Постановка рнга при тифе

Утверждаю

Начальник Главного управления карантинных инфекций Министерства здравоохранения СССР В.П.Сергиев 29 февраля 1980 года

Методические рекомендации разработаны в лаборатории брюшного тифа и прочих сальмонеллезов Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии Министерства здравоохранения СССР (Ю.Я.Тендетник). Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Министерства здравоохранения СССР.

С целью улучшения диагностики брюшного тифа, паратифов и других сальмонеллезов, а также при проведении эпидемиологического анализа и выявлении источников инфекции наряду с бактериологическим методом (который является основным) следует применять серологические исследования и, в частности, выявлять в сыворотке крови антитела к соответствующим возбудителям.

В настоящее время недостаточно ограничиваться определением общего титра антител, поскольку последние неоднородны по своим свойствам и относятся к 5 классам иммуноглобулинов - IgM, IgG, IgA, IgD и IgE. Наибольшее диагностическое значение имеют lgM-антитела (с константой седиментации 19S) и IgG-антитела (с константой седиментации 7S). Нормальные (так называемые неспецифические), анамнестические и прививочные антитела к O-антигенам тифозных, паратифозных и др. сальмонеллезных бактерий принадлежат в основном к lgM-антителам. Эти же антитела появляются первыми на самой ранней стадии заболевания, но к концу первой недели болезни начинают заметно нарастать lgG-антитела. Такая же закономерность отмечается и в отношении образования Н-антител, однако их титр достигает максимума позже, чем титр O-антител. При брюшном тифе, кроме O- и H-антител, образуются еще Ви-антитела, основная масса которых в разгар болезни относится к IgG и IgA. У переболевших, не ставших бактерионосителями, уровень как IgG, так и lgM-антител постепенно снижается, но сохраняются в относительно высоком титре в течение нескольких недель, а иногда и больше. При формировании острого и хронического бактерионосительства, как правило, в сыворотках преобладают lgG-антитела, тогда как у транзиторных бактерионосителей определяются практически только lgM-антитела.

Лабораторное оснащение методики. Аппаратура, диагностические препараты, стекло, химические реактивы и др.

1. Термостат любого типа (жидкостный или воздушный) для поддержания температуры 37+/-1,0°С.

2. Баня водяная лабораторная любого типа для поддержания температуры 56+/-1°С.

3. рН-метр любой системы со стеклянными или каломельными электродами для измерения рН раствора в пределах 1-10+/-0,1 рН.

4. Весы лабораторные с погрешностью взвешивания не более 0,001 г по ГОСТ 19491-74. Удобны весы торзионные типа ВТ-500.

5. Шприц типа "Рекорд" (объем 1 мл) непрерывного действия Ш-19, ТУ-64-1-884-72*.
________________
* Документ в информационных продуктах не содержится. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

6. Иглы трубчатые инъекционные к шприцу типа "Рекорд" с коротким срезом N 1060, размер 1,0х60 мм, или N 1090, размер 1,0х90 мм. Допустимо использование игл с отверстием не менее 0,8 мм.

7. Диагностикумы сальмонеллезные "O" эритроцитарные жидкие и сухие, ТУ-42 КВС 14 119-77, Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии МЗ РСФСР. Допустимо использование аналогичных диагностикумов других институтов.

8. Эритроцитарный Ви-диагностикум, МРТУ 42 N 15-64, Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии МЗ РСФСР.

9. H-диагностикумы сальмонеллезные эритроцитарные формализированные, ТУ 42 КВС 89-76, Московского научно-исследовательского института вакцин и сывороток им.Мечникова МЗ СССР или Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии МЗ РСФСР. В случае отсутствия эритроцитарных H-диагностикумов допустимо использование сальмонеллезных H-монодиагностикумов корпускулярных бактериальных, МРТУ 42 N 24-64, Ташкентского научно-исследовательского института вакцин и сывороток или других предприятий.

10. Сыворотки иммунные стандартные с известным титром антител. Приложены к каждой упаковке соответствующего диагностикума.

11. Сыворотка крови нормальная сухая от различных видов лабораторных животных (кролики, крысы, мыши и др.), ТУ 42 КВС 144-78, Московского научно-исследовательского института вакцин и сывороток им.Мечникова МЗ СССР. Допустимо использование любой нормальной сыворотки иного происхождения при условии отсутствия в ней антител к сальмонеллезным O-, Ви- и H-антигенам в титре 1:100.

12. Планшеты пластмассовые с лунками (для иммунологических реакций) из метаметилкрилата Ленинградского завода "Медполимер", ТУ 64-2-278-79. Допустимо использование других планшетов подобного типа.

13. Пипетки стеклянные мерные на 1, 2, 5 и 10 мл по ГОСТ 20292-74.

Реакция Видаля. Со второй недели заболевания в крови больных накапливаются антитела против возбудителя инфекции. Для их выявления исследуют сыворотку крови больного в реакции агглютинации. В качестве антигена используют убитые культуры сальмонелл - диагностикумы.

Для постановки реакции Видаля используют сыворотку больного, набор диагностикумов, изотонический раствор натрия хлорида.

Кровь (2-3 мл) из мякоти пальца или локтевой вены собирают в стерильную пробирку и доставляют в лабораторию. В лаборатории пробирку ставят в термостат на 20-30 мин для образования сгустка, затем пастеровской пипеткой обводят сгусток, чтобы отделить от стенки пробирки, и ставят на 30-40 мин на холод. Отделившуюся сыворотку отсасывают и используют для постановки реакции агглютинации с диагностикумами из сальмонелл тифа и паратифов. Для получения сыворотки кровь можно отцентрифугировать.

При возникновении инфекционного процесса - брюшного тифа или паратифов - в организме вырабатываются О- и Н-антитела к одноименным антигенам возбудителя.

О-антитела появляются первыми и исчезают довольно быстро. Н-антитела сохраняются долго. То же самое происходит и при вакцинации, поэтому положительная реакция Видаля с О- и Н-антигенами свидетельствует о наличии заболевания, а реакция только с Н-антигенами может быть и у переболевших (анамнестическая реакция), и у привитых (прививочная). Исходя из этого, реакцию Видаля ставят раздельно с О- и Н-антигенами (диагностикумы).

Так как клинически брюшной тиф и паратифы А и В сходны, то для выявления природы заболевания сыворотку больного испытывают одновременно с диагностикумами из сальмонелл тифа и паратифа А и В.

Реакцию Видаля широко используют, так как она проста и не требует специальных условий.

Поставить реакцию можно двумя способами: капельным и объемным (см. главу 12). В практике чаще используют объемный метод. При постановке линейной реакции агглютинации количество рядов должно соответствовать количеству антигенов (диагностикумы). Возбудителем заболевания считают микроорганизм, диагностикум из которого агглютинировался сывороткой больного. Иногда отмечают групповую агглютинацию, так как возбудители тифа и паратифов обладают общими групповыми антигенами. В этом случае положительным считают результат реакции в ряду, в котором агглютинацию отмечают в большем разведении сыворотки (табл. 36).

Таблица 36. Возможный результат реакции агглютинации

Примечание. В практике реакцию Видаля ставят с четырьмя диагностикумами: брюшного тифа "О" и "Н", а паратифов А и В - с диагностикумами "ОН".

Если агглютинация возникает только в небольших разведениях сыворотки - 1:100, 1:200, то для отличия реакции при заболевании от прививочной или анамнестической прибегают к повторной постановке реакции агглютинации через 5-7 дней. У больного титр антител повышается, а у привитого или переболевшего не изменяется. Таким образом, нарастание титра антител в сыворотке крови служит показателем заболевания.

В ответ на внедрение в организм возбудителей брюшного тифа, обладающих Vi-антигеном, в крови больного появляются Vi-агглютинины. Их определяют со 2-й недели болезни, но титр их обычно не превышает 1:10. Обнаружение Vi-антител связывают с наличием в организме возбудителей брюшного тифа, поэтому определение этих антител имеет большое эпидемиологическое значение, так как позволяет выявить бактерионосителей.

Реакция Vi-гемагглютинации. Это наиболее чувствительная реакция для выявления антител.

Принцип реакции заключается в том, что эритроциты человека (I группы) или барана после специальной обработки могут адсорбировать на своей поверхности Vi-антиген и приобретают при этом способность агглютиниповаться соответствующими Vi-антителами.

Эритроциты с адсорбированными на поверхности антигенами называют эритроцитарными диагностикумами.

Для постановки реакции Vi-гемагглютинации берут:

1) сыворотку крови больного (1-2 мл); 2) эритроцитарный сальмонеллезный Vi-диагностикум; З) Vi-сыворотку; 4) О-сыворотку; 5) изотонический раствор натрия хлорида.

Реакцию ставят в агглютинационных пробирках или в пластмассовых пластинах с лунками.

Кровь у больного берут так же, как для реакции Видаля. Получают сыворотку. Из сыворотки готовят двукратные серийные разведения, начиная с 1:10 до 1:160.

По 0,5 мл каждого разведения вносят в лунку и прибавляют по 0,25 мл эритроцитарного диагностикума. Реакцию ставят в объеме 0,75 мл.

Контролем служат: 1) стандартная агглютинирующая монорецепторная сыворотка + диагностикум - реакция должна быть положительной до титра сыворотки; 2) диагностикум в изотоническом растворе натрия хлорида (контроль) - реакция должна быть отрицательной.

Содержимое лунок тщательно перемешивают, ставят в термостат на 2 ч и оставляют при комнатной температуре до следующего дня (на 18-24 ч).

Учет начинают с контроля. Реакцию оценивают в зависимости от степени агглютинации диагностикума.

Результаты учитывают по четырехкрестной системе:

++++ эритроциты полностью агглютинированы - осадок на дне лунки в виде "зонтика";

+++ "зонтик" меньше, не все эритроциты агглютинировались;

++ "зонтик" маленький, на дне лунки имеется осадок из неагглютинированных эритроцитов;

- реакция отрицательная; эритроциты не агглютинировались и осели на дно лунки в виде пуговки.

1. В какой период заболевания ставят реакцию Видаля?

2. Какие ингредиенты необходимы для постановки реакции Видаля?

3. С какими диагностикумами ставят реакцию Видаля?

4. Какая из серологических реакций является самой чувствительной при диагностике тифопаратифозных инфекций?

5. Каким диагностикумом пользуются при постановке реакции Vi-гемагглютинации?

6. Какой сывороткой определяют наличие Vi-антигена у исследуемой культуры?

7. Какое значение имеет определение Vi-фаготипа?

Возьмите у преподавателя О- и Н-диагностикумы из сальмонелл тифа, паратифа А и паратифа В и сыворотку больного. Поставьте реакцию Видаля.

Питательные среды

Среды ЭМС, Плоскирева, висмут-сульфитный агар выпускаются медицинской промышленностью в виде сухого порошка. Их готовят согласно указаниям на этикетке: отвешивают определенное количество порошка, наливают соответствующее количество воды, кипятят и разливают в стерильные чашки Петри.

Среда Рассела. В 950 мл дистиллированной воды добавляют 40 г сухой питательной среды и прибавляют 5 г питательного агара. Нагревают до кипения и растворения порошков. В 50 мл дистиллированной воды растворяют 1 г х. ч. глюкозы и добавляют к приготовленной смеси. Среду разливают в стерильные пробирки по 5-7 мл, стерилизуют текучим паром (2 дня по 2 мин) и скашивают так, чтобы оставался столбик. Среду Рассела с маннитом и сахарозой готовят так же.

Среда Олькеницкого из сухого агара. 2,5 г сухого питательного агара расплавляют в 100 мл дистиллированной воды. В остуженный до 50° С агар прибавляют все ингредиенты, указанные в рецептуре (этикетке). Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют текучим паром (3 дня по 20 мин) и затем скашивают. Готовая среда должна быть бледно-розового цвета.

РСК с целью раздельного определения IgM и IgG

Реакции Вассермана (серодиагностика сифилиса)

РСК с целью серодиагностики сыпного тифа

Реакция агглютинации по Видалю с целью серодиагностики брюшного тифа

Для постановки реакции берут:

1) сыворотку исследуемого больного для определения в ней
антител;

2) О - и Н-диагноста кумы бактерий брюшного тифа, паратифа А и паратифа В;

3) физиологический раствор.

Кровь для получения сыворотки берут в количестве—15—20 капель путем укола мякоти пальца или 2 —3 мл при помощи венепункции.

Дают крови свернуться в термостате в течение 30—60 минут, затем простерилизованной петлей обводят сгусток, отделяя его от стенки пробирки, и дают отстояться сыворотке на холоду до образования над сгустком прозрачного слоя. Сыворотку помещают пипеткой в отдельную пробирку. Первое разведение (1:50) делают при помощи пипетки—0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физиологического раствора. Дальнейшие разведения (1:100— 1:200 — 1 : 400—1:800) готовят по обычной схеме.

Берут 6 рядов пробирок по 6 пробирок в каждом. По 1 мл сыворотки разведения 1: 100 наливают в первую пробирку каждого ряда, 1: 200 — во вторую, 1 : 400 — в третью и т. д.; в шестую, контрольную, пробирку наливают 1 мл физиологического раствора.

Во все пробирки первого ряда добавляют по 1—2 капли брюшнотифозного Н-диагностикума; в пробирки второго ряда — брюшнотифозный 0-диагностикум; в пробирки третьего я четвертого ряда добавляют А-паратифозный, Н - и 0-диагностикумы, а в 5-й и 6-й ряд— В-паратифозный H - и 0-диагностикум. Пробирки ставят в термостат на 2 часа, отмечают результат реакции, затем оставляют при комнатной температуре на сутки; после этого срока дают заключение об окончательном результате реакции.

Возбудителем заболевания считается тот микроб, который агглютинируется сывороткой больного. Реакция считается положителыной, если агглютинация произошла хотя бы в первой пробирке с разведением 1: 100; обычно она наступает в больших разведениях. Если происходит групповая агглютинация с двумя или с тремя антигенами, то за возбудителя болезни принимается тот микроб, с которым произошла агглютинация в наиболее высоком разведении сыворотки.

Тип реакции - реакция связывания комплемента.

Исследуемый материал - парные сыворотки крови больного (сыворотки одного и того же больного, взятые у него с временным промежутком не менее 5-7 дней).

Диагностический препарат - сыпнотифозный антиген для РСК.

Дополнительные ингредиенты реакции: комплемент в рабочей дозе; гемолитическая сыворотка в рабочей дозе; эритроциты барана (3 % взвесь).

Положительная реакция - задержка гемолиза; отрицательная - гемолиз.

Диагностическим критерием является нарастание титра антител не менее, чем в 4 раза (во второй сыворотке по сравнению с первой).

Обычно реакцию применяют для ретроспективной диагностике.

В данном случае. (результат и вывод).

Тип реакции: РСК.

Исследуемый материал: сыворотка обследуемого.

1. Неспецифический кардиолипиновый АГ (антиген) для реакции Вассермана - спиртовая липидная вытяжка из миокарда быка, обогащенная холестерином.

2. Специфический ультраозвученный трепонемный АГ – содержит АГ культуральных трепонем, разрушенных ультразвуком.

Положительная реакция - задержка гемолиза; отрицательная - гемолиз.

Качественный метод - сыворотку обследуемого вносят в 2 лунки, добавляют соответственно АГ 1 и АГ 2, а затем в обе лунки - дополнительные ингредиенты реакции. Применение: отбор лиц для постановки количественной реакции Вассермана.

В данном случае обследованы пациенты . (результат, вывод).

Количественный метод - диагностика сифилиса, контроль эффективности терапии. Готовят разведения положительной сыворотки (по качественной реакции). К каждому разведению добавляют трепонемный ультраозвученный АГ (АГ2) и дополнительные ингредиенты реакции. Положительный результат - ЗГ (задержка гемолиза), отрицательный - Г (гемолиз).

Результат интерпретируют, основываясь на количестве антител.

В данном случае. (результат и вывод).

Тип реакции - реакция связывания комплемента.

Исследуемый материал - сыворотка крови больного (нативная и обработанная меркаптоэтанолом).

Диагностический препарат - известный антиген для РСК.

Положительная реакция - задержка гемолиза; отрицательная - гемолиз.

Принцип метода: при обработке сыворотки меркаптоэтанолом разрушаются IgM.

Следовательно, с обработаной сывороткой реакция идет только за счет IgG.

Постановка реакции: готовят разведения нативной и обработанной сывороток, добавляют диагностический препарат и дополнительные ингредиенты реакции.

Трактовка результатов: если с обработанной сывороткой реакция идет практически таком же титре, как с необработанной, значит она содержит преимущественно IgG Если в обработанной сыворотке титр антител резко снизился по сравнению с необработанной, значит она содержит преимущественно IgM.

В данном случае. (результат и вывод).

Тип реакции - реакция непрямой гемагглютинации.

Исследуемый материал - сыворотка крови обследуемого.

Диагностический препарат - Vi-эритроцитарный диагностикум (взвесь в физиологическом растворе эритроцитов барана с нагруженными на них Vi - антигенами S.typhi ).

Принцип реакции: к разведениям сыворотки обследуемого добавляют Vi-эритроцитарный диагностикум.

Положительный результат – гемагглютинат ("зонтик"); отрицательный результат - плотный осадок эритроцитов на дне лунки ("пуговка").

Диагностический тигр реакции 1/ 40.

Применение: отбор лиц, имеющих титр антител к Vi – антигенам S.typhi выше диагностического.

Трактовка результатов: лица с положительной реакцией в титре выше, чем 1/40 считаются подозрительными на бактерионосительство S.typhi и подлежат бактериологическому обследованию на наличие S.typhi в кале, моче и желчи.

В данном случае. (результат и вывод).

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Возбудителями брюшного тифа и паратифов (А, В) являются бактерии рода Salmonella, в состав которого входят два вида: Salmonella enterica с 6 подвидами (включая возбудители брюшного тифа, паратифов, сальмонеллезов – всего более 2400 сероваров) и Salmonellabongori(редко встречающиеся сальмонеллы).Возбудитель брюшного тифа обозначается как Salmonellaсеровара Typhi (Salmonella entericaspp. enterica ser. typhi, прежнее название Salmonella typhi), паратифа А — Salmonellaсеровара ParatyphiA, паратифа В — Salmonellaсеровара Paratyphi В.

Методы микробиологической диагностики брюшного тифа и паратифов представлены в схеме 9.

Выбор материала и метода микробиологической диагностики этих заболеваний зависит от стадии патогенеза. На первой неделе заболевания и в течение всего лихорадочного периода возбудитель можно выделить из крови (гемокультура), с конца второй и на третьей неделе — из мочи (уринокультура) и испражнений (копрокультура). Высокий процент высеваемости возбудителя отмечается при исследовании костного мозга (выделение миелокультуры). Удается обнаружить сальмонеллы в скарификате розеол (розеоло-культура), ликворе, содержимом двенадцатиперстной кишки, секционном материале. У реконвалесцентов исследуют испражнения и желчь (выделение биликультуры). Начиная со второй недели заболевания проводят серологическое исследование. Микроскопическое исследование материала от больного не проводится, т.к. все энтеробактерии (как патогенные, так и непатогенные, например, E.coli) по морфологическим свойствам идентичны (рис. 14).

Бактериологическое исследованиеявляется основным лабораторным методом диагностики брюшного тифа и паратифов.

Ранним и надежным методом бактериологической диагностики является выделение возбудителей из крови (гемокультура).Взятую в асептических условиях кровь (15-20 мл) засевают на 10% желчный бульон или среду Рапопорт (10% желчный бульон, 1 % маннита или 2 % глюкозы, 1 % индикатора Андреде; в среду помещен поплавок для улавливания газа) в соотношении крови и среды 1:10 для накопления сальмонелл. Посевы инкубируют при 37 0 С 18 —24 ч. При наличии сальмонелл маннит или глюкоза расщепляется с образованием кислоты и среда приобретает красный цвет; появление в поплавке газа свидетельствует о газообразовании - характерном признаке паратифозных бактерий.

Схема 9.Микробиологическая диагностика брюшного тифа и паратифов.

А б

Рис. 14. а - кишечная палочка(E.coli ув. Х1350), б- возбудитель брюшного тифа(S.typhi, ув. Х630) в мазках из чистой культуры. Окраска по Граму. Грамотрицательные беспорядочно расположенные палочки средних размеров.

Копрокультуру выделяют путем посева фекалий на среду Плоскирева, Эндо, висмут-сульфит агар и среды накопления (селенитовую, магниевую, тетратионатную, Кауфмана, Мюллера) с последующей 18 —24-часовой инкубацией при 37 °С.

На 2-й день на средах Плоскирева, МакКонки или Эндо вырастают бесцветные (лактозоотрицательные) колонии, а на висмут-сульфит-агаре – черные. Колонии сальмонелл паратифа А окрашены взеленый цвет, так как не образуют сероводород. Из типичных колоний готовят мазок, окрашивают по Граму и после микроскопии остаток колонии пересевают на среду Ресселя или Олькеницкого. При отсутствии типичных колоний на те же среды засевают материал со среды обогащения.

ставят ориентировочную, а потом развернутую РА. Ориентировочную РА ставят со смесью О-сывороток, включающей агглютинины к О-антигенам 2, 4, 7, 8, 9, 3-10. При отсутствии РА с этой смесью используют смесь монорецепторных О-сывороток к редким группам сальмонелл (антитела к антигенам 11, 13, 15, 19, 23 и т.д.) При получении положительных результатов культуру испытывают отдельно с каждой из О-сывороток, входящих в состав смеси. После этого культуру агглютинируют с Н-сыворотками 1 фазы (a, b, i, c, d, g, m) а потом 2 фазы (1,2; 1,5), устанавливая антигенную формулу выделенной сальмонеллы в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта (таблица 9). Эта схема разработана на основании изучения у сальмонелл О и Н антигенов и применяется с целью антигенной идентификации патогенных сальмонелл.

Таблица 9. Антигенная структура сальмонелл (сокращенная схема Кауфмана-Уайта)

Группа	Серовар	О-антиген	Н-антиген
Фаза 1	Фаза 2
А	Paratyphi A	1, 2, 12	a	-
B	Paratyphi B Typhi murium	1, 4, 5, 12 1, 4, 5, 12	b i	1, 2 1, 2
C	Paratyphi C Cholerae suis	6, 7, Vi 6, 7	c c	1, 5 1, 5
D	Typhi Enteritidis	9, 12, Vi 1, 9, 12.	d g, m	- -

Мочу, дуоденальное содержимое, соскоб розеол, секционный материал с целью выделения тифо-паратифозных бактерий засевают на плотные среды (Эндо, Мак-Конки и т.п. в чашке Петри), а также в среды накопления. При наличии характерного роста идентификация проводится по вышеописанной схеме.

Таблица 10. Биохимические свойства возбудителей брюшного тифа и паратифов

Биовар S.enterica	Ферментация	Продукция
Лакто- Зы	Глю- козы	Маль- тозы	Саха- розы	Ман- нита	Н₂S	NH₃	индо- ла
Typhi	-	К	К	-	К	+	-	-
Paratyphi A	-	КГ	КГ	-	КГ	-	-	-
Paratyphi В	-	КГ	КГ	-	КГ	+	+	-

Обозначения: (+) - наличие свойства, (-) - отсутствие свойства, К – образование кислоты, КГ – образование кислоты и газа.

Аналогично проводится исследование испражнений упереболевших брюшным тифом и паратифом лиц, а также у работников детских учреждений, питания и водоснабжения с целью выявления бактерионосителей.

Серологическое исследование.Для серологической диагностики брюшного тифа и паратифов ставят реакцию Видаля (развернутая РА) с целью определения соответствующих антител в крови больного. Антитела к возбудителям брюшного тифа, паратифов А и В обнаруживаются в сыворотке крови больных с 8— 10-го дня заболевания. Исследуемую сыворотку крови разводят двукратно в 6 параллельных рядах пробирок от 1:100 до 1: 1600 в объеме 1 мл, куда вносят по 2 капли ОН- и О- брюшнотифозного, паратифозного Аи паратифозного В диагностикумов. О-диагностикумы получают кипячением или обработкой спиртом взвеси соответствующих культур, ОН-диагностикумы - обработкой формалином. Для контроля антигена диагностикумы вносятся в той же дозе в 1 мл физиологического раствора, а для контроля сыворотки используют сыворотку в разведении 1:100 без добавления диагностикумов.

О-антитела имеют диагностическое значение, они появляются в крови на второй неделе заболевания и исчезают к его концу, а Н-агглютинины нарастают к концу заболевания. и диагностической ценности не имеют. Н-антитела могут обнаруживаться также у переболевших и вакцинированных. Ряд брюшнотифозных вакцин вызывает также выработку Vi – и О антител. Диагностический титр О-антител в реакции Видаля у неиммунизированных лиц 1 :100, а при отсутствии типичной клинической картины - 1 :200. Однако титр антител у больных может быть ниже диагностического в связи с ранним назначением антибиотиков или наличием у больного вторичного иммунодефицита. Таким образом, отрицательная реакция Видаля не исключает тифопаратифозное заболевание. С другой стороны, повышенные титры О-антител могут быть обусловлены прививками. Поэтому при подозрении на брюшной тиф или паратифы целесообразно исследовать сыворотку крови как можно раньше (до появления антител), а затем в динамике (с интервалом 7-12 дней) для выявления нарастания титра антител более чем в 4 раза. Если сыворотка крови больного агглютинирует одновременно два или три вида диагностикумов, учитывают титр агглютинации: специфическая агглютинация происходит обычно с более высокими, а групповая — с более низкими разведениями сыворотки.

Более чувствительны РНГА с эритроцитарными групповыми (А, В, С, Д, Е)и монорецепторными диагностикумами, а также ИФА, которые ставят с парными сыворотками в динамике заболевания.

Vi-антитела чаще обнаруживаются у бактерионосителей сальмонелл брюшного тифа, т.к. Vi-антиген способствует длительной персистенции возбудителя в организме. При обследовании лиц, подозрительных на носительство брюшнотифозных палочек, применяется РНГА с эритроцитарным Vi-диагностикумом для определения соответствующих антител и их принадлежности к классу IgG.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

гемагглютинации для выявления дифтерийных антитоксических антител (РПГА)

( В СООТВЕТСТВИИ С МЕТОДИЧЕСКИМИ УКАЗАНИЯМИ. МУ 4.2.698-98" УТВ. МИНЗДРАВОМ РФ 09.01.98)

Для изучения напряженности противодифтерийного иммунитета проводят определение уровня антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови человека в РПГА. РПГА – двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного, который представляет собой эритроциты с адсорбированным на них дифтерийным анатоксином, и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сыворотке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин + сенсибилизированные анатоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

РПГА рекомендуется ставить одновременно с двумя диагностикумами – дифтерийным и столбнячным. Данную реакцию ставят микрометодом, при котором используются малые количества сыворотки крови, растворов и реактивов. Также, по сравнению с макрометодом, микрометод более чувствителен и специфичен. Описанная в данном разделе методика постановки РПГА содержит основные требования, предъявляемые к этой реакции.

Взятие крови для постановки РПГА осуществляют обученные медицинские работники ЛПУ. Кровь берут из пальца в объеме 0,7–1,0 мл. Не допускается взятие крови из вены специально для постановки РПГА. Вместе с тем, возможно использование крови, взятой из вены для проведения комплексных исследований. Постановку РПГА должен осуществлять специально обученный персонал.

ПРАВИЛА СБОРА И ОБРАБОТКИ ПРОБ КРОВИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТОКСИЧЕСКИХ ПРОТИВОДИФТЕРИЙНЫХ И ПРОТИВОСТОЛБНЯЧНЫХ АНТИТЕЛ

Обследуемый тщательно моет руки с мылом в теплой воде. Подушечку концевой фаланги безымянного пальца левой руки обрабатывают 70 % спиртом, место сгиба у концевой фаланги прижимают для лучшего кровенаполнения и наносят два укола стерильным одноразовым скарификатором на расстоянии 2 мм один от другого или один укол двумя скарификаторами взятыми вместе. Массируя опущенный палец, капли крови собирают в стерильную центрифужную пробирку, направляя их "одной дорожкой". Собирают не менее 0,7–1,0 мл крови. Ранку обрабатывают настойкой йода. Пробирку закрывают ватно-марлевой пробкой и оставляют в наклонном положении для образования "скошенного" сгустка. На пробирке должен быть указан номер, соответствующий записи в журнале регистрации. Через час пробирку переводят в вертикальное положение. При этом сгусток остается на стенке пробирки, а свободная от эритроцитов сыворотка собирается на дне. Сыворотку переносят в другую пробирку.

В лабораторию для постановки РПГА доставляют либо пробирку со сгустком, либо пробирку с сывороткой. Сыворотка может быть заморожена и храниться при температуре 20 0 C. Замораживать и оттаивать сыворотку крови рекомендуется не более одного раза.

ОСНАЩЕНИЕ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ РПГА

(На примере коммерческой тест-системы производства

АО "Биомед" им. Мечникова, п. Петрово-Дальнее Московской обл.)

Для проведения реакции микрометодом необходимы:

– коммерческий набор для определения противодифтерийных антитоксических антител "Диагностикум эритроцитарный дифтерийный жидкий для РПГА";

– капельницы, петли из набора Такачи объемом 0,025 мл (возможна постановка реакции петлями объемом 0,05 мл, что предполагает увеличение расхода диагностикума и других компонентов реакции в два раза) или автоматические пипетки, установленные на объем 25 мкл (или 50 мкл);

– полистироловые планшеты "U" - образные (со сферическим дном) из набора Такачи или отечественного производства для иммунологических реакций (многократного использования);

– 0,85-процентный свежеприготовленный раствор хлорида натрия – для разведения испытуемых сывороток.

Коммерческая тест-система содержит:

n Фосфатно-солевой буферный раствор концентрированный, без твина (ФБР без твина) – для разведения диагностикума и контрольных эритроцитов.

n Фосфатно-солевой буферный раствор концентрированный, с твином (ФБР с твином) – для разведения сыворотки противодифтерийной контрольной и проведения РПГА.

n Диагностикум эритроцитарный дифтерийный 3-процентный.

n Эритроциты барана формалинизированные 50-процентные – для адсорбции гетерогемагглютининов в испытуемых сыворотках.

n Эритроциты барана контрольные 3-процентные.

n 6. Сыворотка противодифтерийная контрольная, содержащая 10 ME/мл.

ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ

МАТЕРИАЛА В РПГА

1. Подготовка планшетов и др. (см. "Меры безопасно_ти при постановке РНГА", раздел 6). Перед проведением реакции протирают каждую лунку тампоном, смоченным разведенным ФБР с твином.

2. Приготовление раствора ФБР без твина. Содержимое флакона "ФБР без твина" разводят до объема 62,5 мл дистиллированной водой (pH готового раствора 7,2). Приготовленный раствор используют в день проведения реакции.

3. Приготовление раствора ФБР с твином. Содержимое флакона "ФБР с твином" разводят до объема 125 мл дистиллированной водой (pH готового раствора 7,2). Разведенный раствор можно разлить по флаконам, герметически укупорить и хранить при температуре 4 0 C в течение 72 часов.

4. Приготовление раствора противодифтерийной контрольной сыворотки (СДК). Сыворотку противодифтерийную контрольную (10 ME/мл) разводят в 100 раз до содержания 0,1 ME/мл с помощью ФБР с твином. СДК должна быть использована в течение суток.

5. Приготовление рабочего разведения диагностикума эритроцитарного дифтерийного (ДЭД). Диагностикум эритроцитарный дифтерийный 3-процентный разводят ФБР без твина до 0,3-процентной концентрации.

6. Приготовление рабочего разведения эритроцитов барана контрольных (КЭ). Контрольные эритроциты 3-процентные разводят до 0,3-процентной концентрации с помощью ФБР без твина.

7. Подготовка исследуемых сывороток. Исследуемую сыворотку человека перед определением уровня дифтерийного антитоксина разводят 1:5 или 1:10 0,85-процентным свежеприготовленным раствором хлорида натрия. Разведенную сыворотку прогревают в течение 30 мин. в водяной бане или инактиваторе при температуре 56 0 C. Разведенную и прогретую сыворотку адсорбируют эритроцитами барана, формалинизированными 50-процентными, которые перед использованием встряхивают до получения гомогенной взвеси. Эритроциты добавляют из расчета 0,05 мл на 0,5 мл разведенной сыворотки, выдерживают 15–20 часов при температуре 4 0 C. После сорбции прозрачная надосадочная жидкость готова к исследованию (без предварительного центрифугирования). При срочном исследовании адсорбцию проводят в течение 30 мин. в термостате при 37 0 C, центрифугируют и работают с надосадочной жидкостью.

1. Внесение ФБР с твином. Во все лунки планшета вносят по 0,025 мл разведенного ФБР с твином.

2. Внесение испытуемых сывороток. Петлей вместимостью 0,025 мл в 1 лунку ряда вносят 0,025 мл разведенной 1:5 прогретой, адсорбированной испытуемой сыворотки, тщательно перемешивают, получают разведение 1:10 и, перенося по 0,025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10 лунки включительно. Из 10 лунки, после перемешивания, удаляют 0,025 мл. Для экономии всех ингредиентов титрование сывороток можно проводить в 8 лунках по короткому ряду планшета. Если испытуемые сыворотки разведены 1:10, то в 1 лунку планшета вносят по 0,025 мл разведенной 1:10 испытуемой сыворотки. Внесение сыворотки в этом случае осуществляют мерной пипеткой (с наконечником). Титрование сыворотки начинают со 2 лунки. Для контроля на отсутствие агглютининов к эритроцитам барана, при постановке РПГА "по длинному ряду", в 1 лунку петлей вносят 0,025 мл испытуемой сыворотки, прогретой, адсорбированной, разведенной 1:10 (или 1:5), перемешивают и переносят 0,025 мл в 12 лунку. Из 12 лунки, после перемешивания, удаляют 0,025 мл. При титровании "по короткому ряду" этот контроль для испытуемых сывороток ставят на специально выделенных рядах этого же планшета (в редких случаях – в отдельном планшете).

3. Внесение сыворотки противодифтерийной контрольной (для оценки чувствительности эритроцитарного диагностикума). В 1 лунку ряда вносят 0,025 мл разведенной СДК, получают разведение 1:200, содержимое лунки тщательно перемешивают петлей и, перенося по 0,025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10 лунки включительно. Из десятой лунки, после перемешивания, удаляют 0,025 мл, 11 и 12 лунки, содержащие по 0,025 мл разведенного ФБР с твином, являются контролем диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации. В 1 лунку ряда, так же как и при титрировании испытуемых сывороток, лучше не вносить 0,025 мл разведенного ФБР с твином. При этом, в 1 и 2 лунки мерной пипеткой с наконечником вносят по 0,025 мл СДК, разведенной 1:100. Титрование СДК начинают со 2 лунки. Контроль на чувствительность диагностикума следует ставить при каждом опыте!

4. Внесение контрольных эритроцитов барана. При постановке РПГА "по длинному ряду", в 11 и 12 лунки с испытуемой сывороткой вносят по 0,025 мл рабочего разведения контрольных эритроцитов барана. При постановке РПГА "по короткому ряду", контрольные эритроциты барана вносят в две специально выделенные лунки для каждой испытуемой сыворотки (см. п. 2).

5. Внесение эритроцитарного диагностикума. Флакон с разведенным диагностикумом тщательно встряхивают до образования однородной взвеси эритроцитов и капельницей вносят по 0,025 мл (одна капля) диагностикума в каждую лунку до конца ряда с разведениями контрольной сыворотки и с 1 до 10 лунки включительно с разведениями испытуемых сывороток (или с 1 до 8 лунки с разведениями испытуемых сывороток при постановке реакции "по короткому ряду". Разведенный диагностикум может быть использован в течение недели, если его активность соответствует требуемой. Равномерное распределение эритроцитов в лунках пластин достигается путем постукивания по углам пластины. Пластины остаются на ровной поверхности в течение 2,5–3,5 часов при температуре 20 0 C (перемещение пластин до учета результатов реакции исключается). Допускается учет результатов реакции через 18–24 часа.

Примечание. Титрование сывороток можно проводить в объеме 0,05 мл, диагностикум при этом добавляют по 0,025 мл в каждую лунку.

УЧЕТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты РПГА оценивают визуально – по степени агглютинации эритроцитов:

++++ гемагглютинат тонким слоем выстилает все дно лунки;

+++ агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают дно лунки, но размер агглютината меньше, может наблюдаться фестончатое утолщение края осадка;

++ агглютинировавшие эритроциты располагаются в центральной части лунки, окружены слоем эритроцитов в виде кольца;

+ на дне лунки образуется широкое, плотное кольцо с незначительной агглютинацией по краю;

– осадок в центральной части лунки в виде диска или кольца с ровным краем.

Реакция в контролях на отсутствие в испытуемой сыворотке агглютининов к эритроцитам барана и на отсутствие спонтанной агглютинации диагностикума должна быть отрицательной. Если испытуемая сыворотка в лунках с контрольными эритроцитами дает гемагглютинацию, нужно повторно адсорбировать из нее гетерогемагглютинины: то есть повторно провести обработку сыворотки 50-процентными формалинизированными эритроцитами. За титр испытуемой и контрольной сывороток принимают последнее разведение, дающее агглютинацию эритроцитов на два плюса (++). При определении специфической активности (чувствительности) диагностикума, агглютинация на два плюса с сывороткой противодифтерийной контрольной должна быть не ниже 1:3200 и не выше 1:12800, что соответствует 5–7 лункам. В противном случае диагностикум бракуется и реакция не учитывается. (Активность столбнячного диагностикума с противостолбнячной контрольной сывороткой должна быть не ниже, чем 1:1280.)

Условно–защитным титром как противодифтерийных, так и противостолбнячных антител принимается титр 1:20. Испытуемые сыворотки с титром противодифтерийных антитоксических антител 1:20 и менее подлежат повторному исследованию в РПГА с использованием уже разведенной 1:5 или 1:10, прогретой, адсорбированной эритроцитами барана сыворотки. При наличии достаточного количества нативной сыворотки, ее вноe2ь разводят 1:5 или 1:10, прогревают, сорбируют эритроцитами барана и исследуют в РПГА. За окончательный результат исследования принимают более высокий титр.

Сравнение количественных показателей содержания антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови, полученных с помощью титрования в РПГА и в коже кролика, не представляется возможным.

Не рекомендуется использовать РПГА для дифференциальной диагностики дифтерийной инфекции и носительства токсигенных коринебактерий дифтерии, поскольку нарастание титра антитоксических антител может иметь место как в том, так и в другом случае. Кроме того, 4-кратного нарастания титра реакции, которое некоторыми исследователями трактуется как критерий наличия дифтерийной инфекции, может не наблюдаться, поскольку РПГА является полуколичественным методом, с допустимой ошибкой метода +/- одно разведение. Однако РПГА позволяет оценить состояние антитоксического противодифтерийного иммунитета у больного и, в некоторой степени, прогнозировать течение и исход заболевания.

Читайте также: