Стафилококковая инфекция и ее диагностика курсовая

Методы микробиологической диагностики стафилококковых заболеваний отражены в схеме 1. Выполняется следующий комплекс методов исследования.

Бактериоскопический метод – микроскопия мазков из материала от больного, окрашенных по Граму. Выявление в мазках кокков, располагающихся небольшими группами по 2-3 бактерии; типичное расположение в виде гроздьев винограда характерно для чистых культур стафилококка (рис. 1 – цветная вкладка).

Бактериологический метод.Исследуемыйматериал засевают на чашки с желточно-солевым (ЖСА) и кровяным МПА, инкубируют при 37 0 С сутки. На 2 день учитывают характер

роста колоний на обеих средах. На желточно-солевом агаре колонии стафилококка имеют ровные края, гладкую поверхность, вокруг колонии образуется радужный венчик в результате расщепления лецитина яичного желтка ферментом лецитовителлазой; цвет пигмента колоний варьирует от золотистого до белого. На кровяном МПА вокруг колоний образуются зоны

гемолиза. Из типичных для стафилококка колоний делают мазок, окрашивают его по Граму, микроскопируют. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для получения чистой культуры. На 3 день проводят идентификацию выделенной культуры стафилококка с дифференциацией основных видов в соответствии с таблицей 2, определяют чувствительность к антибиотикам методом бумажных дисков и фаговар (набор для фаготипирования состоит из фагов 21 типа, разделенных на 4 группы; при внутрибольничных инфекциях наиболее часто встречаются фаговары 77 и 80).

Таблица 1.Этиология бактериальных раневых и гнойно-воспалительных инфекций

Аэробы

Анаэробы

Грамположительные бактерии Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Erysipelotrix rhusiopathiae Грамотрицательные бактерии Burkholderia cepacia, Citrobacter koseri, Edwardsiella tarda, Eikenella corrodens, Enterobacter spp, Escherichia coli, Haemophylus influence, Klebsiella spp, Listeria monocytogenes, Moraxella catarrhalis, Proteus spp, Pseudomonas spp, Salmonella enterica, Serratia spp, Spirillum minus, Streptobacillus moniliformis, Vibrio vulnificus

Неспорообразующие грамположительные бактерии Bacteroides spp, Prevotella spp, Porphiromonas spp, Fusobacterium spp, Veilonella spp Неспорообразующие грамотрицательные бактерии Peptostreptococcus spp, Propionibacterium spp Cпорообразующие грамположительные бактерии Clostridium perfringens, Clostridium novy, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum, Clostridium sordelli, Clostridium histolyticum, Clostridium sporogenes, Clostridium ramosum

Схема 1. Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций
Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи.
Микроскопический метод Выявление грамположительных кокков (группами по 2-3 клетки) в мазках из материала от больного, окрашенных по Граму Серологический метод РНГА или РН для определения α-антитоксина в сыворотке крови больных хроническими стафилококковыми инфекциями. ИФА для определения антител к стафилококку. Имеет вспомогательное значение Бактериологический метод 1 день. Посев материала на чашки с желточно-солевым (ЖСА), кровяным МПА, сахарным МПБ. 2 день -учет характера роста колоний. На ЖСА колонии стафилококка с ровными краями, гладкой поверхностью, радужным венчиком вокруг, цвет - от золотистого до белого.	На кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ –равномерное помутнение. В мазке из колоний в окраске по Граму – кокки в виде гроздьев винограда. Пересев оставшейся части колонии на скошенный МПА для получения чистой культуры, а с сахарного МПБ на кровяной МПА и ЖСА для получения изолированных колоний. 3 день - идентификация выделенной культуры стафилококка, дифференциация видов по биохимическим свойствам, определение чувствительности к антибиотикам и фаговара. Выделение чистой культуры с ЖСА и кровяного МПА. 4 день.Заключение о виде стафилококка. Идентификация культуры, выделенной из сахарного МПБ 5 день.Заключение о виде стафилококка, выделенного из сахарного МПБ.

Таблица 2. Дифференциация основных видов стафилококка

Признаки	Виды стафилококков
S. aureus	S. epidermidis	S. saprophyticus
Плазмокоагулаза	+	-	-
Лецитиназа	+	-	-
Альфа-токсин	+	-	-
Анаэробная ферментация глюкозы	+	+	-
Анаэробная ферментация маннита	+	-	-
Чувствительность к новобиоцину	S	S	R

Обозначения: (+) – наличие признака; (-) – отсутствие признака; S - чувствительный; R – резистентный.

Для выявления плазмокоагулазы цитратную плазму крови кролика разводят в 2 раза, разливают по 0,4 мл в пробирки, куда вносят петлей культуру стафилококков. Результаты регистрируют через 2, 4, 24 часа. При наличии плазмокоагулазы образуется сгусток.

В некоторых случаях у выделенных чистых культур стафилококка определяют наличие ДНК-азы, каталазы, лизоцимной активности, фибринолизина, гиалуронидазы.

Лизоцимную активность выявляют по зонам просветления вокруг колоний стафилококка при его посеве на МПА в чашках Петри с культурой Micrococcus luteus.

Определение ДНК-азы. Суточную агаровую культуру стафилококка засевают на МПА в чашке Петри, содержащий ДНК. После инкубации посевов при температуре 37 0 С в течение 18-24 часов поверхность МПА заливают 1 N раствором соляной кислоты. Наличие ДНК-азы характеризуется появлением зоны просветления вокруг колоний.

Каталазный тест. Чистую культуру стафилококка вносят в каплю 3%-10%-го раствора перекиси водорода на стекле и растирают круговыми движениями. При наличии каталазы перекись водорода разлагается с образованием пузырьков кислорода.

Cерологический методв диагностике стафилококковых инфекций имеет вспомогательное значение, используясь, в основном, для диагностики хронических процессов (остеомиелит, септикопиемия и др.). Для определения антител к токсину стафилококка применяют РНГА с эритроцитарным диагностикумом, нагруженным α-токсином стафилококка или РН (реакция нейтрализации гемолитической активности стафилококкового токсина антитоксинами сыворотки крови больного в присутствии эритроцитов кролика). У здоровых лиц титр стафилококкового антитоксина составляет 0,5-4 АЕ. Разработан также ИФА.

Клинически значимые виды стафилококка Коагулазоположительные: S. aureus, S. hyicus Коагулазоотрицательные: S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus, S.hominis

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Выполнил: Новак А.Л., 301 гр., л/ф, Владивосток, 1998.

Несмотря на то, что стафилококки принадлежат к числу наиболее легко обнаруживаемых и распознаваемых микроорганизмов, не требующих сложных диагностических приемов для их выявления, в практической работе микробиологи до сих пор испытывают определенные трудности при установлении их причинной роли в ряде различных заболеваний. С одной стороны, присутствие патогенных стафилококков, обнаруживаемое в исследуемом материале, не всегда является убедительным доказательством их этиологического значения.

С другой, учитывая большое разнообразие проявлений биологической активности этих микробов, зависящее от разных, не всегда поддающихся учету факторов, широкую их изменчивость под влиянием лекарственных веществ и самого макроорганизма, довольно сложно бывает определить их потенциальную патогенность. Наконец, третья причина связана с тем, что стафилококки являются представителями нормальной микрофлоры из группы условно патогенных микроорганизмов и, наряду с непатогенными, патогенные представители обитают в организме людей, распространяясь при этом весьма неравномерно на разные участки человеческого тела. Если выделение патогенного стафилококка, из крови больных людей и различных полостей, которые принято считать стерильными, в подавляющем большинстве случаев может служить доказательством его роли как возбудителя болезни, то присутствие стафилококков на слизистых зева, носа и т. д. даже при явном болезненном состоянии их требует большой осторожности исследователя в выводах об этиологии данных заболеваний.

Поэтому, естественно, не может быть общих рекомендаций, как при диагностике различных стафилококковых инфекций, так и при микробиологических исследованиях участков тела человека и разных объектов внешней среды. Широкий обмен мнениями между микробиологами научных учреждений и практических лабораторий, осуществляемый на съездах и конференциях, посвященных проблемам стафилококковых инфекций, а также при личных контактах, казалось бы, должен был привести к определенным взглядам на различные методы исследования, предлагаемые для выделения и идентификации стафилококков. Однако большое число запросов, поступающих из лабораторий СЭС и лечебных учреждений, свидетельствует о явных затруднениях, которые возникают у исследователей при решении разных вопросов микробиологической диагностики стафилококков, а в ряде микробиологических учреждений бытуют еще некоторые устаревшие методы и приемы, приводящие к неправильным оценкам и даже досадным недоразумениям.

Важным условием эффективности лабораторной диагностики является сочетанное определение качественных и количественных критериев содержания патогенных стафилококков в исследуемом материале. Исходя из этого, я считаю необходимым изложить ряд методов основных микробиологических исследований, наиболее простых и доступных для каждой практической и научной лаборатории, которыми мы пользуемся в течение многих лет.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВ

Предварительная диагностика стафилококков может основываться на бактериоскопическом изучении препаратов - мазков, окрашенных по Граму. Патогенные стафилококки, помимо гроздевидного расположения, характеризуются правильной сферической формой клеток. Обнаружение стафилококков, находящихся внутри клеток, позволяет дать ответ о наличии стафилококковой инфекции. В большинстве же случаев для точного установления патогенности обнаруженных стафилококков требуется выделить эти микроорганизмы в чистой культуре путем посева исследуемого материала на плотные питательные среды. В настоящее время ассортимент дифференциальных, элективных и накопительных сред, предложенных для выделения патогенных стафилококков, весьма значителен и продолжает расширяться.

Многие исследователи на основе знания основных биохимических характеристик и питательных потребностей патогенных стафилококков при конструировании сред стремятся повысить их высеваемость и обеспечить возможность осуществлять их количественный учет, получить надежный способ отличать потенциально болезнетворные стафилококки от сапрофитов. Употребление жидких накопительных сред для перви гемолитическую активность стафилококков. При этом необходимо помнить, что гемолитическая способность, определяемая на чашках с кровяным агаром, зависит от многих факторов - вида крови, ее концентрации, наличия в ней антитоксинов, толщины слоя среды, содержания углекислого газа в атмосфере культивирования, густоты посева, присутствия и характера сопутствующей флоры и т. д.

При отборе колоний с кровяного агара необходимо отвивать как гемолитические, так и не дающие гемолиза, особенно если исследование проводится на среде с человеческой или лошадиной кровью, а отсутствие гемолиза на таких средах не позволяет заключить об отсутствии вообще гемолитической активности. Поэтому использование кровяного агара для первичного посева целесообразно только при обследовании объектов, не содержащих посторонней микрофлоры, и желательно добавлять в питательную среду кровь кролика или барана.

Если же проводится исследование гноя открытых ран или отделяемого язв или свищей, то следует пользоваться элективно-дифференциальной средой для стафилококков - желточно-солевым агаром (ЖСА) Г. Н. Чистовича. Элективность этой среды обеспечивается высоким содержанием хлористого натрия, а добавленный яичный желток позволяет выявлять лецитовителлазную активность, которая является одним из показателей патогенности стафилококков и в силу этого ЖСА более четко дифференцирует патогенных представителей, чем кровяной агар. Приготовление ЖСА несложно. Заготовляют впрок и стерилизуют в автоклаве при 120 °С" в течение 20 мин питательный агар (МПА или Хоттингера) рН 7,2-7,4, содержащий 10% поваренной соли. Перед употреблением солевой питательный агар растапливают, остужают до 45-50 °С и добавляют к нему 20% по объему стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 200 мл физиологического раствора). Для лучшего эмульсирования желательно иметь колбы со стеклянными бусами. После тщательного перемешивания среду разливают по 20-25 мл в чашки, которые могут храниться в холодильнике в течение нескольких дней. Следует производить массивный посев исследуемого материала на чашки с ЖСА, а инкубацию вести в течение 2 суток при 35-37° С. Посторонняя флора резко подавляется, стафилококки же на ЖСА вырастают практически в чистой культуре. Непосредственно при просмотре чашек вокруг колоний отмечается образование радужных венчиков и мутной зоны - лецитовителлазная реакция. Такие колонии, не менее двух из каждого посева, отвивают на скошенный мясо-пептонный агар для последующей проверки выросших культур в реакции плазмо-коагуляции.

Чтобы избежать ошибок в определении желточной реакции, необходимо иметь в виду, что иногда наблюдается помутнение среды без радужного ободка, в этом случае проба на лецитовителлазу считается отрицательной. Если же колонии, выросшие на ЖСА, не дают лецитовителлазной реакции, т. е. не окружены радужным венчиком, но имеется рост стафилококков, то их тоже считают подозрительными и также отвивают не менее двух из каждого такого посева на чашки с простым питательным агаром пятнами диаметром 5-10 мм. После суточного инкубирования при 37° С полученные макроколонии проверяют в реакции плазмоагглютинации, для чего микробную массу размешивают петлей на стекле в каплях цитратной кроличьей или человеческой плазмы, разведенной 1 :4. Образование хлопьев учитывают в течение 30с-1 мин. При наличии плазмоагглютинации такие штаммы считают подозрительными и отвивают на скошенный агар для дальнейшего изучения в коагулазной реакции.

При таком отборе число пропускаемых штаммов патогенных стафилококков человеческого происхождения невелико, культуры же, выделенные от животных, требуется проверять в реакции плазмокоагуляции. Коагулазная проба является основным признаком, определяющим болезнетворность стафилококков, поэтому ее постановка требует к себе максимального внимания. Для выявления коагулазной активности у стафилококков, выделенных от людей, можно пользоваться как цельной кровью, так и плазмой кроликов или человека. Можно использовать также кровь или плазму, взя результатов проводится обязательно дважды: через 2-3 ч и 24 ч. Учитывают свертывание плазмы и образование сгустков. Обычно культуры, активно продуцирующие коагулазу, дают положительную реакцию уже через 2-3 ч. а если они обладают и выраженной фибринолитической активностью, то первоначально образовавшиеся сгустки могут подвергнуться расплавлению к концу суток. Слабокоагулирующие штаммы могут давать положительную реакцию в поздние сроки-к концу суток. Опыты, давшие сомнительный результат, необходимо повторить.

Некоторые исследователи, получив отрицательный или сомнительный результат, оставляют пробирки на столе. Этого делать нельзя, так как свертывание плазмы в более поздние сроки может носить не специфический характер и его не следует принимать во внимание. Стафилококки, дающие положительную коагулазную пробу, должны рассматриваться как потенциально патогенные, независимо от наличия или отсутствия у них гемолитических свойств и характера пигмента, их относят к виду St. aureus и в дальнейшем подвергают фаготипизации и проверке на чувствительность к антибиотикам. Углубленное изучение стафилококков показало, что основной признак па-тогенности - коагулазная реакция может подвергаться изменчивости при воздействии различных факторов (Г. Н. Чистович, 1961; Е. М. Падерина, 1966), поэтому в ряде случаев, при выделении коагулазонегативных стафилококков в монокультуре из патологических очагов, целесообразно изучить у них другие признаки потенциальной болезнетворности и прежде всего - способность ферментировать маннит в анаэробных условиях.

Известно, что среди коагулазоотрицательных часть культур обладает способностью расщеплять маннит в анаэробных условиях (8,4% -по данным А. А. Акатова и М. Л. Хатеневер, 1974). Определение ферментации маннита в анаэробных условиях технически очень просто и осуществляется путем посева уколом исследуемых культур в пробирки с высоким столбиком полужидкого агара Хоттннгера, содержащего 1% маннита и 0,004% индикатора бромкрезолпурпура или бромтимолблау (рН == 7,2). Эту среду перед посевом "регенерируют", т. е. кипятят в водяной бане, быстро охлаждают, а после посева заливают слоем стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 5 дней. Однако в значительном числе случаев результаты могут быть учтены уже через сутки. Наряду с реакцией плазмокоагуляции, большое значение приобрела еще одна важная способность стафилококков, характеризующая их потенциальную патогенность, -дезоксирибонуклеазная активность.

Многие исследователи сообщают о высокой корреляции этого признака с коагулазной активностью и токсигенностью изучаемых культур; отмечают, что стафилококки, выделенные из патологического материала, как правило, обладают ДНК-азой. Коагула-зопозитивные штаммы, полученные от носителей, могут не иметь этого фермента, и обычно отсутствие дезоксирибонуклеазной активности сочетается с низкой биохимической способностью и атоксигенностью таких культур стафилококков. По наблюдениям некоторых исследователей, среди коагулазонегативных штаммов стафилококков, но обладавших другими признаками патогенности, выделенных в ряде случаев от больных с различными гнойными инфекциями, дезоксирибонуклеазную активность проявляли от 10 до 29% таких культур (И. И. Панышева и сотр., 1967; Franklin и соавт., 1966; Lierd и Golde, 1970).

В настоящее время этот тест может служить надежным дифференциальным признаком между патогенными и непатогенными стафилококками и в то же время может помочь в дифференциации степени патогенности коагулазопозитивных штаммов и, безусловно, привлечет внимание к коагулазонегативным, но обладающим этим ферментом культурам стафилококков и в ряде случаев позволит отнести последние к болезнетворным формам с большей уверенностью. Методика определения дезоксирибонуклеазной активности несложна, в основу ее положен метод Джеффриса. Готовят впрок 2% МПА (рН-8,6), содержащий ДНК (2 мг/мл среды), разливают по флаконам и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин. Перед разливом в чашки к среде добавляют CaCIa (0,8 мг/мл). На подс деполимеризации ДНК. После 18-20-часовой инкубации поверхность агара заливают 5 мл IN раствора НС1 и через 3-5 мин учитывают зоны просветления. Реакции оценивают в крестах.

При этом следует учесть, что интенсивность зоны деполимеризации на плотной среде не всегда совпадает с количеством продукции этого фермента у исследуемых стафилококков в жидких средах. Для обнаружения фибринолизина используют несколько усовершенствованный метод Кристи с сотр. Среда Кристи-Чепмена имеет следующий состав: мясной экстракт-0,45 г, пептон-0,75 г, хлористый натрий-1,2 г, агар-2,75 г, вода-130 мл, рН среды == 7,0. Стерилизуется в автоклаве и сохраняется впрок. Перед опытом среду растапливают, остужают до 50 °С и добавляют 15-20% стерильной цитратной человеческой плазмы. Смесь прогревается в водяной бане при 65-70°С в течение 2- 5 мин до появления ясной мути, а затем разливается в чашки. Испытуемые культуры засевают "пятнами" по 15-20 на чашку. Посевы инкубируют при 37 °С. Учитывается образование зон просветления вокруг колонии первоначально через 14 ч, затем через 24 и 48 ч, так как реакция у различных культур течет неодинаково быстро и у ряда штаммов она развивается в более поздние сроки. Фибринолитический тест мы считаем весьма пригодным для определения потенциальной болезнетворности стафилококков, но оцениваем только в комплексе с другими признаками активности. Гиалуронидазная активность определяется по методу Мак-Клина в модификации М. Ш. Могилевского и Л. С. Коган (1949). Раствор гиалуроната дающий в присутствии 2 N уксусной кислоты типичный сгусток, разливается по 0,5 мл в стерильные пробирки. Добавляется 0,5 мл суточной культуры стафилококка в пептонной воде. Контролями служат: гиалуропат + дистиллированная вода и гиалуропат + незасеянная среда. Смеси встряхиваются и выдерживаются при 37 °С 15-20 мин. Затем в каждую пробирку добавляется по две капли 2 N раствора уксусной кислоты и встряхивается. В контролях должен образоваться слизистый комочек. В опыте при наличии гиалуронидазы он отсутствует, что свидетельствует о деполимеризации гиалуроновой кислоты микробным ферментом.

Для изучения токсигенности стафилококков удобно пользоваться методом, предложенным Илеком и Леви (1950), позволяющим определить типы гемолизинов. С этой целью готовятся чашки с питательным агаром, содержащим 5% отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана, кролика и человека. На поверхность питательной среды по диаметру помещают стерильную полоску фильтровальной бумаги, смоченную альфа-антитоксической сывороткой. Отступив 1-2 мл от края полоски, перпендикулярно к ней засеивают штрихами исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после чего учитывают результаты. Альфа-гемолиз проявляется в виде полного просветления среды вокруг штриха культуры и нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой. Он выявляется на средах с кроличьими и бараньими эритроцитами Бета-гемолиз на агаре с бараньей кровью дает частичное просветление, зона которого имеет буровато-пурпурный оттенок. Это "тепло-холодовый" токсин и лучше выявляется после дополнительного суточного выдерживания чашек в холодильнике при температуре +4 °С по характерному послойному гемолизу бараньих эритроцитов и не централизуется альфа-антитоксической сывороткой. На кроличьих эритроцитах он не активен. Дельта-гемолизин определяется по узкой полоске гемолиза бараньих и кроличьих эритроцитов, не нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой.

Однако образование дельта-гемоли-зина на этих чашках может быть замаскировано действием альфа-токсина и поэтому его следует проверять на средах с эритроцитами человека или лошади. Таким образом, для определения всех 3 типов гемолизинов достаточно использовать эритроциты барана и человека или лошади. Для определения вирулентности стафилококков существуют несколько различных методов заражения белых мышей. Наиболее простым является введение 0,1 мл суточной бульонной культуры испытуемого стафилококка в хвостовую вену. Учет гибели животных осуществляется в течение 10 суток, регистрирую дельта-токсигенностью. Для сравнения вирулентности стафилококковых культур можно использовать их способность вызывать дермонекротическую реакцию у кроликов. Готовят 4-миллиардную взвесь суточной агаровой культуры стафилококка в физиологическом растворе, а из полученной густоты делают разведения, чтобы получить 2- и 1-миллиардные взвеси. Из каждого разведения в объеме 0,1 мл, что составляет 100, 200, 400 миллионов микробных тел, вводят кролику в выстриженную или депилированную накануне кожу. На одном кролике можно одновременно поставить до 8 внутрикожных проб. Ежедневно отмечают проявления дермонекротической реакции, а окончательно на 4-е сутки. За минимальную дермонекротическую дозу принимают то наименьшее количество культуры, которое дает некроз на 4-е сутки (Г. В. Выгодчиков, 1963).

А.М.Смирнова, А.А.Трояшкин, Е.М.Падерина: микробиология и профилактика стафилококковых инфекций - "Медицина", 1977.

Стафилококковые инфекции: российский сб. науч. тр. - С.-П., 1991.

А.М.Смирнова: вопросы иммунологии и микробиологии стафилококковых и стрептококковых инфекций - Ленинград, 1975.

Лекция по теме. Методическая разработка кафедры.

курсовая работа Особенности морфологии и физиологии микроорганизмов рода Staphylococcus Тип работы: курсовая работа. Добавлен: 11.07.2014. Год: 2013. Страниц: 27. Уникальность по antiplagiat.ru:

2 Особенности морфологии и физиологии микроорганизмов
рода Staphylococcus

2.5 Факторы патогенности

Патогенность, понимаемая как способность микроорганизмов вступать во взаимодействие с восприимчивым макроорганизмом с развитием в результате этого инфекционного процесса (заболевания), является полидетерминантным признаком, обусловленным совокупным действием различных биологических характеристик инфекта [1].

1. Факторы адгезии — прикрепление стафилококков к клеткам тканей обусловлено их гидрофобностью (чем она выше, тем сильнее проявляются адгезивные свойства), а также адгезивными свойствами полисахаридов, возможно также белка А, и способностью связывать фибронектин (рецептор некоторых клеток).

в) истинный лейкоцидин — токсин, отличающийся от гемолизинов по антигенным свойствам, избирательно действует на лейкоциты, разрушая их;
г) экзотоксин, вызывающий синдром токсического шока (СТШ). Он обладает свойствами суперантигена. Для СТШ характерны повышение температуры, снижение артериального давления, кожные высыпания с последующим шелушением на кистях и стопах, лимфоцитопения, иногда диарея, поражение почек и др. К продукции и секреции этого токсина способны более 50 % штаммов S. aureus.
д) энтеротоксины (А, В, CI, С2, СЗ, D, Е). Они характеризуются антигенной специфичностью, термостабильностью, устойчивостью к действию формалина (не превращаются в анатоксины) и пищеварительных ферментов (трипсина и пепсина), устойчивы в диапазоне рН от 4,5 до 10,0. Энтеротоксины являются низкомолекулярными белками с молекулярной массой от 26 до 34 кД со свойствами суперантигенов.

4. Сильные аллергизирующие свойства, которыми обладают как компоненты структуры клеток, так и экзотоксины и другие секретируемые бактериями продукты жизнедеятельности. Стафилококковые аллергены способны вызывать реакции гиперчувствительности как замедленного типа (ГЧЗ), так и немедленного типа (ГЧН). Стафилококки являются главными виновниками кожных и респираторных аллергий (дерматиты, бронхиальная астма и т.п.). Особенность патогенеза стафилококковой инфекции и ее тенденция к переходу в хроническую форму коренятся в эффекте ГЧЗ.

5. Перекрестно реагирующие антигены (с изоантигенами эритроцитов А и В, почек и кожи — индукция аутоантител, развитие аутоиммунных заболеваний).

7. Митогенное действие стафилококков в отношении лимфоцитов (этим действием обладают белок А, энтеротоксины и другие продукты, секретируемые стафилококками) [3].

3 Антигенные особенности стафилококков

4 Классификация и таксономия стафилококков
В современной таксономии стафилококки имеют следующую систематику:

Род включает 34 вида:
S. arlettae - S. aureus - S. auricularis - S. capitis - S. caprae - S. carnosus - S. caseolyticus - S. chromogenes - S. cohnii - S. delphini - S. epidermidis - S. equorum - S. felis - S. fleurettii - S. gallinarum - S. haemolyticus - S. hominis - S. hyicus - S. intermedius - S. kloosii - S. lactis - S. lentis - S. lugdunensis - S. lutrae - S. muscae - S. pasteuri - S. pettenkoferi -S. piscifermentans - S. saprophyticus - S. schleiferi - S. sciuri - S. simulans - S. succinus - S. vitulus - S. warneri - S. xylosus [4].

Они делятся на две группы:
- коагулазоположительные (6 видов);
- коагулазоотрицательные (28 видов).

Классификация стафилококков по степени патогенности:

Классификация является относительный, ибо патогенные проявления стафилококков зависят не только от их биологических свойств, но и от состояния организма человека, его устойчивости и реактивности.

5 Среды для выделения и первичной идентификации стафилококков

Такие колонии, не менее двух из каждого посева, отвивают на скошенный мясопептонный агар для последующей проверки выросших культур в реакции плазмокоагуляции. Чтобы избежать ошибок в определении желточной реакции, необходимо иметь в виду, что иногда наблюдается помутнение среды без радужного ободка, в этом случае проба на лецитовителлазу считается отрицательной. Если же колонии, выросшие на ЖСА, не дают лецитовителлазной реакции, т. е. не окружены радужным венчиком, но имеется рост стафилококков, то их тоже считают подозрительными и также отвивают не менее двух из каждого такого посева на чашки с простым питательным агаром пятнами диаметром 5-10 мм. После суточного инкубирования при 37 °С полученные макроколонии проверяют в реакции плазмоагглютинации, для чего микробную массу размешивают петлей на стекле в каплях цитратной кроличьей или человеческой плазмы, разведенной 1/4. Образование хлопьев учитывают в течение 30с - 1 мин.

Помимо кровяного агара и ЖСА, также используют следующие среды:
Молочно-солевой агар. В 100 см 3 МПБ растворяют 6.5 г хлорида натрия, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,4, стерилизуют при 121 °C 20 мин. Перед использованием агар расплавляют, охлаждают до 45 °С, добавляют 10 % стерильного обезжиренного молока и разливают по чашкам Петри. На этой среде определяют пигментообразование и способность к росту при наличии 6,5 % хлорида натрия.
Лактозо-солевой бульон с фенолротом. В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара. Устанавливают рН 6,8, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121°С 15 мин. При росте коагулазоположительных стафилококков среда желтеет (тест на коагулазу положительный).
Теллурит-полимиксин-желточный агар Крисли. В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г маннита, 20 г хлорида натрия, 2 г хлористого лития, 18 г агара. Устанавливают рН 7,3, стерилизуют 15 мин при 121 °С.
Перед использованием в среду добавляют 100 см 3 30 %-ной желточной эмульсии (на физиологическом растворе), 0,4 см 3 стерилизованного фильтрацией 1 %-ного водного раствора полимиксина М, 10 см 3 стерилизованного автоклавированием (121 °С 15 мин) 1 %-ного водного.
раствора теллурита натрия.
Среда Джиолиотти и Кантони. В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г маннита, 5 г хлористого натрия, 1,2 г глицина, 3 г пирувата натрия. Устанавливают рН 6,9, стерилизуют при 115 °С 20 мин. Перед употреблением к среде добавляют 0,1 см 3 1 %- ного водного раствора теллурита натрия, стерилизованного фильтрацией. При росте коагулазоположительных стафилококков наблюдается почернение среды или черный осадок.
Среда Бэрда-Паркера. К 90 см 3 основной среды с температурой 45 °С добавляют 6,3 см 3 глицинового раствора, 1 см 3 раствора теллурита натрия, 5 см 3 эмульсии желтка, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда пригодна к использованию в течение 28 дней (хранение при 4 °С). Перед посевом на поверхность среды наносят 0,5 см 3 20 %-ного водного раствора пирувата натрия, стерилизованного фильтрацией; распределяют по поверхности, подсушивают.
Колонии коагулазоположительных стафилококков черные, блестящие, с узкой серо-белой полосой и окружены прозрачной зоной.
Желточная эмульсия. Свежее куриное яйцо выдерживают в 0,001 %-ном растворе HgCl₂. Соблюдая требования асептики, отделяют желток и эмульгируют его в 200 см 3 физиологического раствора.
Глициновый раствор. Глицин — 20г,дистиллированная вода - 100 см 3 . Стерилизуют при 120 °С 15 мин.
Раствор теллурита натрия. Теллурит натрия - 1 г, дистиллированная вода - 100 см 3 . Стерилизуют фильтрацией.
Среда Чагогана-Бернса. К 100 см 3 МПА добавляют 3,3 см 3 ОД %-ного водного раствора кристаллического фиолетового и 5 г лактозы. Устанавливают рН 6,8. Стерилизуют автоклавированием. Колонии патогенных стафилококков растут быстрее, чем непатогенных, и приобретают фиолетовый или оранжевый цвет.
Среда Чемпена (для выделения патогенных стафилококков).
Вариант 1: пептон - 1 %, D-маннит - 1 %, натрия хлорид - 7,5 %, дрожжевой экстракт — 0,25 %, двузамещенный фосфорнокислый калий - 0,5 %, агар-агар - 1,5 %, Среду стерилизуют 90 мин при 110 °С, устанавливают рН 7,0 и добавляют 10 % стерильного обезжиренного молока (молоко способствует лучшему образованию пигмента).
Вариант 2: пептон - 1 %, дрожжевой экстракт - 0,25 %, желатин -3 %, лактоза - 0,2 %, D-маннит - 1 %, натрия хлорид- 7,5 %, двузамещенный фосфорнокислый калий — 0,5 %, агар-агар — 1,5 %. Стерилизуют 90 мин при 110 °С, устанавливают рН 7,0.
Коагулазной активностью обладает 24-56% штаммов S.hyicus sb. hyicus, однако реакция чаще замедленная [10].

6 Внутриродовая и межвидовая идентификация стафилококков

Во внутриродовой идентификации применяют бактериологические, микроскопические и серологические методы. Основным является бактериологический метод. Материал для исследования - кровь, гной, слизь из носа и зева, отделяемое ран, мокрота (при пневмонии), испражнения (при колите), подозрительные продукты, рвотные массы и промывные воды желудка, испражнения - при пищевых интоксикациях.
Имеются принципиальные схемы выделения и идентификации стафилококков, в т.ч. с использованием микротест-систем.
В общем виде схема выглядит следующим образом. Проводят бактериоскопию, выявляя грамположительные кокки в виде гроздей винограда (стафилококки). Высевают материал на простые питательные среды. Подозрительные колонии отбируют и пересевают для изучения на дифференциальные среды - на кровяной агар (гемолиз), молочно - солевой и молочно - желточно - солевой агары (за счет NaCl угнетается рост посторонней микрофлоры, использование сред позволяет лучше выявить пигмент и лецитиназу). Выделенную культуру идентифицируют по видовым признакам, определяют наличие золотистого пигмента, плазмокоагулазную активность, сбраживание маннита, гемолиз, чувствительность к антибиотикам, проводят фаготипирование.
Из серологических тестов чаще применяют РПГА и ИФА для выявления антител к видоспецифическим антигенам (тейхоевым кислотам).
Для определения энтеротоксигенности чаще применяют биологический метод, определение энтеротоксина в реакции преципитации в агаре, определение РНК- азы (коррелирует с выработкой энтеротоксина).
Из видоспецифических антигенов отдельно следует сказать о белке А золотистого стафилококка, имеющего важное значение в патогенезе и лабораторной диагностике. Уникальным свойством белка А является его способность связывать Fc- фрагменты иммуноглобулинов (субклассов 1,2 и 4 IgG). Белок А, неспецифически связывая Fc- фрагмент IgG, активирует компоненты комплемента по классическому и альтернативному пути и усиливает активность натуральных киллеров (клеток NK). Активация приводит к развитию различных местных и системных реакций (анафилаксии, феномена Артюса), угнетению опсонофагоцитарных реакций.
Способность белка А взаимодействовать с любыми (не только специфическими к стафилококку) иммуноглобулинами затрудняет серологическую диагностику стафилококковых инфекций, особенно сепсиса. За счет этого механизма (наличия белка А в крови) у этих больных могут быть выявлены ложноположительные серологические тесты на другие инфекции.
Способность стафилококков за счет белка А нагружаться иммуноглобулинами (в т.ч. специфическими антителами к различным возбудителям) используется в реакции коагглютинации. Насаженные на стафилококки (стафилококковый реагент из инактивированных микробных клеток) специфические антитела за счет свободных активных центров при взаимодействии с соответствующим антигеном (суспензией культуры микроорганизма) дают быструю реакцию агглютинации (коагглютинации - поскольку антитела агглютинируют культуру не самостоятельно, а в комплексе со стафилококками, что и обеспечивает быстрое осаждение тяжелых - нагруженных стафилококками комплексов совместно со специфическим искомым агентом).
Белок А широко используют также в ИФА для выявления специфических IgG- антител (конъюгаты "белок А - пероксидаза"), стафилококковый реагент - для дифференциации титров IgG- и IgM- антител в серологических реакциях по снижению титров IgG- антител после обработки проб сыворотки крови стафилококковым реагентом [7].

Принцип работы:

Контроль качества: Химический контроль качества реактивов, используемых при производстве СТАФИтест, осуществляется стандартными методами. Производственные партии пластинок контролируются с помощью контрольных референтных бактериальных культур. Для работы с пластинками СТАФИтест в лаборатории рекомандуем использовать следующие контрольные штаммы.
Таблица 1 – Реакции контрольных штаммов

7 Сходство, отличия и дифференциация микроорганизмов, принадлежащих к роду Staphylococcus с близкородственными родами Micrococcus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus

Общие признаки вышеперечисленных родов. Грамположительные, сферической или шаровидной формы кокки с диаметром 0,5 – 2 мкм. Располагаются одиночно, парами, короткими цепочками. Клетки родов Staphylococcus и Micrococcus могут располагаться в виде неправильных скоплений. Неподвижны. Факультативные анаэробы, за исключением рода
Micrococcus (аэробы). Все они растут в широком диапазоне температур (20-37 °С). Растут в присутствии хлорида натрия (NaCl) в концентрациях 5-10 %. Ферментируют углеводы с образованием кислоты. Распространены на поверхностях слизистых и кожи, в кишечнике животных и человека.

Таблица 2 - Дифференциация микроорганизмов.

Род		+	Белый, кремовый, желтый и оранжевый цвет	Среды содержащие пептон, глюкозу, кровь или сыворотку	7,0 – 7,5	34
Micrococcus	+	+	Желтый или красный цвет	Обычные среды содержащие пептон	9
Enterococcus	-	Красный и лимонно-желтый цвет	МПА или среды содержащие кровь	4,5 – 10	16
Streptococcus	+	-	Желтый и красный цвет	Среды содержащие кровь или сыворотку	7,2 – 7,4	21
Lactococcus	-	+	Среды содержащие углеводы и белки	6,3 - 6,5	5

Факторы высокого риска по развитию послеродового мастита:

Лечение мастит
и т.д.

* Примечание. Уникальность работы указана на дату публикации, текущее значение может отличаться от указанного.

Читайте также: