Солевой бульон для стафилококков оболенск
Для выделения культур стафилококков обычно используют 5%-ный кровяной агар (кровь овцы, кролика, крупного рогатого скота). При исследовании образцов, содержащих постороннюю микрофлору, целесообразно использовать селективные среды.
Таблица 9. Дифференциальные признаки стафилококков, имеющих основное медицинское значение
Признак | S. aureus | S. epidermidis | S. saprophyticus | |
Anaerobius | Aureus | |||
Наличие каротиноидного сегмента | – | ± | – | + |
Способность к росту в анаэробных условиях (тиогликолевая среда) | + | + | + | ± |
Рост на средах с 10% NaCI | + | + | ± (слабо) | + |
Рост при: | ||||
15°С | ? | + | – (слабо) | + |
45°С | – | + | + | ± |
Образование кислоты при ферментации углеводов в аэробных условиях: | ||||
ксилоза | – | – | – | – |
арабиноза | – | – | – | – |
раффиноза | – | – | – | – |
сахароза | + | + | + | + |
маннит | – | + | – | ± |
манноза | – | + | ± | – |
трегалоза | – | + | – | + |
лактоза | – | + | ± | ± |
галактоза | – | + | ± | – |
фруктоза | + | + | + | + |
ксилит | – | – | – | ± |
Восстановление нитратов | – | + | + (слабо) | – |
Щелочная фосфатаза | + | + | + | – |
Гиалуронидаза | + | + | + | ? |
Уреаза | ? | ± | + | + |
Коагулаза (на сыворотке кролика) | + | + | – | – |
Фибринолизин | ? | ± | ± | ? |
Гемолитическая активность | + | + | – (слабо) | – |
ДНКаза | + | + | – (слабо) | – |
Чувствительность к новобиоцину (МИК >1,6 мкг/мл) | + | + | + | – |
С целью дифференциации патогенных стафилококков от сапрофитных, а также от микрококков, используют среды, позволяющие одновременно определить один из признаков, характеризующих патогенные стафилококки. Приводим рецепты некоторых питательных сред.
Молочно-солевой агар
В 100 мл МПБ растворяют 6,5 г хлорида натрия, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,4, стерилизуют при 121°С 20 минут. Перед использованием агар расплавляют, охлаждают до 45°С, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока и разливают по чашкам Петри. На этой среде определяют пигментообразование и способность к росту при наличии 6,5% хлорида натрия.
Лактозо-солевой бульон с фенолротом
В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара. Устанавливают рН 6,8, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121°С 15 минут. При росте коагулазоположигельных стафилококков среда желтеет (тест на коагулазу положительный).
Теллурит-полимиксин-желточный агар Крисли
В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г маннита, 20 г хлорида натрия, 2 г хлористого лития, 18 г агара. Устанавливают рН 7,3, стерилизуют 15 минут при 121°С. Перед использованием в среду добавляют 100 мл 30%-ной желточной эмульсии (на физиологическом растворе), 0,4 мл стерилизованного фильтрацией 1%-ного водного раствора полимиксина М, 10 мл стерилизованного автоклавированием (121°С 15 мин) 1%-ного водного раствора теллурита натрия.
Среда Джиолиотта и Кантони
В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г маннита, 5 г хлористого натрия, 1,2 г глицина, 3 г пирувата натрия. Устанавливают рН 6,9, стерилизуют при 115°С 20 мин. Перед употреблением к среде добавляют 0,1 мл 1%-ного водного раствора теллурита натрия, стерилизованного фильтрацией, При росте коагулазоположительных стафилококков наблюдается почернение среды или черный осадок.
Среда Бэрда-Паркера
К 90 мл основной среды с температурой 45°С добавляют 6,3 мл глицинового раствора, 1 мл раствора теллурита натрия, 5 мл эмульсии желтка, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда пригодна к использованию в течение 28 дней (хранение при 4°С). Перед посевом на поверхность среды наносят 0,5 мл 20%-ного водного раствора пирувата натрия, стерилизованного фильтрацией; распределяют по поверхности, подсушивают. Колонии коагулазоположительных стафилококков черные, блестящие, с узкой серо-белой полосой и окружены прозрачной зоной.
Желточная эмульсия. Свежее куриное яйцо выдерживают в 0,001%-ном растворе HgCl2. Соблюдая требования асептики, отделяют желток и эмульгируют его в 200 мл физиологического раствора.
Глициновый раствор. Глицин — 20 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют при 120°С 15 минут.
Раствор теллурита натрия. Теллурит натрия — 1 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют фильтрацией.
Желточно-солевой агар Чистовича
В расплавленный МПА с 10% хлорида натрия (рН 7,2), охлажденный до температуры 60°С, добавляют желточную эмульсию. После тщательного перемешивания питательную среду разливают в чашки Петри.
Среда Чаплина-Бернса
К 100 мл МПА добавляют 3,3 мл 0,1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового и 5 г лактозы. Устанавливают рН 6,8. Стерилизуют автоклавированием (110°С 30 минут). Колонии патогенных стафилококков растут быстрее, чем непатогенных, и приобретают фиолетовый или оранжевый цвет.
Среда Чемпена (для выделения патогенных стафилококков)
Вариант 1: пептон — 1%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, дрожжевой экстракт — 0,25%, двузамещенный фосфорнокислый калий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Среду стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0 и добавляют 10% стерильного обезжиренного молока (молоко способствует лучшему образованию пигмента).
Вариант 2: пептон — 1%, дрожжевой экстракт — 0, 25%, желатин — 3%, лактоза — 0,2%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, двузамещенный фосфорнокислый калий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0.
3.22. Методы определения Staphylococcus aureus
Средства контроля и вспомогательные устройства. Аппаратура, материалы, реактивы по ГОСТ 9225 со следующими дополнениями:
Питательные среды. Гидролизованное и стерильное обезжиренное молоко по ГОСТ 10444.11.
Желточную эмульсию готовят следующим образом. Свежее куриное яйцо моют водопроводной водой, затем протирают ваткой, смоченной в спирте, и обсушивают. Отделяют желток и вносят его в 100 см 3 стерильного раствора хлористого натрия по ГОСТ 9225. Тщательно перемешивают. Приготовленная эмульсия может храниться при температуре 0–5 °С не более 72 ч.
Солевой бульон (допускается применение солевого бульона, который готовится согласно указанию на этикетке). Состав: натрий хлористый (NaCl) – 7,5 г; питательный сухой бульон – 1,5 г (или гидролизованное молоко – 100 см 3 ).
Приготовление: в 100 см 3 дистиллированной воды вносят 1,5 г сухого питательного бульона, кипятят 1–2 мин, фильтруют через ватный тампон, добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают рН (6,9 ± 0,1).
Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение(10 ± 1) мин.
Или к 100 см 3 гидролизованного молока добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают рН (6,9 ± 0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.
Желточно-солевой агар [1] . Состав: питательный агар [2] для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) – 35 г или питательный агар II 8 (на основе гидролизата кормовых дрожжей) 24 г; натрий хлористый (NaCl) – 75 г; эмульсия желточная – 50,0 см 3 ; вода дистиллированная – 1 дм 3 .
Приготовление: в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 75 г хлористого натрия (NaCl), кипятят до полного расплавления агара, фильтруют через ватный тампон, разливают во флаконы или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин. После стерилизации охлаждают до температуры (45 ± 1) °С и добавляют 50 см 3 предварительно подготовленной желточной эмульсии. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.
Молочно-солевой агар [3] . Состав: питательный агар [4] для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) – 35 г; или питательный агар II 10 (на основе гидролизата кормовых дрожжей) – 24,0 г; натрий хлористый (NaCl) – 75,0 г; молоко обезжиренное – 100 см 3 ; вода дистиллированная – 1 дм 3 .
Приготовление: среду готовят, как указано выше, но после охлаждения до температуры (45 ± 1) °С добавляют вместо желточной эмульсии 100 см 3 стерильного обезжиренного молока. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.
Агар Байрд-Паркера. Среда готовится согласно указанию на этикетке. Состав. Основа среды: триптон – 10,0 г; дрожжевой экстракт – 1,0 г; мясной экстракт – 5,0 г; литий хлористый гексагидрат – 5,0 г; агар – 12,0–20,0 г; вода дистиллированная – 1 дм 3 .
Раствор пирувата натрия: пируват натрия – 20,0 г; вода дистиллированная –100 см 3 .
Раствор глицина: глицин – 20,0 г; вода дистиллированная – 100,0 см 3 .
Приготовление основы среды: в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара.
При отсутствии мясного экстракта, триптона и дрожжевого экстракта вместо дистиллированной воды применяют 1 дм 3 мясопептонного бульона или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой или питательный агар сухой II.
Все компоненты, внесенные в 1 дм 3 дистиллированной воды (мясопептонный бульон), нагревают и перемешивают до полного растворения, охлаждают до температуры 50–60 °С. Устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают в колбы или бутылки по 90 см 3 и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин.
При использовании сухой среды в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 5 г хлористого лития. Нагревают до полного растворения, охлаждают до температуры 50–60 °С, устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают и стерилизуют как указано выше.
Готовую основу среды хранят не более 30 сут при температуре (6 ± 2) °С.
Перед использованием к 90 см 3 расплавленной основы среды добавляют асептически стерилизованные фильтрованием через мембранный фильтр растворы: 6,3 см 3 раствора глицина, 5 см 3 раствора пирувата натрия; 1 см 3 раствора теллурита калия; 5 см 3 желточной эмульсии.
Допускается растворы глицина, пирувата натрия, теллурита калия и желточную эмульсию готовить в асептических условиях на стерильной дистиллированной воде.
После тщательного перемешивания приготовленную среду разливают в чашки Петри. Чашки со средой можно хранить не более 48 ч.
Порядок подготовки к проведению контроля. Приготовление растворов и реактивов . Раствор плазмы кроличьей цитратной готовится согласно инструкции по применению плазмы, прилагаемой к упаковке.
Растворы и реактивы для окраски препаратов готовят по ГОСТ 9225.
Приготовление реактивов для окраски по Грaму . Приготовление реактива 1: в 100 см 3 этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового.
Приготовление реактива 2: к 96 см 3 спиртового раствора йодистого калия массовой концентрацией 5 г/дм 3 добавляют 2 см 3 спиртового раствора основного фуксина массовой концентрацией 50 г/дм 3 и 2 см 3 спиртового раствора йода массовой концентрацией 50 г/дм 3 .
Йодистый калий растворяют в спирте на водяной бане при температуре (45 ± 5) °С при постоянном помешивании.
Отбор и подготовка проб по ГОСТ 9225.
Метод определения количества Staphylococcus aureus с предварительным обогащением
Подготовка и проведение контроля. Из навески продукта готовят ряд десятикратных разведений по ГОСТ 9225 так, чтобы можно было определить наличие или отсутствие Staphylococcus aureus в определенной массе (объеме), указанной в нормативном документе на конкретный продукт.
Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см 3 в пробирки или колбы с солевым бульоном.
Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведенной питательной средой 1:10.
Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.
Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне, к Staphylococcus aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний или на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркера, желточно-солевой агар или молочно-солевой агар.
Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24-48 часов.
После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.
На желточно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2–4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды.
На молочно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром 2–4 мм, слегка выпуклых.
На среде Байрд-Паркера колонии Staphylococcus aureus растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром 1–1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1–3 мм.
С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных колоний и пересеивают на поверхность скошенного питательного агара, 1 см желточно-солевого агара, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии.
Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 часов.
У выросших колоний определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика.
Из пяти изолированных, характерных для Staphylococcus aureus, колоний делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей каплю дистиллированной воды, в которую вносят петлей небольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. Затем вносят петлей каплю реактива 1, для окраски по Граму.
Смесь распределяют на участке примерно 1 см 2 , просушивают при температуре (20 ± 2) °С, фиксируют, медленно пронося предметное стекло над пламенем горелки. На одном стекле можно готовить по шесть-восемь мазков, отделяя их один от другого линиями, проведенными с лицевой стороны стекла.
Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.
После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2 для окрашивания по Граму так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания 0,5–1 мин. После окрашивания препарат быстро ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат просушивают фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Граму, будут темно-фиолетового цвета, не красящиеся по Граму – красного цвета.
Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (темно-фиолетового цвета), имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще всего напоминающими гроздья винограда.
Постановка реакции плазмокоагуляции. В пробирку с 0,5 см 3 разведенной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры. Внесенную культуру тщательно размешивают. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, в другую засеивают контрольный штамм Staphylococcus aureus (коагулазоположительный стафилококк).
Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температуре (37 ± 1) °С в течение 3–6 ч. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то оставляют эти пробирки до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.
При определении коагулазной активности реакцию считают отрицательной в тех случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).
Реакцию считают положительной, если:
+++ – сгусток, имеющий небольшой отсек;
++ – сгусток в виде взвешенного мешочка.
Все три варианта являются положительным результатом.
При получении положительной реакции считают, что в посевах обнаружен Staphylococcus aureus.
Обработка результатов контроля. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
Оформление результатов контроля. Морфологические, культуральные свойства и положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствуют о присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта.
Метод определения количества Staphylococcus aureus без предварительного обогащения
После термостатирования подсчитывают количество характерных колоний на каждой чашке Петри (желточно-солевой агар, молочно-солевой агар и агар Байрд-Паркера, см. предыдущий метод). С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных и/или подозрительных колоний Staphylococcus aureus, а в случае роста менее пяти – все колонии, характерные для Staphylococcus aureus, и пересевают на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки (см. желточно-солевой агар), но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.
У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика как в предыдущем методе.
Обработка результатов контроля. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
Оформление результатов контроля. Количество колоний Staphylococcus aureus в 1 г или 1 см 3 после определения его в определенной навеске продукта вычисляют по формуле:
где Σn1, Σn2 – количество колоний, выросших на всех чашках Петри в пределах одного разведения или засеянного объема; n – число десятикратных разведений.
Пример. Подсчитываем количество колоний Staphylococcus aureus, выросших на трех засеянных чашках при посевах продукта или его разведений:
1 г или 1 см 3 продукта: | 84 | 96 | 72 |
10 -1 разведение: | 9 | 10 | 7 |
10 -1 разведение: | 84 | 96 | 72 |
10 -2 разведение: | 99 | 10 | 7 |
[1] Допускается использовать солевой агар, который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.
[2] При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм 3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указанию на этикетке.
[3] Допускается использовать солевой агар, который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.
[4] При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм 3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указанию на этикетке.
К концентрированному мясопептонному бульону с pH 7,0-7,2 добавляют 1% глюкозы, предварительно растворив ее в небольшом количестве воды. Все тщательно размешивают, разливают в пробирки и стерилизуют в автоклаве при 116 °С в течение 15 мин.
К мясопептонному агару прибавляют 1% глюкозы. Сахар растворяют в небольшом количестве воды и прибавляют к уже готовому расплавленному мясопептонному агару. Агар тщательно перемешивают, разливают по пробиркам, стерилизуют в автоклаве 15-20 мин при 116°С.
Среда Китта-Тароцци - специальная питательная среда для: выращивания анаэробов и накопления токсинов. На дно пробирок кладут мелкие кусочки говяжьей печени, предварительно сваренные и хорошо промытые горячей водой на сите (в противном случае они дают муть). Печень укладывают в пробирки с таким расчетом, чтобы высота слоя была 1-1,5 см. Содержимое пробирок заливают концентрированным мясопептонным бульоном, в который предварительно введено 1% глюкозы и 0,15% агара. Высота слоя прилитого бульона должна быть 6-7 см, а pH 7,0-7,2. Стерилизуют среду в автоклаве при 120°С в течение 20 мин. Перед употреблением среду следует прогреть в кипящей водяной бане в течение 20 мин для удаления растворившегося в среде воздуха.
Говяжью печень, так же как и мясную воду, можно готовить впрок. Для этого ее режут кусочками 5х5 см, хорошо промывают холодной водой и варят в эмалированной кастрюле. Сваренную печень промывают на сите горячей водой, укладывают в стеклянные банки, заливают водопроводной водой, закатывают и стерилизуют в автоклаве 50-60 мин при 120°С. Брать. Стеклянные банки емкостью более 0,5 л не рекомендуется.
Агар для трубок Вейона готовят из концентрированного мясопептонного бульона с добавлением 1% глюкозы и 1% агара. Стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С в течение 20 мин.
Глюкозо-солевой агар. К 100 мл мясопептонного агара добавляют 1 г глюкозы и 5 г чистой поваренной соли. Среду готовят впрок, стерилизуют в автоклаве 15-20 мин при 120 °С. Мясопептонный солевой бульон. Мясопептонный солевой бульон используется для накопления стафилококка. К концентрированному мясопептонному бульону прибавляют от 6 до 7,5% поваренной соли. Разливают в пробирки и среду стерилизуют в автоклаве 20 мин при 120 °С.
Для галофилов и галобов готовят обычные мясопептонные среды, но с повышенным содержанием поваренной соли: к средам для галофилов ее обычно прибавляют 10-15%, к средам для галобов - 20%. Твердые агаровые среды готовят с повышенным процентом агара, так как большое содержание соли влияет на желирующую способность агара и питательная среда может не застыть.
К мясопептонному агару с 1 % глюкозы и pH 7,0-7,2 добавляют 0,004% бромкрезолпурпура. Среду разливают в пробирки по 10-15 мл и стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 20 мин. Приготовленная среда должна иметь слабо-фиолетовую окраску.
Печеночный бульон служит для выявления термофильных анаэробов, не образующих сероводорода. 500 г мелко нарезанной говяжьей печени заливают 1 л водопроводной воды, кипятят в течение 1 ч, доводят pH смеси до 7,0-7,2 и кипятят еще 10 мин. Затем бульон отцеживают через ткань, доводят объем фильтрата до 1 л, добавляют 10 г пептона, 1 г двуфосфорнокислого калия и 1 г растворимого крахмала. Среду фильтруют через бумажный фильтр и еще раз проверяют pH. Он должен быть равным 7,0. Перед розливом на дно пробирок кладут кусочки печени высотой 2,0-2,5 см, а затем наливают печеночный бульон по 6-7 мл в каждую пробирку. Стерилизуют 20 мин при 120°С. Перед употреблением среду следует нагреть на водяной бане в течение 20 мин для удаления растворенного в жидкости воздуха.
Сульфатный агар является средой для выявления термофильных анаэробов, образующих сероводород. В состав среды входят следующие компоненты: триптон - 10 г, сернокислый натрий (сульфат натрия) - 1 г, агар - 20 г, вода - 1 л. Реакцию среды необязательно доводить до определенного значения pH. Перед розливом в каждую пробирку помещают чистую железную пластинку или гвоздь, а затем наливают питательную среду и стерилизуют, как обычно.
К 1 л готового концентрированного мясопептонного бульона прибавляют 150-200 г мелко измельченной желатины. Желатина приготовляется из костей, хрящей, сухожилий различных животных в виде пластинок или тонких листов. По химическому составу это кислый азотистый продукт, состоящий главным образом из белка глутина.
Мясопептонный бульон с добавленной желатиной расплавляют на водяной бане при температуре 80°С, устанавливают pH 7,0-7,2, разливают по пробиркам и стерилизуют в кипятильнике Коха 3 дня подряд по 20 мин. Если желатина дает осадок, среду следует осветлить перед стерилизацией белком куриного яйца. Расплавленную желатину охлаждают до 50 °С и добавляют на 1 л среды один белок, предварительно взбитый в пену с двойным количеством воды. После тщательного размешивания среду кипятят 10 мин, фильтруют через вату и, разлив в пробирки, стерилизуют, как указано выше. Питательная желатина используется для определения протеолитической способности микробов.
Аннотация научной статьи по промышленным биотехнологиям, автор научной работы — Суханова С. М., Захарова Н. Е., Голубенко И. А.
Проведены сравнительные испытания новых коммерческих питательных сред для выделения стафилококков отечественных и зарубежных производителей (ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития РФ; ФГУП Государственный научный центр прикладной микробиологии, пос. Оболенск; ОАО “Биомед” им. И. И. Мечникова, Московская обл.; ЗАО Научно-исследовательский центр фармакологии, Санкт-Петербург; “НоваМед Лтд.”, Израиль). Качество оценивали по физико-химическим и биологическим показателям. Испытуемые питательные среды обеспечивали хороший рост специфически значимых тест-штаммов стафилококков, а также ингибирующие свойства в отношении тест-штаммов энтеробактерий. Техника использования традиционного посева на чашки гарантирует более высокую чувствительность и степень ингибиции питательных сред в сравнении с техникой нанесения инокулята на “НоваСтрик”.
Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Суханова С. М., Захарова Н. Е., Голубенко И. А.
COMPARATIVE EVALUATION OF NEW COMMERCIAL NUTRIENT MEDIA FOR ISOLATION OF STAPHYLOCOCCI
Comparative trials were carried out new commercial nutrient media made by Russian (Mirogen Research-and-Production Association, Ministry of Health of the Russian Federation; State Research Centerfor Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Serpukhov District, Moscow Region; and I. I. Mechnikov Biomed, Moscow Region; Research Center of Pharmacotherapy, Saint Petersburg) and foreign (NovaMed Ltd, Israel) manufacturers to isolate staphylococci. Their quality was assessed in terms of physicochemical and biological parameters. The test nutrient media provided a good growth of specifically important test staphylococcal strains and inhibited Enterobacteriaceae. The technique of using the traditional inoculum to Petri dish ensures a higher sensitivity and inhibition of nutrient media as compared to that of applying the inoculum to NovaStreak.
Рис. 2. Выявление бактерий рода Salmonella с использованием экспресс-теста Singlepath®-Salmonella.
фичные и простые в исполнении экспресс-тесты, предназначенные для микробиологического контроля продовольственного сырья и пищевой продукции. Они эффективны при скрининге образцов продукта на наличие патогенных бактерий рода Salmonella, Campylobacter, Listeria monocytogenes, E. шИ O157 и др. Их использование на пищевых предприятиях с целью обнаружения патогенной микрофлоры обеспечивает высокую надежность определения, существенно сокращает время анализа (до 24-48 ч) и затраты на его проведение. Метод также эффективно используется при идентификации колоний патогенных
Рис. 3. Использование теста Singlepath®-Salmonella для идентификации сальмонелл.
микроорганизмов. Singlepath®-тестирование не требует сложных процедур подготовки проб и использования приборов. Испытания экспресс-тестов Singlepath® во ВНИИ мясной промышленности РАСХН при выявлении сальмонелл в мясном сырье (в сравнении с классическим методом определения по ГОСТ 7702.2.3-93) показали высокую сходимость результатов.
1. ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579-2002). Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella. - М., 2008. (Переиздан в 2009 г. с поправкой от 29.05.2009).
2. Методы выявления патогенных микроорганизмов с использованием хроматографических экспресс-тестов производства Merck (Германия): Метод. рекомендации. № 24ФЦ/976. - М., 2004.
3. Fung D. Y. С. // Rapid Meth. Automation in Microbiol. - 20022003. - Vol. 1.
4. Singlepath® и Duopath® // Питательные среды и лабораторное оборудование. - М., 2009. - С. 35-39.
5. Thompson L., Lindhardt Ch. Singlepath® Salmonella // J. AOAC Int. - 2006. - Vol. 89, N 2. - P. 417-432.
С. М. Суханова, Н. Е. Захарова, И. А. Голубенко
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА НОВЫХ КОММЕРЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ
Проведены сравнительные испытания новых коммерческих питательных сред Для выделения стафилококков отечественных и зарубежных производителей (ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития РФ; ФГУП Государственный научный центр прикладной микробиологии, пос. Оболенск; ОАО “Биомед” им. И. И. Мечникова, Московская обл.; ЗАО Научно-исследовательский центр фармакологии, Санкт-Петербург; “НоваМед Лтд.”, Израиль). Качество оценивали по физико-химическим и биологическим показателям. Испытуемые питательные среды обеспечивали хороший рост специфически значимых тест-штаммов стафилококков, а также ингибирующие свойства в отношении тест-штаммов энтеробактерий. Техника использования традиционного посева на чашки гарантирует более высокую чувствительность и степень ингибиции питательных сред в сравнении с техникой нанесения инокулята на “НоваСтрик”.
Ключевые слова: питательные среды, стафилококк, элективный солевой агар, выделение, чувствительность, ингибиция
[гиена и санитария 1/2012
S. М. Sukhanova1, N. E. Zakharova2, I. A. Golubenko3 - COMPARATIVE EVALUATION OF NEW COMMERCIAL NUTRIENT MEDIA FOR ISOLATION OF STAPHYLOCOCCI
L. A. Tarasevich State Research Institute for Standardization and Control of Medical Biological Preparations, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow
Comparative trials were carried out new commercial nutrient media made by Russian (Mirogen Research-and-Production Association, Ministry of Health of the Russian Federation; State Research Centerfor Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Serpukhov District, Moscow Region; and I. I. Mechnikov Biomed, Moscow Region; Research Center of Pharmacotherapy, Saint Petersburg) and foreign (NovaMed Ltd, Israel) manufacturers to isolate staphylococci. Their quality was assessed in terms of physicochemical and biological parameters. The test nutrient media provided a good growth of specifically important test staphylococcal strains and inhibited Enterobacteriaceae. The technique of using the traditional inoculum to Petri dish ensures a higher sensitivity and inhibition of nutrient media as compared to that of applying the inoculum to NovaStreak.
Key words: nutrient media, Staphylococcus, elective saline agar, isolation, susceptibility, inhibition.
Стафилококки представляют собой широко распространенную группу микроорганизмов, которые вызывают заболевания, носящие характер либо аутоинфекции (при различных повреждениях кожи и слизистых оболочек), либо экзогенной инфекции, обусловленной контактно-бытовым, воздушно-капельным или алиментарным (при пищевых отравлениях) способами заражения. В последние годы вспышки токсикоинфекций, вызываемые, в частности, стафилококками, все чаще становятся объектами пристального внимания исследователей [7, 8]. Стафилококковые заболевания протекают тяжело, с высокой летальностью, особенно у детей раннего возраста и ослабленных больных. Патогенное действие оказывает преимущественно Staphylococcus aureus, относящийся к коагулазоположи-тельным стафилококкам [9]. Среди коагулазонегативных стафилококков к клинически значимым в первую очередь относятся S. epidermidis и S. saprophyticus [1].
В качестве основного метода диагностики стафилококковых заболеваний используют бактериологический метод исследования - посев патологического материала на питательные среды с последующим выделением чистой культуры и изучением свойств, характеризующих ее патогенность [3, 6]. Исследование на обсемененность стафилококками проводят, применяя питательную среду с высоким содержанием хлорида натрия, обеспечивающего ее элективные свойства.
Цель работы состояла в изучении свойств новых питательных сред, предлагаемых отечественными и зарубежными производителями для выделения стафилококков.
Материалы и методы
Объектами исследования стали “Питательная среда для выделения стафилококков сухая (солевой агар-М)” (ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития РФ, Махачкала); “Питательная среда для выделения стафилококков сухая (стафилококкагар) (ФГУП Государственный научный центр прикладной микробиологии, пос. Оболенск); “Элективный солевой агар для стафилококков - ПД” (ОАО “Биомед” им. И. И. Мечникова, Московская обл.); “Питательная среда для выделения стафилококков (элективный солевой агар)” (ЗАО “Научно-исследовательский центр фармакотерапии”, Санкт-Петербург); “НоваСтрик Питательный агар для выделения и идентификации микроорганизмов (комплект № 2 “НоваСтрик BD-508”), система,
Суханова С. М. - канд. биол. наук, рук. лаб. бактериологических питательных сред и автоклавирования ([email protected]); Захарова Н. Е. - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. бактериологических питательных сред и автоклавирования; Голубенко И. А. - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. бактериологических питательных сред и автоклавирования
готовая к применению (“НоваМед Лтд.”, Израиль) (представитель в РФ - ЗАО “ДАС”, Ростов-на-Дону).
Оценку качества сред проводили по физико-химическим (растворимость, pH, потеря в массе при высушивании, содержание аминного азота и хлоридов (в пересчете на хлорид натрия), прочность студня) и биологическим показателям [2]. Контроль специфической активности по биологическим показателям включал определение чувствительности сред с использованием тест-штаммов стафилококков - St. aureus “Виотко”, S. epidermidis ATCC 14 490, S. saprophyticus ATCC 15 305, оценку ингибирующих свойств с использованием тест-штаммов Escherichia coli 168/59 (O111:K59), E. coli ATCC 25 922, Pseudomonas aeruginosa 27/99, P. aeruginosa ATCC 27 853, P. aeruginosa 273, Proteus vulgaris HX 19 222, Salmonella typhimurium ATCC 14 028, Shigella flexneri ATCC 12 022, а также определение скорости роста и стабильности основных биологических свойств микроорганизмов. Использовали штаммы из коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ “Государственный научноисследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов” им. Л. А. Тара-севича” (ГИСК им. Л. А. Тарасевича) Минздравсоцразви-тия России. Оценивали по три серии каждой среды. Для определения чувствительности среды производили посев по 0,1 мл микробной взвеси каждого из тест-штаммов из разведений 10-5, 10-6, 10-7. Предварительно готовили взвесь культуры в 0,9% растворе хлорида натрия с оптической плотностью, соответствующей 10 единицам по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича (ОСО-4228-85 П), из которой получали необходимые разведения. Результаты по чувствительности и ингибирующим свойствам сред регистрировали каждые 24 ч в течение 2 сут. Инкубацию посевов проводили при 37 ± 1е. Оценивали показатель прорастания как отношение среднего количества колоний, образовавшихся на испытуемой среде, к среднему количеству колоний на контрольной среде, выраженное в процентах [5]. В качестве контрольной среды роста штаммов использовали “Питательный агар для культивирования микроорганизмов (СПА)” (ФГУП “НПО “Микроген”) и Violet Red Bile Agar (VRBA) в комплекте “НоваСтрик BD-508”.
Результаты и обсуждение
Принцип действия исследованных в работе сред состоит в том, что подавляющее большинство микроорганизмов возможной сопутствующей микрофлоры на среде с высоким содержанием хлорида натрия (70% и более) колоний не образует, тогда как на рост стафилококков такая концентрация хлорида натрия не влияет.
Все исследованные среды, кроме комплекта “НоваСтрик BD-508”, представляли мелкодисперсные порошки светложелтого цвета, которые хорошо растворялись в дистилли-
Сравнительные показатели испытуемых питательных сред
Чувствительность среды Ингибирующие свойства Срок год-
Название среды тест-штаммы; размер колоний через 48 ч инкубации (диаметр, мм) разве- дение тест-штаммы разве- дение pH ности готовой среды
Элективный солевой агар для стафилококков - ПД S. epidermidis ATCC 14 490, S. saprophyticus ATCC 15 305 (1,0-1,5) S. aureus "Виотко" (2,0-2,5) 10-6, 10-7* E. coli 168/59 (O111:K58); P. aeruginosa 27/99; P. vulgaris HX 19 222 ooo 7,1 14 дней
Элективный солевой агар S. epidermidis ATCC 14 490, S. saprophyticus ATCC 15 305 S. aureus "Виотко" (2,0-2,5) 10-6, 10-7* E. coli ATCC 25 922; P. aeruginosa ATCC 27 853; P. vulgaris HX 19 222 о о о 6,8 15 дней
Стафилококагар S. epidermidis ATCC 14 490, S. Saprophyticus ATCC 15 305 (2,0-3,0) S. aureus "Виотко" (2,0-2,5) 10-6, 10-7* E. coli 168/59 (O111:K58); P. aeruginosa 27/99; P. vulgaris HX 19 222 pop 7,2 15 дней
Солвой агар S. epidermidis ATCC 14 490, S. saprophyticus ATCC 15 305 (1,5-2,0) S. aureus "Виотко" (2,0-2,5) 10-6, 10-7* E. coli 168/59 (O111:K58); P. aeruginosa 273; P. vulgaris HX 19 222 ООО 7,2 10 дней
"НоваСтрик BD-508" S. epidermidis ATCC 14 490, S. saprophyticus ATCC 15 305 ( Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
риологических лабораторий: Метод. рекомендации. - М., 2004.
3. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. СанПин 2.3.2.1078-01. - М., 2002.
4. Захарова Н. Е., Суханова С. М., Голубенко И. А. // Вопр. пит. - 2008. - № 1, т. 77. - С. 48-51.
5. Методы контроля бактериологических питательных сред: Метод. указания. МУК 4.2.2317-08. - М., 2008.
6. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под ред. А. С.
Лабинской и др. - М., 2004.
7. Шевелева С. А. // Вестн. РАМН. - 2006. - № 5. - С. 43-51.
8. FujikawaН. // Biocontrol Sci. - 2010. - Vol. 15, N 3. - P. 75-80.
9. Han Z., Lautenbach E., Fishman N., Nachamkin I. // J. Med. Microbiol. - 2007. - Vol. 56, Pt 1. - P. 43-46.
10. Zadik P. M., Davies S., Wittaker S., Mason C. // J. Med. Microbiol. - 2001. - Vol. 50, N 5. - P. 476-479.
Е. А. Карпова1, А. Г. Малышева1, А. А. Ермаков1, Н. К. Сидоренкова2
АТОМНО-АБСОРБЦИОННОЕ ЭЛЕКТРОТЕРМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ МЫШЬЯКА В РАСТЕНИЯХ И ПРОДУКЦИИ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Разработаны оптимальные температурно-временные параметры электротермического атомноабсорбционного определения содержания мышьяка в растениях после их предварительного кислотного разложения. Модификатор матрицы — 1% раствор нитрата никеля или нитрата палладия. Кюветы (печи) простые из пористого графита или пиролитические. Аналитическая программа применима как для спектрометров с Зеемановской, так и дейтериевой коррекцией фона. Правильность методики оценивали по результатам анализа растительных государственных стандартных образцов состава с аттестованным содержанием мышьяка. Коэффициент вариации для диапазона 0,02—0,2 мг на 1 кг элемента составил 20—35%.
Ключевые слова: мышьяк, загрязнение окружающей среды
Е. A. Karpova1, A. G. Malysheva1, A. A. Ermakov1, N. К. Sidorenkova2 — ELECTROTHERMAL ATOMIC ABSORPTION DETERMINATION OF ARSENIC IN PLANTS AND PLANT FOODS
1A.N. Sysin Research Institute ofHuman Ecology and Environmental Hygiene, Ministry ofHealth and Social Development ofRussia 2State Agrochemical Service Center “Moskovsky”
The authors have developed the optimal temperature-time parameters of electrothermal atomic absorption determination of arsenic in plants after their acid predigestion. The matrix modifier is 1% nickel nitrate or palladium nitrate solution. Cuvettes (ovens) are simple, made of porous or pyrolytic graphite. The analytical program is suitable for both spectrometers with Zeeman and deuterium background correction. The correctness of the procedure has been estimated from the results of analysis of state reference samples certified for their arsenic content. The coefficient of variation was 20-35% for the concentration range of 0.02-0.2 mg/kg.
Карпова Е. А. - д-р биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. гигиены питьевого водоснабжения и санитарной охраны водоемов; Малышева А. Г. - д-р биол. наук, проф., руководитель лаб. физикохимических исследований ([email protected]); Ермаков А. А. - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. физико-химических исследований; Сидоренкова Н. К. - канд. биол. наук, ст. науч. сотр.
Так, существующая стандартная методика определения концентрации мышьяка в продуктах питания и продовольственном сырье [2, 3] основана на колориметрическом методе с использованием диэтилдитиокарбамата серебра. Методика трудоемка и продолжительна по времени (включает стадию отгонки арсина из раствора разложенной пробы и последующее измерение оптической
Читайте также: