики бактерионосительства. В этом случае материал предварительно засевают на среды обогащения (среды, содержащие хими­ческие вещества, например селенит, которые угнетают рост Е. coli и других предста­вителей микрофлоры кишечника, но не угнетают роста сальмонелл), а затем со сре­ды обогащения — на дифференциально-диагностические среды (Эндо, висмут-суль­фит-агар) с целью выделения изолированных колоний и получения из них чистых культур, идентифицируемых по указанной выше схеме. Для обнаружения О- и Vi- антигенов в сыворотке крови и испражнениях больных могут быть использованы РСК, РПГА с антительным диагностикумом, реакции коагглютинации, агрегат-гем- агглютинации, ИФМ. Для ускоренной идентификации S. typhi перспективно приме­нение в качестве зонда фрагмента ДНК, несущего ген Vi-антигена (3—4 ч).

Наиболее надежной и специфической является последняя реакция (Vi-гемагглютинации).

Обнаружены 3 необычных мутанта S. typhi: Vi-I — R-форма, клетки лишены Н- и О-антигенов. но стойко сохраняют Vi-антиген; 0-901 - лишен Н- и Vi-антигенов; Н-901 — содержит О- и Н-антигены, но лишен Vi-антигена, Все три антигена: О-, Н- и Vi— имеют выраженные иммуногенные свойства. Наличие Vi-антигенов позво­ляет подвергать культуры S. typhi фаготипированию. Чувствительность их к соответствующим фагам является стабильным признаком, поэтому фаготипирование имеет важное эпидемиологическое значение.

Разработаны также схемы фаготипирования S. paratyphi А и S. paratyphi В, по ко­торым они разделяются на десятки фаготипов. Существенно, что фаготипы сальмо­нелл могут ни по каким другим признакам не отличаться друг от друга.

Серологический ме­тод обнаружения 0- и Н- антител в РПГА.

8. Бактерионосительство при брюшном тифе и методы ого выявлении. Особенности антигенного строении возбудители брюшного тифа и его фаготипирование.

Примерно 5 % переболевших становятся хроническими носителями сальмонелл тифа или паратифов. Известное значение в формировании носительства играют местные воспалительные процессы в желчевыводящих (иногда в мочевыводящих) путях, которые часто возникают в связи с тифо-паратифозными инфекциями или обостряются в результате этих инфекций. Однако не менее важную роль в формиро­вании длительного носительства сальмонелл брюшного тифа и паратифов А и В играет L-трансформация их. L-формы сальмонелл утрачивают Н-, частично 0- и Vi-антигены, располагаются, как правило, внутриклеточно (внутри макрофагов костного мозга), поэтому становятся не доступными ни для химиопрепаратов, ни для антител и могут длительно персистировать в организме переболевшего человека. Возвращаясь в исходные формы и полностью восстанавливая свою антигенную структуру, сальмонеллы вновь становятся вирулентными, вновь проникают в желч­ные ходы, вызывают обострение процесса бактерионосительства, выделяются с ис­пражнениями, а такой носитель становится источником заражения для окружаю­щих. Не исключено также, что формирование бактерионосительства зависит от ка­кого-то дефицита иммунной системы.

Антигенное строение. Сальмонеллы имеют О- и Н-антигены, По О-антигенам они разделяются на большое количество серогрупп, а по Н-антигенам — на серотипы. S. typhi, S. paratyphi А и S. paratyphi В отличаются друг от друга как по О-антигенам (относятся к разным серогруппам), так и по Н-антигенам..

S. typhi помимо О- и Н-антигенов имеет еще один поверхностный антиген, который они назвали антигеном вирулент­ности (Vi-антигеном). По химической природе Vi-антиген отличается от О- и Н-ан­тигенов, он состоит из трех различных фракций, но его основу составляет сложный полимер N-ацетилгалактозаминоуроновая кислота с м, м. 10 МД.

Обнаружены 3 необычных мутанта S. typhi: Vi-I — R-форма, клетки лишены Н- и О-антигенов. но стойко сохраняют Vi-антиген; 0-901 - лишен Н- и Vi-антигенов; Н-901 — содержит О- и Н-антигены, но лишен Vi-антигена, Все три антигена: О-, Н- и Vi— имеют выраженные иммуногенные свойства. Наличие Vi-антигенов позво­ляет подвергать культуры S. typhi фаготипированию. Чувствительность их к соответствующим фагам является стабильным признаком, поэтому фаготипирование имеет важное эпидемиологическое значение.

Разработаны также схемы фаготипирования S. paratyphi А и S. paratyphi В, по ко­торым они разделяются на десятки фаготипов. Существенно, что фаготипы сальмо­нелл могут ни по каким другим признакам не отличаться друг от друга.

9. Микроорганизмы - возбудители пищевых отравлений. Пищевые отравлении, обусловленные стафилококками. Типы энтеротоксинов, их свойства, способы выявления.

Пища нередко является причиной отравлений, природа которых может быть са­мой различной.

Наиболее простая классификация пищевых отравлений такова: различают пище­вые отравления немикробного и микробного происхождения.

Пищевые отравления микробного происхождения подразделяют на 2 группы: пищевые интоксикации и пищевые токсикоинфекции.

Пищевые интоксикации — отравления, обусловленные исключительно токсина­ми микроорганизмов. Они могут возникать и в тех случаях, когда живые возбудите­ли в пищевом продукте, подвергнутом термической обработке, отсутствуют.

Пищевые токсикоинфекции возникают только в связи с употреблением в пищу продуктов, обильно зараженных бактериями.

Токсикоинфекции являются следствием массивного обсеменения пищевого про­дукта живыми возбудителями. Для пищевых токсикоинфекций существует только один путь передачи — через пищу.

Пищевые токсикоинфекции могут вызывать представители по крайней мере пя­ти семейств бактерий:

Enterobacteriaceae (роды - Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, Hafnia, Enterobacter, Citrobacter и др.),

Vibrionaceae (V. parahaemolyti- cus),

Streptococcaceae (протеолитические варианты стрептококков серогруппы D),

Bacillaceae — роды Bacillus (В. cereus),

Clostridium (С. perfringens, cepo- типы A, D, F; C. botulinum, серотипы А, В, С, E, F).

Инфицирование стафилококками пи­щевых продуктов — частая причина пищевых отравлений.

Основным методом диагностики пищевых токсикоинфекций является бактерио­логический. Он применяется с учетом биологии возможного возбудителя (грамот­рицательные и грамположительные палочки, стрептококки, бациллы, клостридии). Материалом для исследований служат испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, кровь, продукты, послужившие причиной отравления. Обращают внимание на обнаружение большого количества бактерий в продукте, таких же бактерий в выделениях из кишечника и желудка, в том числе от нескольких человек при групповом отравлении.

Подтверждением диагноза являет­ся обнаружение в сыворотке крови переболевших людей (через 1—2 нед.) антител к возбудителю.

10. Сальмонеллы - возбудители острых гастроэнтеритов. Классификация сальмонелл. Методы лабораторной диагностики сальмомеллезов.

Сальмонеллы являются не только основными возбудителями пищевых токсикоинфекций, но и часто причиной своеобразных диарей — сальмонеллезов.

Ключевые признаки рода Salmonella следующие: короткие грамотрицатель­ные палочки с закругленными концами, длиной 1,5—4,0 мкм, в большинстве случа­ев подвижные (перитрихи), спор и капсул не имеют, образуют при ферментации глюкозы кислоту и газ (за исключением S. typhi и некоторых других серотипов), имеют лизин- и орнитиндекарбоксилазы, не имеют фенилаланиндезаминазы, образуют H₂S.

Классификация. Род Salmonella включает единственный вид S. enteritica с семью основными подвидами: S. choleraesuis, S. salamae, S. ari­zonae, S. diarizonae, S. houtenae, S. bongori, S. indica, которые различаются по ряду биохимических признаков

Серологическая классификация сальмонелл по Уайту и Кауффманну.

У сальмонелл имеются О-, Н- и К-антигены. Обнаружено 65 различных О-антигенов. Они обозначаются арабскими цифрами от 1 до 67. По О-антигену сальмонел­лы разделены на 50 серологических групп (A—Z, 51—65).

У сальмонелл различают два типа Н-антигенов: I фаза и II фаза. Обнаружено более 80 вариантов Н-антигенов I фазы. По Н-антигенам серогруппы разделяют на серотины.

Основной метод диагностики сальмонеллезной ин­фекции — бактериологический. Материалом для исследования служат испражнения, рвотные массы, кровь, промывные воды желудка, моча, послужившие причиной отрав­ления продукты. Особенности бактериологической диагностики сальмонеллезов:

использование сред обогащения (селенитовой, магниевой), в особенности при исследовании испражнений;

для обнаружения сальмонелл пробы следует брать из последней, более жид­кой, части испражнений (верхнего отдела тонкого кишечника);

соблюдать соотношение 1: 5 (одна часть испражнений на 5 частей среды);

в связи с тем, что S. arizonae и S. diarizonae ферментируют лактозу, использо­вать в качестве дифференциально-диагностической не только среду Эндо, но и вис­мут-сульфит-агар, на котором колонии сальмонелл приобретают черный (некото­рые — зеленоватый) цвет;

для посева крови использовать среду Рапопорт;

использование для предварительной идентификации колоний 01-сальмонеллезного фага.

для окончательной идентификации выделенных культур вначале используют поливалентные адсорбированные О- и Н-сыворотки, а затем — соответствующие моновалентные О- и Н-сыворотки.

Для быстрого обнаружения сальмонелл могут быть использованы поливалентные иммунофлуоресцентные сыворотки. Для выявления антител в сыворотке крови боль­ных и переболевших используется РПГА с применением поливалентных эритроцитар- ных диагностикумов, содержащих полисахаридные антигены серогрупп А, В, С, D и Е.