Virulence plasmids in salmonella

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Раков А. В., Шубин Ф. Н., Кузнецова Н. А.

During the period from 1995 till 2005 Salmonella enteritidis strains with no virulence plasmids reached 3.3% (171 strains) of all the strains under study. As the tests conducted with polymerase chain reaction showed, S. enteritidis strains which did not contain plasmids of 38 MDA in weight, had been at the same time those that did not contain virulence plasmids. The plasmids of other molecular weight did not have an effect on phenotypic properties of a microorganism. The Salmonella infection provoked by S. enteritidis with no virulence plasmids was characterized by milder gastroenteritic clinical course, decreased dehydration rate and infectious toxic shock syndrome, as well as by many cases of the bacteria carrying.

Features of Infection Brought on Salmonella Enteritidis with No Virulence Plasmids

А.В. Раков, Ф.Н. Шубин, Н.А. Кузнецова

ОСОБЕННОСТИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ SALMONELLA ENTERITIDIS, НЕ СОДЕРЖАЩЕЙ ПЛАЗМИДЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, г. Владивосток

Ключевые слова: сальмонеллы, сальмонеллез, плазмиды, молекулярная эпидемиология.

В настоящее время проблема сальмонеллеза продолжает оставаться актуальной. В России и Приморском крае наибольшее этиологическое значение получил серовар Salmonella enteritidis [2]. Некоторые серовары сальмонелл, большинство из которых адаптированы к животным, имеют плазмиды вирулентности, которые позволяют им вызывать системные инфекции у мышей. J. Fierer et al. [11] предположили, что плазмиды вирулентности способствуют возникновению сальмонеллезной бактериемии у человека. Данное положение нашло дальнейшее развитие в исследованиях C.-H. Chiu et al. [8], которые показали, что плазмиды вирулентности могут играть роль в возникновении первичной бактериемии.

Вместе с тем в настоящее время сложилось весьма устойчивое мнение, что для развития гастроинтестинальной формы сальмонеллезной инфекции присутствие в штаммах возбудителя плазмиды вирулентности необязательно [9, 12]. Так, G. Kapperud et al. [14] сообщали о вспышке пищевого сальмонеллеза, вызванной S. typhimurium, не содержащей плазмиды вирулентности [14]. Однако недостаточность клинико-эпидемиологических данных в этих работах не позволяет связать проявления инфекции с фенотипическими и плазмидными характеристиками возбудителя и сделать однозначный вывод о их значимости в клинике сальмонеллеза у человека.

Плазмидная характеристика S. enteritidis в Приморском крае рассмотрена нами на основе многолетнего наблюдения за популяцией микроба [5]. При этом типирование штаммов выявило значительную гетерогенность популяции S. enteritidis по профилю плазмид. Штаммы, изолированные в Приморском крае из различных источников в 1995—2000 гг., распределились на 59 плазмидоваров, среди которых доминирующее значение имели три, маркированные плазмидами 38 MDa, 38:1,4 MDa и 38:2,3 MDa. На их долю пришлось 83,1% всех изолированных культур. С 2000 г. к числу доминирующих был отнесен и плазмидовар 38:4,2 MDa, занявший 4-е место в этиологии сальмонеллеза у человека [6]. Многолетнее наблюдение за реализацией в эпидемическом и инфекционном процессах гетерогенной по плазмидным характеристикам популяции

S. enteritidis показало, что различным плазмидоварам микроба свойственна характерная для каждого из них динамика заболеваемости и клинические особеннос-

ти [2]. При этом, как показали специально проведенные исследования, плазмида с молекулярной массой 38 MDa является плазмидой вирулентности, и она отсутствует у 3,8% штаммов [3].

Представленные обстоятельства явились основанием для изучения микробиологической характеристики штаммов S. enteritidis, не содержащих плазмиду вирулентности с типичной молекулярной массой 38 MDa, а также эпидемиологических особенностей и клинических проявлений вызванной ими инфекции.

Исследованы штаммы сальмонелл, не содержащие плазмиду вирулентности массой 38 MDa, выделенные в различных районах Приморского края от 160 больных и из 11 проб пищевых продуктов. Идентификацию микроорганизмов осуществляли стандартными методами. Изучение биохимической активности проводили по общепринятой методике с помощью биохимических пластин, дифференцирующих энтеробактерии (ПБДЭ, г. Нижний Новгород). Оценивали ферментацию глюкозы, лактозы, маннита, рамнозы, дульцита, ксилозы, адонита, целлобиозы, сорбита, инозита, ме-лицитозы, эскулина, раффинозы, гидролиз желатины и мочевины, рост на цитратной и ацетатной средах, наличие Р-галактозидазной активности, расщепление лизина и аргинина, продукцию индола, сероводорода, отношение к глицерину по Штерну и подвижность, что позволило составить код биохимической активности штаммов. Чувствительность к 30 антибиотикам (пенициллинам, цефалоспоринам, аминогликозидам, тетрациклинам, полимиксинам и фторхинолонам) у 108 штаммов оценивали методом диффузии в агаре с помощью бумажных дисков. Поиск плазмид проводили по известному методу [13]. Молекулярную массу определяли по подвижности плазмид в агарозном геле в сравнении с плазмидами pCT105 (7,5 MDa), pCT110 (6,5 MDa), R446b (47 MDa), S-a (26 MDa), pBR322 (2,8 MDa) и плазмидами pVM82 (82 MDa), p4,4 (4,34 MDa) штаммов Yersinia pseudotuberculosis [4]. Наличие плазмиды вирулентности определялось с помощью полимеразно-цепной реакции на ген spvC. Использована пара праймеров SpvC-1 и SpvC-2, предложенная C.-H. Chiu et al. [7], которая гибридизовалась с фрагментом гена spvC, локализованном на плазмиде вирулентности (ампликон массой 571 п.о.). В полимеразно-цепной реакции было исследовано 36 штаммов микроба. Данные о клинико-эпидемиологических проявлениях инфекции взяты из 160 историй болезни. Результаты обработаны статистически с использованием критериев Стьюдента [1].

Небольшой объем исследованного материала обусловлен тем, что штаммы S. enteritidis, не содержащие плазмиды вирулентности, составили в 1995—2005 гг. всего 3,3% от исследованных. Все штаммы по числу содержащихся в них плазмид можно разбить на три группы: штаммы, не содержащие плазмид, штаммы, содержащие одну плазмиду, и штаммы, содержащие две плазмиды и более. К первой группе относилось всего 65 штаммов (38%), ко второй — 75 (43,9%)

Тихоокеанский медицинский журнал, 2007, № 4

Частота утраты плазмиды вирулентности массой 38 MDa у штаммов S. enteritidis, выделенных от больных людей

Производный плазмидовар, MDa Кол-во штаммов Исходный плазмидовар, MDa Кол-во штаммов

абс. с утратой плазмиды вирулентности, %

Без плазмид 60 38 1089 5,22

1,4 23 38:1,4 1510 1,52

2,3 15 38:2,3 541 2,72

4,2 9 38:4,2 428 2,12

26:1,4 3 38:26:1,4 207 1,42

3,2:2,9:1,4 1 38:3,2:2,9:1,4 155 0,62

2,6:1,4 1 38:2,6:1,4 59 1,72

3,0:1,4 1 38:3,0:1,4! 32 —

2,3:1,4 2 38:2,3:1,4х 12 —

60:4,2 1 60:38:4,2! 4 —

Всего: 126 Всего: 4059 3,0

1 В связи с ограниченным количеством штаммов данных плаз-мидоваров процентное соотношение не вычислялось.

2 Различия между данным плазмидоваром и штаммами, не содержащими плазмид, статистически достоверны.

и к третьей — 31 (18,1%). Кроме того, штаммы & enteritidis можно дифференцировать на низкомолекулярные — содержащие плазмиды молекулярной массы ниже, чем плазмида вирулентности 38 MDa, и высокомолекулярные — содержащие плазмиды массой выше 38 MDa.

Анализ спектра & enteritidis, не содержащих плазмиды вирулентности, показал, что среди них ведущее положение занимают штаммы, не содержащие плазмид, а также плазмидоваров 1,4 MDa, 2,3 MDa и 4,2 MDa. На их долю пришлось 66,9% исследованных культур (107 штаммов). Вместе с тем данные штаммы отличаются от штаммов доминирующих плазмидоваров лишь отсутствием плазмиды вирулентности. Следовательно, можно полагать, что формирование подобных штаммов объясняется утратой соответствующей плазмиды у микроорганизмов, ранее ее содержавших. Средняя частота утраты плазмиды вирулентности составила 3%, однако у различных плазмидоваров микроба она варьировала. Наиболее часто утрата плазмиды вирулентности имеет место у штаммов плазмидовара 38 MDa, что привело к образованию 5,2% бесплазмидных штаммов. Этот процесс проходил достоверно реже у плазмидоваров 38:1,4 MDa, 38:2,3 MDa, 38:4,2 MDa, 38:26:1,4 MDa, 38:3,2:2,9:1,4 MDa и 38:2,6:1,4 MDa. Частота образования штаммов, утративших плазмиду вирулентности, у этих плазмидоваров не превышала 2,7% (табл. 1).

Для доказательства отсутствия в штаммах микроба плазмидных генов вирулентности было проведено изучение присутствия в них spvC-гена с помощью полимеразной цепной реакции, где праймеры были подобраны к фрагменту ^^гена. Электрофорез проводили в 2% агарозном геле. Все 36 исследуемых штаммов не содержали spvC-ген, что указывало на

отсутствие у них плазмиды вирулентности (табл. 2). Контрольная группа из 10 штаммов, содержащих плазмиду 38 MDa, содержала и spvC-ген.

Изучение фенотипических свойств штаммов, не содержащих плазмиду вирулентности, показало, что все они, независимо от плазмидного состава, времени и места выделения были однотипными по биохимической активности, то есть ферментировали глюкозу, маннит, арабинозу, мальтозу, дульцит, инозит, сорбит, лизин, аргинин, орнитин, утилизировали цитрат натрия, образовывали сероводород. Они не ферментировали салицин, сахарозу, инозит, лактозу, не утилизировали малонат натрия, не ферментировали фенилаланин, не образовывали ацетилметилкар-бинола и индола. Уреазный тест и тест на в-галакто-зидазную активность были отрицательны. Штаммы & enteritidis были подвижны при температуре 37°С. Анализ антигенной характеристики показал, что все они, независимо от состава плазмид, имели однотипную антигенную формулу — 1,4,12^т. Исследование антибиотикоустойчивости данных штаммов не выявило никаких отличий от штаммов, содержащих плазмиду вирулентности. Все они были чувствительны ко всем тестируемым антибиотикам.

Таким образом, ген spvC не выявлен ни в одном из штаммов, содержащих низкомолекулярные и высокомолекулярные плазмиды. Соответственно, представленные плазмиды не являлись плазмидами вирулентности и, следовательно, штаммы, не содержавшие плазмиды массой 38 MDa, являлись одновременно штаммами, не содержавшими плазмиды вирулентности. Присутствие низкомолекулярных и высокомолекулярных плазмид не отражалось на биохимических свойствах, антигенной структуре и антибиотикорезистентности микроорганизма. Следовательно, штаммы, не содержащие плазмиду вирулентности массой 38 MDa, по фенотипическим характеристикам однотипны со штаммами & enteritidis, содержащими эту плазмиду.

Клинические проявления инфекции у 41 пациента, выделившего & enteritidis без плазмиды вирулентности (1-я группа), сравнивалось с таковыми у 131 пациента, выделившего возбудителя с плазмидой 38 MDa (2-я группа). По возрастной структуре в обеих группах преобладали лица работоспособного возраста (от 20 до 59 лет) — 56,1±7,7% в 1-й и 67,2±4,2% во 2-й. Статистически значимых половых различий между группами не зарегистрировано. У всех пациентов отсутствовали хронические заболевания желудочно-кишечного тракта, а сальмонеллез протекал в виде гастроинтестинальной формы. Больные поступали на 1-2-е сутки от начала заболевания, клиника начиналась с болей в животе, повышения температуры до 38—40°С, общего недомогания, слабости и головной боли.

Были выявлены различия в степени дегидратации и частоте инфекционно-токсического шока. У большинства больных 1-й группы (90,2%) дегидратация

Биохимическая активность, антигенная структура и наличие spvC-гена у штаммов S. enteritidis, не содержащих плазмиды

Плазмидовар, MDa Кол-во штаммов Годы выделения Код биохимической активности Антигенная структура Наличие spvC-гена

Без плазмид 2 1998, 2001 5703117 1,4,12;gm —

1,4 13 1995-2000 5703117 1,4,12;gm —

2,3 9 1995-2000 5703117 1,4,12;gm —

4,2 2 1995, 1999 5703117 1,4,12;gm —

2,3:1,4 2 1995, 1999 5703117 1,4,12;gm —

2,6:1,8 1 2000 5703117 1,4,12;gm —

2,3:2,2 1 2001 5703117 1,4,12;gm —

3,5:2,7 1 1997 5703117 1,4,12;gm —

50 3 1995, 1999, 2000 5703117 1,4,12;gm —

26:1,4 1 2001 5703117 1,4,12;gm —

52:35 1 1998 5703117 1,4,12;gm —

отсутствовала или достигала I степени. Напротив, во 2-й группе такая дегидратация была зарегистрирована лишь у 71% больных, тогда как у 29% пациентов ее выраженность достигала П—Ш степени. Кроме того, выявлены существенные различия и при исследовании кала. Так, у больных 2-й группы слизь и кровь определялись значительно чаще, что указывало на более тяжелые гастроэнтероколитические проявления инфекции. Бактерионосители в первой группе составили 12,2±5,1%, тогда как во второй только 4,6± 1,8%.

Следовательно, сальмонеллезная инфекция, вызванная штаммами & enteritidis, не содержащими плазмиды вирулентности, характеризуется более легким гастроэнтеритическим вариантом течения, что проявляется значительным снижением в клинике степени дегидратации и частоты инфекционно-токсического шока, а также высокой частотой бактерионосительства.

Отсутствие связи между наличием в штаммах сальмонелл плазмиды вирулентности и способностью бактерий вызывать гастроэнтеритический синдром характерно и для других сероваров сальмонелл. Описано множество вспышек сальмонеллеза, вызванных различными сероварами сальмонелл, у которых не обнаружены плазмиды вирулентности. Так, J.-Y D’Aoust [10] описал подобные вспышки, вызванные в различных странах сероварами & ЬатИу, 8. miami, 8. oranienburg, 8. chester, S. javiana, 8. роопа, 8. saint-paul, 8. goldcoast, 8. heidelberg, 8. eastbone,

8. троН и 8. nma. Все это доказывает возможность того, что плазмида вирулентности не является обязательным условием для возникновения сальмонеллез-ной инфекции у человека.

1. Каспарова Т.Ю. Статистические методы в эпидемиологическом анализе. — М.: Медикас, 1994.

2. Раков А.В., Шубин Ф.Н., Иванис В.А. и др. //Эпиде-миол. и инфек. болезни. — 2001. — № 5. — С. 50—54.

3. Раков А.В. Микробиолого-клинические параллели при сальмонеллезной инфекции : автореферат дис. . канд. мед. наук. — Владивосток, 2003.

4. Шубин Ф.Н., Гинцбург А.Л., Китаев В.М. и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1989. - № 6. - С. 20-25.

5. Шубин Ф.Н., Ковальчук Н.И., Кузнецова Н.А. и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2002. -№ 1. - С. 36-40.

6. Шубин Ф.Н., Раков А.В., Кузнецова Н.А. и др. // Актуальные проблемы здоровья населения Сибири. -Омск, 2004. - С. 193-199.

7. Chiu C.-H, Ou J.T. // J. Clin. Microbiol. - 1996. -Vol. 34. - P. 2619-2622.

8. Chiu C.-H., Lin T.Y., Ou J.T.//Microbiol. Immunol. -1999. - Vol. 43. - P. 899-903.

9. Chiu C.-H., Ou J.T. // Clin. Infect. Dis. - 2001. -Vol. 32. - P. 520.

10. D’Aoust J.-Y. // Int. J. Food Microbiol. - 1994. -Vol. 24. - P. 11-31.

11. Fierer J., Krause M, Tauxe R., Guiney D. // J. Infect. Dis. - 1992. - Vol. 166. - P. 639- 642.

12. Fierer J. // Clin. Infect. Dis. - 2001. - Vol. 32. - P. 519-520.

13. KadoC.I., Liu S.T.//J. Bacterial. - 1981. - Vol. 145. -P. 1365-1373.

14. Kapperud G., Gustavsen S., Hellesnes I. et al. // J. Clin. Microbiol. - 1990. - Vol. 28. - P. 2597-2601.

Поступила в редакцию 19.06.2006.

FEATURES OF INFECTION BROUGHT

ON SALMONELLA ENTERITIDIS WITH NO

A.V. Rakov, F.N. Shubin, N.A. Kuznetsova

SBRAMS Research Institute of Microbiology and Epidemiology

Summary — During the period from 1995 till 2005 Salmonella enteritidis strains with no virulence plasmids reached 3.3% (171 strains) of all the strains under study. As the tests conducted with polymerase chain reaction showed, S. enteritidis strains which did not contain plasmids of 38 MDA in weight, had been at the same time those that did not contain virulence plasmids. The plasmids of other molecular weight did not have an effect on phenotypic properties of a microorganism. The Salmonella infection provoked by S. enteritidis with no virulence plasmids was characterized by milder gastroenteritic clinical course, decreased dehydration rate and infectious toxic shock syndrome, as well as by many cases of the bacteria carrying.

Pacific Medical Journal, 2007, No. 4, p. 21-23.

Abstract

The spv operon is common to all Salmonella virulence plasmids. DNA hybridization analysis indicates that the spv region is limited in distribution to serovars of Salmonella enterica subspecies I, II, IIIa, IV, and VII and is absent from Salmonella bongori isolates. Among strains of subspecies II, IIIa, and VII, all isolates examined contained sequences that hybridized with the spv region. However, among isolates of subspecies I, DNA sequences capable of hybridizing with the spv region were found in some isolates of certain serovars. Furthermore, in isolates of subspecies I, the virulence plasmid was found in the same set of isolates as an F-related plasmid, as determined by the presence of the spv region of the virulence plasmid and the finO, traD, and repA sequences of the F-plasmid. The concordance of the virulence plasmid and all three F-plasmid sequences in subspecies I serovar Choleraesuis, Paratyphi, and Typhimurium is most easily explained if the spv region is carried in an F-related plasmid in these isolates. In contrast, among S. enterica subspecies II, IIIa, IV, and VII, the isolates that contain spv sequences did not hybridize with an F-related plasmid or any other identifiable plasmid. With the use of pulse-field gel electrophoresis, the spv region in subspecies II, IIIa, and VII was found to be encoded on the chromosome. Analysis of the phylogenetic distribution of spv among Salmonella isolates and comparative nucleotide sequence analysis of spvA and spvC suggests that the spv region was acquired very recently, after speciation of the salmonellae.

SALMONELLA has been implicated in a wide variety of infections ranging from life-threatening typhoid to gastroenteritis and bacteremia. Salmonella is a facultative intracellular pathogen, typically colonizing reptiles, birds, and mammals, with some serovars showing remarkable host-adaptation; for example, serovars Typhi, Dublin, and Gallinarum infect humans, cattle, and birds, respectively, although by no means are these serovars restricted to these hosts (F alkow 1996). In view of the diversity of animal species infected and the complex mechanisms of infection, it is not surprising that the array of genes required for virulence depends on the particular host and the mode of infection.

In regard to Salmonella enterica subspecies I, the virulence properties of various serovars, Typhimurium, Choleraesuis, Dublin, and Enteriditis, depend on the presence of large plasmids 65–100 kb in size to cause systemic infection (J ones et al. 1982; T erakado et al. 1983; N akamura et al. 1985; G ulig and C urtiss 1987). Analysis has shown that the virulence plasmids from different serovars share a related 7.8-kb virulence region, the spv gene cluster, which includes five open reading frames designated spvR, spvA, spvB, spvC, and spvD (B aird et al. 1985; W illiamson et al. 1988; N orel et al. 1989; T aira and R hen 1989; K rause et al. 1991; G ulig et al. 1993). The spvR gene encodes a regulatory protein of the LysR family that, together with the chromosomally encoded regulatory gene rpoS, regulates the spvABCD genes (T aira et al. 1991; F ang et al. 1992; N orel et al. 1992; G ulig et al. 1993). The function of the spvABCD gene products remains undetermined, but it has been shown that the presence of the virulence plasmid increases the growth rate of Salmonella in mice (G ulig and D oyle 1993).

The spv region of the Salmonella virulence plasmid represents only a small proportion of the plasmid-coding capability, and little is known about the coding capacity of the rest of the virulence plasmid. Tinge and Curtiss (1990) demonstrated that the virulence plasmid of serovar Typhimurium contained three replication (rep) regions repA (par), repB, and repC. The repB and repC regions hybridize weakly with IncFI plasmid F and IncFII plasmid R100, respectively; however, neither repB or repC conferred incompatibility with F or R100. The rck and traT genes also present in the serovar Typhimurium virulence plasmid encode outer membrane proteins whose expression confers survival in macrophages (H effernan et al. 1992; R hen et al. 1992). Recently, it has also been demonstrated that the virulence plasmid of Typhimurium encodes a fimbrial biosynthesis operon, pef (F riedrich et al. 1993). Examination of the virulence plasmid of Salmonella serovars Gallinarum, Enteritidis, and Typhimurium demonstrated the presence of F-like OriT, but this region was not found in the virulence plasmid of serovars Choleraesuis and Dublin (O u et al. 1994). Further, DNA hybridization ofthe nonvirulence coding part of the virulence plasmid of serovar Dublin with Escherichia coli and Salmonella spv-negative plasmids indicates a common origin of this region of the plasmid (A abo et al. 1995). Similarly, the large virulence plasmid of Shigella flexneri showed homology with part of the transfer region of F and with vagC and vagD of the Salmonella serovar Dublin virulence plasmid (R adnedge et al. 1997). Rodriguez-Pena and colleagues (1997) have recently shown the virulence plasmid from serovar Enteriditis could have arisen from the Typhimurium plasmid through deletions, and both plasmids share homology in the tra region from IncFII plasmids.

The genus Salmonella proper is divided into two species: S. bongori (formerly S. enterica subspecies V; R eeves et al. 1989) and S. enterica. The species S. enterica is further subdivided into seven subspecies, designated by the roman numerals I, II, IIIa, IIIb, IV, VI, and VII (L e M inor and P opoff 1987; S elander et al. 1994; B oyd et al. 1996). The majority of Salmonella human pathogens belong to subspecies I isolates, whereas subspecies IIIa, IIIb, II, IV, and VII and S. bongori are mainly associated with cold blooded vertebrates (P opoff and L e M inor 1992).

The true prevalence of the virulence plasmid among natural isolates of Salmonella is unknown. Previous studies have shown the occurrence of the virulence plasmid among a few serovars of S. enterica subspecies I, to which 99% of the medically important serovars belong (W illiamson et al. 1988; B äumler et al. 1997). Herein, we find that among the salmonellae, the spv region is found in all isolates of S. enterica subspecies II, IIIa, and VII isolates. Of the 72 subspecies I isolates examined of the Salmonella reference collection B (SARB), 15 strains showed homology with the spv probe, and further analysis showed these 15 isolates also hybridized with the F plasmid probes, finO, traD, and repA. Analysis of nucleotide and amino acid substitutions of the spvA gene suggests there has been rapid divergence, possibly related to niche specialization, among the subspecies. From the standpoint of population genetics, the most important result is that the presence of the Salmonella virulence plasmid is highly correlated with the presence of an F-related plasmid. Further, the finding of the presence of the spv region on the chromosome of subspecies II, IIIa, IV, and VII isolates is also significant. From the microbial pathogenesis perspective, the probability that the spv region is part of an F-related plasmid in isolates of subspecies I is significant in relation to the potential for frequent horizontal transmission among strains and species.

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains: We examined 72 isolates of the SARB collection, which includes 37 medically important serovars of subspecies I of S. enterica whose phylogenetic relationships are known (B oyd et al. 1993). In addition, we examined 80 natural isolates of the Salmonella reference collection C (SARC; B oyd et al. 1996), which represents most of the genetic diversity within the genus. SARC is composed of S. bongori (11 isolates) and all 7 subspecies of S. enterica: I (11 isolates), II (14 isolates), IIIa (4 isolates), IIIb (4 isolates), IV (9 isolates), VI (20 isolates), VII (4 isolates). Total genomic DNA was extracted with the G-Nome DNA isolation kit (Bio 101, La Jolla, CA).

PCR amplification: Primers for PCR and DNA sequencing were designed from published sequence of the spv virulence region (K rause et al. 1990). PCR products were purified using the Qiaquick PCR purification kit (Quigen Inc., La Jolla, CA).

DNA hybridization: Plasmid DNA was isolated from Salmonella strains. All isolates were examined by restriction digests with EcoRI and electrophoresed in 0.6% agarose gels and transferred to Hybond N + membranes. DNA fragments for use as fluoresin probes in Southern hybridizations were prepared from S. enterica serovar Typhimurium LT2. Three DNA probes were constructed, which encompassed the entire spv region. The spv fragments were amplified by long-range PCR and labeled to high-specify activity by the random-labeling method [enhanced chemilumence (ECL); Amersham, Arlington Heights, IL]. The F-plasmid probes were prepared as previously described (B oyd and H artl 1997). Prehybridizations were performed in 10× SSC, 0.2% SDS, 10% dextran sulfate, and 5% ECL liquid block for 1 hr. Hybridization of probes was carried out overnight at 60° (55° for reduced stringency). Membrane washes were at 60° (55° for reduced stringency) in 1× SCC and 0.1% SDS. Hybridized fragments were detected with the ECL system.

Association of genes with plasmids: To determine whether the genes examined were plasmid encoded, total genomic DNA was separated on 0.6% agarose for an extended time to permit separation of plasmid DNA from the bacterial chromosomal band. DNA was transferred to Hybond N + membranes and DNA was cross-linked by ultraviolet exposure. Membranes were hybridized with plasmid probes overnight under both high (60°) and low (55°) stringency conditions.

Pulsed field gel electrophoresis (PFGE): To determine whether the spv region in isolates outside of subspecies I are encoded on the chromosome, PFGE was carried out. Agarose plugs were prepared as previously described (B ergthorsson and O chman 1995). Agarose plugs were washed five times for 5 min each in 50 vol distilled H₂O and equilibrated in the appropriate restriction buffer. Agarose plugs were digested with I-CeuI (NEB) as described by B ergthorsson and O chman (1998). The restriction enzyme I-CeuI cuts at rDNA operons only. Electrophoresis was performed with a CHEF-DR II apparatus (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Electrophoresis was carried out as previously described (B ergthorsson and O chman 1998). DNA was transferred to a nylon membrane, and an spv DNA probe was used to detect homology.

Nucleotide sequencing: Two genes from the spvABCD operon were sequenced from representative isolates of Salmonella. DNA sequencing of PCR-amplified DNA was performed with a 370A DNA sequencer following manufacturers' instructions. Both dyeterminator and dyeprimer chemistries were used. All sequences have been deposited in GenBank accession numbers AF051816-AF051829.

Phylogenetic and statistical analysis: DNA sequence data were assembled and edited with sequencer programs (1991). Phylogenetic analysis was performed with the programs Molecular Evolutionary Genetic Analysis, version 1.0 (K umar et al. 1993) and Molecular Evolutionary Analysis (E tsuko M oriyama , Yale University).

Genotypic characterization of spv-positive SARB strains and their hybridization with F-plasmid sequences

Roles Data curation, Formal analysis, Investigation, Methodology, Writing – original draft

Affiliation Division of Bacteriology, Indian Council of Medical Research-National Institute of Cholera and Enteric Diseases, Kolkata, West Bengal, India

Roles Data curation

Affiliation Department of Microbiology, All India Institute of Hygiene and Public Health, Kolkata, West Bengal, India