Организация вирусологических исследований на полиомиелит
Вирусологическая диагностика
Методы вирусологической (в том числе и серологической) диагностики полиомиелита применяются в зависимости от задач, которые возникают в каждом отдельном случае. При наличии ясной клинической характеристики в типичных паралитических случаях болезни следует определить иммунологический тип и генетические признаки вирусного штамма, вызвавшего данное заболевание. Но, конечно, в этих случаях клиницист не очень заинтересован в вирусологическом подтверждении диагноза и обычно удовлетворяется результатами обследования на антитела в парных пробах крови. Следует указать на возможность ошибочного клинического диагноза полиомиелита даже в паралитических случаях, т. к. описаны сходные с полиомиелитом заболевания, вызванные вирусами из группы Коксаки и ЕСНО (М.П. Чумаков, М.К. Ворошилова и др., 1959). Поэтому необходимо вирусологическое подтверждение даже в ясных для клинициста случаях.
В непаралитических и абортивных случаях полиомиелита, когда клиническая и клинико-лабораторная диагностика недостаточно обоснована, выделение из патологических субстратов и определение типа вируса в сочетании с результатами серологического обследования может подтвердить или отвергнуть предполагаемый диагноз полиомиелита, что имеет практическое значение (например, для организации противоэпидемических мероприятий).
Многие агенты могут вызывать синдром асептического менингита, который нельзя без лабораторного исследования отличить от непаралитической формы полиомиелит. Серозный менингит, не отличимый от непаралитической формы полиомиелита, могут вызывать следующие вирусы: возбудители свинки (паротита), лпмфоцитарного хориоменингита, ряд вирусов из групп ЕСНО и Коксаки, герпес простой, герпес зостер, вирусные энцефалиты, кроме того, лептоспиры и др. Чаще всего приходится проводить одновременное обследование материала на присутствие вируса полиомиелита и других энтеровирусов (Коксаки, ЕСНО, РЭО-групп). И, наконец, вирусологические, серологические методы исследования приобретают особое значение для контроля качества профилактических прививок пероральной полиомиелитной живой вакциной, напр. для определения частоты хорошей прививаемости живой вакцины по результатам выделения вакцинных штаммов из кишечного содержимого или из глоточного отделяемого у привитых и контактирующих с ними лиц, а также по динамике нарастания уровней антител в крови у вакцинированных людей. Периодически могут потребоваться выборочные обследования здорового населения на распределение уровней антител к разным типам полиовирусов, а также на частоту спонтанного носительства штаммов вируса полиомиелита и других энтеровирусов.
Материал для обследования. Полиовирус можно выделить заражением обезьяны или восприимчивых тканевых культур, в отдельных случаях также хлопковых крыс и новорожденных белых мышей (для штаммов II и IV типов). Вирусы ЕСНО и нескольких типов Коксаки могут быть выделены заражением культур, а большинство вирусов Коксаки группы А только заражением новорожденных белых мышей. Фекалии больного или здорового человека в очаге инфекции представляют наиболее богатый и регулярный источник для изоляции полиовируса и других энтеровирусов. Полиовирус в фекалиях может обнаруживаться в течение 2—3 недель, иногда 12 недель и больше после начала болезни или скрытой инфекции; максимальное количество полиовируса в фекалиях — до 10 инфекционных доз в 1 г.Выделение энтеровирусов возможно также из сточных вод канализации, из мух и других объектов внешней среды, которые могут быть загрязнены фекалиями. Полиовирус можно выделить также из носоглоточных смывов и тампонов из зева вскоре после начала заболевания или при скрытой инфекции (примерно в течение первой недели).
Исследование крови на присутствие вируса полиомиелита (например, вакцинного штамма) чрезвычайно трудоемкое, сложное и возможно только при решении экспериментальных задач в особых условиях. Исследование спинномозговой жидкости при полиомиелите нецелесообразно.
В секционных случаях следует получить асептично пробы из спинного (шейного и поясничного отделов) и продолговатого мозга по 2 см 3 (способ сохранения при 1° 4° в 50% растворе нейтрального глицерина или в замороженном состоянии без глицерина); кроме того, следует в этих случаях обследовать на вирус содержимое кишечника (5—15 г)пли отмытую ткань кишечной стенки на разных уровнях. Все пробы должны пересылаться в лаборатории и сохраняться на холоду (при 1° от -(-4 0 до +8°) или в замороженном виде (от —20° до -70°).
Подготовка обследуемых материалов для заражения культур или животных предусматривает обязательное удаление бактериальных контаминантов путем обработки проб антибиотиками (смесью пенициллина от 500 до 10 000 ЕД в 1 мл,стрептомицина — 500—2000 [в 1 мли, возможно, других антибиотиков). Раньше для этих целей применялась обработка проб эфиром, но она уступает антибиотикам по эффективности. До обследования экстракты фекалий с антибиотиками (20 или 10% взвеси) следует освободить от грубых частиц путем центрифугирования.
Методика исследования. При первичном выделении вирусов из группы Коксаки заражаются в мозг и подкожно новорожденные белые мыши в возрасте не старше 24 час. Молодые белые мыши и хлопковые крысы могут быть заражены материалом, содержащим полиовирус II типа, в головной мозг или в спинной мозг и в брюшную полость, или внутримышечно. Для перевивки вируса от заболевших к свежим животным используется взвесь спинного и головного мозга.
Обезьяны макаки (любой вид), мартышки и др. могут быть заражены материалом, содержащим вирус полиомиелита, разными путями: в головной или в спинной мозг (по 1,0 или 0,2 млсоответственно), через нос под легким наркозом (можно 3—5 дней подряд), в брюшную полость и внутримышечно. В пассажах на обезьянах используется ткань спинного и продолговатого мозга заболевших животных.
Наиболее употребительны в наст, время культуральные пробирочные методы вирусологической и серологической диагностики как самые дешевые и доступные для обследования большого числа проб. Благодаря целой серии исследований Эндерса, Солка, Янгнера, Мельника, Дульбекко и многих других в 1949—1955 гг. были разработаны эффективные методики выделения, размножения и идентификации энтеровирусов в культурах клеток.
Выделение и размножение вируса полиомиелита для лабораторных целей возможно в первичных культурах нормальных тканей от человека (хирургические отходы и эмбрионы) или разных видов обезьян. Для этого чаще всего использовались фибробласты кожно-мышечной ткани, клетки почек, семенника, амниона и др. Кроме того, могут с успехом использоваться вторичные культуры или лабораторные линии непрерывно растущих клеток ракового происхождения (часто применялись лабораторные линии клеток человеческого рака: Не1а, НЕР-2, КВ, НЬ8, Детройт-6 и др.), а также непрерывные линии клеток, происходящих от нормальных тканей (напр., клетки амниона человека и клетки СОЦ— из сердца обезьяны циномольгус). Кроме того, оказалось, что в ряде случаев непрерывные лабораторные линии клеток, происходящие от животных (кроликов, свиней), не восприимчивых к полиомиелиту, могут становиться полностью восприимчивыми к заражению полиовирусом в результате происходящей трансформации (возможно ма-лигнизации ткани) в процессе длительных пассажей непрерывно растущих клеток.
Культуры клеток в подходящей жидкой среде для размножения полиовируса могут изготовляться асептично разными методами (взвесь фрагментов ткани, однослойная клеточная мембрана на стекле; фиксирование фрагментов в куриной плазме; покрытие агаром клеточного слоя на стекле и т. п.) в герметически закрытых стерильных сосудах. Добавление небольшого количества антибиотиков (100—200 ЕД пенициллина, 50 цг стрептомицина на 1 млсреды) надежно предохраняет большинство асептично приготовленных культур клеток от случайного прорастания ми-кробами-контаминантами из воздуха.
О присутствии активного полиовируса в растущей культуре клеток можно судить по наступающей дегенерации клеток в результате цитопатогенного действия вируса. При этом необходимо сравнение с контрольными незараженными клетками и последующая проверка специфичности цитопатогенного эффекта в опыте нейтрализации типовой иммунной сывороткой.
Кроме того, цитопатогенное действие полиовируса во взвеси клеток можно зарегистрировать с помощью наблюдений за изменениями цвета фенолрот или другого индикатора рН среды, а именно клетки во взвеси, не содержащей полиовируса, постепенно в течение нескольких дней сдвигают рН среды в кислую сторону и цвет фенолрот меняется из красного в желтый; в то же время в пробирках с активным вирусом полиомиелита клетки быстро дегенерируют, метаболизм прекращается, кислотность среды не изменяется, и исходный красный цвет среды (с индикатором фенолрот около 0,004%) сохраняется до конца наблюдения. На этой основе разработана методика так наз. цветной пробы (или рН-тест) для выделения и титрования вируса полиомиелита, а также для определения титра антител в сыворотке. В цветной пробе могут ставиться и опыты нейтрализации с целью определения иммунологического типа обследуемого вируса.
Вирус полиомиелита можно обнаруживать и по образованию изолированных колоний, или бляшек, в культурах однослойных клеток, покрытых слоем питательного агара. Бляшкообразование в агаровых культурах растущих клеток с индикатором нейтральрот используется для точного определения титра полиовируса в материале или для дифференциации выделенных штаммов по чувствительности к снижению концентрации бикарбонатов и катионов.
Ход исследования материала в пробирочных культурах ткани на вирус полиомиелита включает следующие методики: предварительное выращивание в течение нескольких дней незараженных клеточных культур, внесение в хорошо развившиеся культуры исследуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками и др., инкубирование зараженных культур при 1° 37° и наблюдение за состоянием клеток культуры примерно в течение 10 дней. Некоторые пробы фекалий токсичны для культур, что обычно выявляется через 24 часа, и в этих случаях следует перевить материал культуры на 5-й день. Специфическое действие вируса на клетки обычно выявляется на 3—5-й день, иногда на 6—8-й день после заражения; при отсутствии дегенерации в культурах первого заражения можно попытаться продолжить наблюдение за культурами после замены среды свежей питательной жидкостью. При обнаружении дегенерации клеток зараженных культур проводится перевивка жидкости из таких культур на свежие культуры и определение в серии культур титра выделенного цитопатогенного вируса, а затем опыт нейтрализации с включением специфических иммунных сывороток. Выделение и типирование вируса можно проводить одновременно, добавляя в питательную среду культур разные виды типоспецифических иммунных сывороток; при этом вирус будет подавляться в культурах с гомотиповои иммунной сывороткой и проявлять свое действие в культурах с гетеротиповыми иммунными сыворотками или без сыворотки.
VII. Организация лабораторных исследований биологического
материала от больных полиомиелитом, больных с подозрением
7.1. От больного полиомиелитом, с подозрением на это заболевание и ОВП берут две пробы фекалий в максимально ранние сроки от момента возникновения пареза/паралича (но не позднее 14-го дня). Забор материала осуществляется медицинскими работниками лечебно-профилактической организации, в которую госпитализирован больной. Первая проба фекалий берется в стационаре в день установления клинического диагноза, вторая - через 24 - 48 часов после взятия первой пробы. Оптимальный размер фекальной пробы 8 - 10 г, что соответствует величине двух ногтей большого пальца взрослого человека.
7.2. Отобранные пробы помещают в специальные пластиковые емкости с завинчивающимися пробками для забора фекальных проб и доставляют в Региональный центр по эпидемиологическому надзору за полиомиелитом и ОВП (далее - РЦ за ПОЛИО/ОВП) или в Национальную лабораторию по диагностике полиомиелита (далее - НЛДП) в зависимости от диагноза и классификации случая ОВП.
7.3. Доставка отобранных проб в РЦ за ПОЛИО/ОВП или в НЛДП должна быть осуществлена в течение 72 часов с момента взятия второй пробы. Хранение проб до отправки и при транспортировке осуществляется при температуре от 2 до 8 градусов C. В отдельных случаях, если доставка проб в вирусологическую лабораторию РЦ за ПОЛИО/ОВП или в НЛДП будет осуществлена в более поздние сроки, то пробы замораживают при температуре минус 20 градусов C и доставляют в замороженном виде.
7.4. Пробы доставляются с направлением на лабораторное исследование, которое составляется в 2 экземплярах в соответствии с формой, представленной в приложении 5 к настоящим санитарным правилам.
7.5. Территориальный орган, осуществляющий санитарно-эпидемиологический надзор, ответственный за отправку материала, заранее сообщает в РЦ за ПОЛИО/ОВП или в НЛДП о маршруте его отправления.
7.6. В НЛДП направляются для исследований биологические материалы из всех субъектов Российской Федерации в случаях, определенных пунктами 7.7 - 7.9 настоящих правил.
7.7. Для вирусологических исследований в НЛДП направляются пробы фекалий от:
- больных полиомиелитом (в том числе ВАПП), с подозрением на эти заболевания;
- больных с приоритетными ("горячими") случаями ОВП;
- контактных в эпидемическом очаге с больным полиомиелитом (в том числе ВАПП), с подозрением на эти заболевания, с приоритетным ("горячим") случаем ОВП.
7.8. Для идентификация вирусов в НЛДП направляются:
- изоляты полиовирусов, выделенных в пробах фекалий от больных полиомиелитом (в том числе ВАПП), ОВП, энтеровирусной (неполио) инфекцией, с подозрением на эти заболевания, а также от контактных с ними в эпидемических очагах;
- изоляты прочих (неполио) энтеровирусов, выделенных в пробах фекалий от людей, сточной воды при возникновении эпидемической вспышки энтеровирусных инфекций (5 - 10 изолятов).
7.9. Для серологических исследований в НЛДП направляются парные сыворотки от больных полиомиелитом (в том числе ВАПП) и лиц с подозрением на эти заболевания.
7.10. В РЦ за ПОЛИО/ОВП для исследований направляются биологические материалы из субъектов Российской Федерации, прикрепленных к РЦ за ПОЛИО/ОВП.
7.11. В РЦ за ПОЛИО/ОВП проводят вирусологические исследования проб фекалий от:
- больных ОВП, с подозрением на это заболевание, а также от контактных с ними в эпидемическом очаге;
- детей из семей мигрантов, кочующих групп населения, лиц, прибывших из эндемичных (неблагополучных) по полиомиелиту стран (территорий);
- здоровых детей "групп риска" по эпидемическим показаниям (при отсутствии возможности проведения исследования в территории).
7.12. В РЦ за ПОЛИО/ОВП проводят идентификацию не типируемых штаммов энтеровирусов, выделенных из проб фекалий и сточной воды.
7.13. РЦ за ПОЛИО/ОВП обеспечивает доставку из территорий прикрепленных субъектов Российской Федерации (при отсутствии возможности отправки из субъекта самостоятельно) в Национальный центр по лабораторной диагностике полиомиелита проб фекалий, а также изолятов полиовирусов, прочих (неполио) энтеровирусов для проведения вирусологических исследований и идентификации.
7.14. В ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации проводят вирусологические исследования:
- проб фекалий от больных энтеровирусной (неполио) инфекцией, с подозрением на эти заболевания,
- здоровых детей из групп риска,
- проб сточной воды (в рамках эпидемиологического надзора, по эпидемическим показаниям).
7.15. ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации проводят серологические исследования напряженности иммунитета здоровых лиц из индикаторных групп в рамках серологического мониторинга популяционного иммунитета к полиомиелиту.
7.16. ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации обеспечивает доставку из прикрепленных территорий в РЦ за ПОЛИО/ОВП:
- проб фекалий от больных ОВП или при подозрении на это заболевание, от детей, контактных с ними в эпидемических очагах (при наличии показаний);
- проб фекалий от детей из семей беженцев, вынужденных переселенцев, кочующих групп населения, прибывших из неблагополучных (эндемичных) по полиомиелиту территорий;
- нетипируемых штаммов прочих (неполио) энтеровирусов.
7.17. При отсутствии в ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации собственной лабораторной базы, неудовлетворительных показателях чувствительности эпиднадзора за ПОЛИО/ОВП осуществляется доставка в РЦ за ПОЛИО/ОВП:
- проб фекалий от здоровых детей "групп риска" по эпидемическим показаниям;
- проб сточной воды (по эпидемическим показаниям и в рамках оказания практической помощи);
- сывороток здоровых лиц для проведения серологического мониторинга популяционного иммунитета к полиомиелиту (в рамках оказания практической помощи).
7.18. ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации, выполняющие исследования материалов на полио- и энтеровирусы только ПЦР-методом (при отсутствии условий проведения вирусологических исследований), при выявлении РНК-энтеровируса в пробах направляют исходные пробы в РЦ за ПОЛИО/ОВП для дальнейшей расшифровки.
Государственное автономное образовательное учреждение
среднего профессионального образования Республики Крым
План занятия (практическое) № 57
Тема занятия: Проведение иммунологической диагностики полиомиелита, ЕСНО, Коксаки
Дисциплина (МДК) 04.01 . Теория и практика лабораторных микробиологических и иммунологических исследований
Образовательные:
Изучить патогенез и диагностику полиомиелита, вирусных инфекций, вызванных вирусами ЕСНО, Коксаки
Ознакомиться с техникой постановки иммунологических реакций для диагностики данных заболеваний
Изучить профилактические мероприятия по предупреждению заболеваемости данными инфекциями
Развивающие:
Развивать навыки самообразования, творческие способности студентов
Продолжить развитие учебно-интеллектуальных умений выделять главное и существенное
устанавливать причинно-следственные связи
Воспитательные:
продолжить формирование эволюционных представлений о развитии органического мира, передачи наследственного материала
воспитывать уважение к людям, науки, их достижениям
продолжить формирования умения работать в коллективе, принимать совместные решения
продолжить формирования здорового образа жизни
Междисциплинарные связи:
Физико-химические методы исследования и техника лабораторных работ
Анатомия и физиология человека
Внутридисциплинарные связи:
Место проведения: лаборатория 407
Количество часов: 4 академических
Обеспечение занятия: мультимедийный проектор, презентация, учебная литература, конспект
2. Камышева К.С. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии / Камышева К.С. – Ростов н/Д: Феникс, 2015. – 281 с.
Дополнительные источники:
Медицинская микробиология, вирусология и иммунология : в 2 т. / под ред. В. В. Зверева, М. Н. Бойченко. - Том 1. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010.- 448 с.
Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований: учебник. Сбойчаков В.Б. 2011. - 608 с
Интернет- ресурсы:
Студент должен уметь:
1.проводить взятие биологического материала для вирусологического исследования полиомиелита, ЕСНО, Коксаки
2. Проводить постановку иммунологических реакций для диагностики вирусов
3. Регистрировать результаты проведенных исследований
Студент должен знать:
1. Патогенез и эпидемиологию полиомиелита, заболеваний, вызванных вирусами ЕСНО, Коксаки
2. Принципы классификации и номенклатуры вирусов полиомиелита, ЕСНО, Коксаки
3. Методы иммунологических исследований, дифференциации результатов исследования.
4. Меры профилактики и лечения полиомиелита, заболеваний, вызванных вирусами ЕСНО, Коксаки
Студент должен обладать:
Общие компетенции:
ОК 1. Понимать сущность и социальную значимость своей будущей профессии, проявлять к ней устойчивый интерес.
ОК 2. Организовывать собственную деятельность, выбирать типовые методы и способы выполнения профессиональных задач, оценивать их эффективность и качество.
ОК 3. Принимать решения в стандартных и нестандартных ситуациях и нести за них ответственность.
ОК 4. Осуществлять поиск и использование информации, необходимой для эффективного выполнения возложенных на него профессиональных задач, а также для своего профессионального и личностного развития.
ОК 5. Использовать информационно-коммуникационные технологии в профессиональной деятельности.
ОК 6. Работать в коллективе и команде, эффективно общаться с коллегами, руководством, пациентами.
ОК 7. Брать ответственность за работу членов команды (подчиненных), за результат выполнения заданий.
ОК 8. Самостоятельно определять задачи профессионального и личностного развития, заниматься самообразованием, осознанно планировать и осуществлять повышение своей квалификации.
ОК 9. Ориентироваться в условиях смены технологий в профессиональной деятельности.
Профессиональные компетенции
ПК 4.1. Готовить рабочее место и аппаратуру для проведения лабораторных микробиологических исследований.
ПК 4.2. Проводить лабораторные микробиологические и иммунологические исследования биологических материалов, проб объектов внешней среды и пищевых продуктов; участвовать в контроле качества.
ПК 4.3. Регистрировать результаты проведенных исследований
ПК 4.4. Проводить утилизацию отработанного материала, дезинфекцию и стерилизацию использованной лабораторной посуды, инструментария, средств защиты.
Структура занятия:
Организационный момент 2 мин.
Мотивация (цели) занятия 3 мин.
Оценка знаний студентов (проверка исходного уровня знаний) 45 мин.
Инструктаж самостоятельной работы студентов 15 мин.
Практическая часть 105 мин.
Подведение итогов занятия, оценка работы студентов 8 мин.
Задание на дом 2 мин.
Ход занятия
Организационный момент (Взаимоприветствие, отметка отсутствующих, внешний вид, готовность к практическим занятиям)
Инструктаж по охране труда ( роспись в журнале по технике безопасности )
Мотивация (цели) занятия :
Оценка знаний студентов (проверка исходного уровня знаний) :
а) проверка знаний ( контролирующие материалы с эталонами ответов и критериями оценки прилагаются к плану ).
1. Какие вирусы включены в семейство Picornaviridae?
2. Каковы величина и морфологическая структура вирусов полиомиелита, Коксаки и ECHO?
3. Какие Вы знаете методы культивирования полиовирусов? Чем сопровождается размножение вирусов в культурах клеток?
4. Какие Вы знаете типы полиовирусов? Какой из них имеет наибольшее эпидемиологическое значение?
5. Источники заболевания, ворота инфекции и патогенез при заболевании полиомиелитом.
6. Расскажите о специфической профилактике полиомиелита.
7. Какой материал следует взять для исследования и какие основные методы используются для диагностики при подозрении на полиомиелит?
8. Расскажите о вирусах Коксаки.
9. Расскажите о вирусах ECHO.
б) проверка внеаудиторной самостоятельной работы
Составление глоссария по теме.
в) подведение итогов контроля:
Оценивание, замечания по работе.
Практическая часть:
а) подготовка студентов к самостоятельной работе ( проведение инструктажа по выполнению заданий):
Вирусологическое и серологическое обследование больных полиомиелитом или лиц с подозрением на заболевание, а также - контактных с ними
б) самостоятельная работа студентов:
1. Провести учет реакции нейтрализации
2. изучить иммунобиологические препараты для профилактики полиомиелита
3.Рассмотреть методы культивирования вирусов
в) подведение итогов самостоятельной работы
Оформление в рабочей тетради выводов о проделанной работе
Итоговый контроль
Проверка преподавателем работ студентов
Задание на дом
Подготовить сообщение на тему: Полиомиелит
5.Подведение итогов занятия, оценка работы студентов
Преподаватель оценивает работу студентов, корректирует ошибки, отвечает на вопросы студентов
Преподаватель Гончарова А.И.
Вирусологическое и серологическое обследование больных полиомиелитом или лиц с подозрением на заболевание, а также - контактных с ними
В дополнение к указанным документам рекомендуется проведение исследований в региональном центре эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП материалов из обслуживаемой территории и прикрепленных субъектов Российской Федерации - от прибывших из эндемичных (неблагополучных) по полиомиелиту стран (территорий) и от лиц, общавшихся с ними.
Вирусологическая диагностика
Цель исследования: выявление вируса и определение его типа; серодиагностика.
Материал для исследования
1. Кал больных (взятые на 1-й и 2-й неделе заболевания).
2. Носоглоточное отделяемое (взятое в первые дни заболевания).
3. Кусочки головного и спинного мозга, содержимое тонкого и толстого кишечника, лимфоузлы (секционный материал).
Способы сбора материала
Способы сбора материала
Основные методы исследования
1. Выделение вирусов путем заражения различных культур клеток.
2. Серологическое исследование (реакция нейтрализации) и РСК.
Ход исследования
Выделение вирусов проводят путем заражения исследуемым материалом двух видов культур - первичных и перевиваемых клеток.
Ход исследования
О наличии вируса судят по цитопатическому действию на клетки.
При отсутствии дегенерации клеток в течение 7-10 дней после заражения проводят следующий пассаж. Для второго посева используют культуральную жидкость, взятую из первого пассажа, и заражают новую культуру клеток.
При отсутствии дегенерации клеток во втором пассаже результат считают отрицательным.
При положительном результате проводят типирование выделенного вируса с коммерческими сыворотками против вируса полиомиелита трех типов методом нейтрализации в культуре клеток и РСК.
Серологическая диагностика
Методы ретроспективной диагностики . Для подтверждения диагноза полиомиелита ставят реакцию нейтрализации с парными сыворотками больного. Одну сыворотку берут в начале заболевания, вторую - через месяц после начала заболевания. Обе сыворотки исследуют одновременно в реакции нейтрализации. Для этого сыворотки прогревают в течение 30 мин при 56° С и разводят раствором Хенкса. Разведения делают от 1:4 до 1:1024. Каждое разведение смешивают со стандартной дозой вируса I, II и III типа. После часового контакта (при комнатной температуре) каждой смесью заражают по 2 пробирки со взвесью культуры клеток и помещают в термостат на 4-9 дней. О результатах реакции судят по изменению цвета среды (от малинового до желтого). Изменение цвета свидетельствует о наличии антител. Изменение цвета происходит потому, что клетки остаются жизнеспособными, образуют продукты обмена, изменяющие реакцию рН и соответственно цвет среды. Жизнеспособность клеток обеспечивает нейтрализация вируса соответствующей сывороткой.
Положительной реакцию считают только при четырехкратном увеличении титра вируснейтрализующих антител, т. е. если, например, титр первой сыворотки был 1:8, а во второй, взятой через 1-2 мес, титр не менее чем 1:32.
Вирусы Коксаки
Вирус Коксаки впервые выделили в 1948 г. Г. Долдорф и И. Сиклс в городе Коксаки в США из испражнений детей при полиомиелитоподобных заболеваниях.
Морфологическая структура . Вирусы Коксаки относятся к мелким вирусам (20-30 нм). В их состав входит РНК и белок, форма кубоидальная.
Культивирование . Культивируются они так же как и полиовирус.
Антигенная структура . По антигенной структуре и патогенным свойствам вирусы Коксаки разделяют на 2 группы: А и В.
В группу А входят 24 серологических типа, которые различаются в реакции нейтрализации.
В группу В входят 6 серотипов, различающихся также в реакции нейтрализации.
Устойчивость к факторам окружающей среды . Кипячение губит вирусы Коксаки быстро, 50-55° С - через 30 мин. Низкие температуры вирусы переносят хорошо. При температуре -70° С они сохраняются около 3 мес. Вирусы устойчивы к различным концентрациям водородных ионов, действию эфира, 5% лизолу, но проявляют чувствительность к хлороводородной кислоте, формальдегиду и т. д.
Восприимчивость животных . Вирус типа А вызывает у новорожденных мышей параличи, а серотип 7 - полиомиелитоподобные заболевания у обезьян и хлопковых крыс. Вирус типа В у новорожденных мышей вызывает спастические параличи.
Источники инфекции . Вирусы Коксаки в природе широко распространены. Они выделяются с испражнениями и из носоглотки от больных и вирусоносителей.
Пути передачи . Пищевой (при использовании зараженной воды, пищи и при контакте с объектами внешней среды, инфицированными вирусом; вирусы могут переноситься мухами), воздушно-капельный (больной выделяет вирусы при чиханье, кашле в первые дни болезни).
Патогенез . Входными воротами является слизистая оболочка носоглотки и пищеварительного такта. Вирусы Коксаки характеризуются нейро- и миотропностью. Вирусы Коксаки А могут вызвать паралитические заболевания, схожие с полиомиелитом. Вирусы Коксаки группы В вызывают асептический серозный менингит, асептический миокардит и другие энтеровирусные заболевания.
Иммунитет . После перенесенного заболевания остается стойкий типоспецифический иммунитет.
Профилактика . Санитарные мероприятия: изоляция больных, карантин. Специфическая профилактика не разработана.
Лечение . Симптоматическое.
Вирусологическая диагностика
Цель исследования: выделение вируса и определение его типа.
Материал для исследования, способы его сбора и основные методы исследования такие же, как и при полиомиелите.
Методы диагностики . Выделение вирусов проводят так же, как и при полиомиелите: посев исследуемого материла на первичные и перевиваемые культуры клеток. Некоторые серотипы Коксаки А с трудом адаптируются в культуре клеток.
Выделенные вирусы идентифицируют в РСК и реакции нейтрализации.
Для дифференциации вируса Коксаки типа А от типа В ставят биологическую пробу: заражают новорожденных белых мышей (сосунков).
Вирус типа А вызывает у них вялые параличи без энцефалита, а вирус типа В вызывает судороги и параличи, кроме того, наблюдается поражение внутренних органов - печени, поджелудочной железы и др. При заболевании, вызванном вирусами Коксаки, используют также ретроспективный метод серодиагностики, ставят реакции нейтрализации с парными сыворотками (см. главу 45).
Вирусы ECHO
В 1941 г. Д. Эндерс при изучении полиомиелита выделил из кишечника больного вирус, который по серологическим свойствам отличался от вируса полиомиелита и других кишечных вирусов, и назвал его orphan - сирота. Дальнейшие работы показали, что имеется большое количество схожих с ним вирусов, а всю группу назвали ECHO - Enteric cytopathogenic human orphan viruses.
Морфологическая структура . Величина вируса ECHO 10-15 нм. По своей структуре и репродуктивной способности он мало отличается от полиовирусов и вирусов Коксаки.
Культивирование . Вирусы ECHO, так же как вирусы полиомиелита и Коксаки, культивируют на первичных и перевиваемых линиях клеток.
Антигенные свойства . Вирусы ECHO включают 32 серологических типа, не создающих перекрестного иммунитета.
Устойчивость к факторам окружающей среды . Такая же, как и у вирусов Коксаки.
Восприимчивость животных . Животные не чувствительны к вирусам ECHO.
Источники инфекции, пути передачи и входные ворота . Такие же, как у вирусов полиомиелита и Коксаки.
Патогенез . Вирусы ECHO являются причиной разнообразных заболеваний - вызывают асептический серозный менингит, энтеровирусную лихорадку, эпидемические экзантемы, миокардит и другие лихорадочные заболевания.
Иммунитет . Вирусы ECHO создают стойкий иммунитет за счет вируснейтрализующих антител.
Профилактика . Общесанитарные мероприятия как и при других кишечных инфекциях, но следует помнить, что переохлаждение и перегревание способствуют распространению энтеровирусных заболеваний. Специфическая профилактика не разработана.
Лечение . Симптоматическое.
Вирусологическая диагностика
Материал для исследования, способы его сбора, основные методы исследования и диагностики такие же, как и для других энтеровирусных заболеваний. Однако в качестве культуры клеток ткани лучше использовать первично-трипсинизированные.
Читайте также: