Гигантские многоядерные клетки при герпесе

Цель: Изучение лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций.

Вирус простого герпеса – одна из самых распространенных вирусных инфекций человека, характеризующаяся лихорадочным состоянием и пузырьковыми высыпаниями, которые чаще всего локализуются на коже и слизистых оболочках. Важными особенностями герпетической инфекции являются пожизненное носительство вируса и частые рецидивы болезни.

Вирусная природа простого герпеса установлена в 1912 г. У. Грютером.

(Трёхмерное изображение вируса герпеса).

Герпесвирусы и вызываемые ими заболевания

Таксономия, морфология, химический состав. Возбудитель простого герпеса - ДНК-содержащий вирус, относится к семейству Herpesviridae, роду Simplexvirus. По морфологии и химическому составу не отличается от вирусов ветряной оспы и опоясывающего герпеса.

Культивирование. Вирус простого герпеса (ВПГ) культивируют в куриных эмбрионах, культурах клеток и организме лабораторных животных. На хорионаллантоисной оболочке куриных эмбрионов вирус образует мелкие белые плотные узелки-бляшки; в зараженных культурах - вызывает цитопатический эффект: образование гигантских многоядерных клеток с внутриядерными включениями.

Антигенная структура. Вирус содержит ряд антигенов, связанных как с внутренними белками, так и с гликопротеидами наружной оболочки. Последние являются основными иммуногенами, индуцирующими выработку антител и клеточный иммунитет. Существует два серотипа вируса: ВПГ типа 1 и ВПГ типа 2.

Резистентность. Вирус может выживать на поверхности предметов при комнатной температуре в течение нескольких часов, чувствителен к УФ-лучам, обычным дезинфицирующим средствам, жирорастворителям, термолабилен.

Восприимчивость животных. Вирус простого герпеса патогенен для многих животных, у которых вызывает энцефалит при введении возбудителя в мозг или местный воспалительный процесс при заражении в глаз. В естественных условиях животные не болеют.

Эпидемиология. Простой герпес - одна из самых распространенных инфекций, которая поражает различные возрастные группы людей, чаще в осенне-зимний период. Отмечаются спорадические случаи заболевания, иногда небольшие вспышки в семьях, детских коллективах, больницах. Эпидемий не наблюдается.

Источником инфекции являются больные и носители. Основной механизм передачи - контактный, аэрогенный. Заражение происходит при попадании вирусов на поврежденные кожные покровы или слизистые оболочки.

Эпидемиология герпеса, вызванного вирусами типов 1 и 2, различна. ВПГ типа 1 передается через слюну, зараженные слюной руки и предметы быта, а ВПГ типа 2 - половым путем. Возможно заражение плода через плаценту.

Патогенез и клиническая картина. По клиническим проявлениям различают первичный и рецидивирующий герпес. Входными воротами возбудителя при первичной герпетической инфекции являются поврежденные участки кожи и слизистых оболочек рта, глаз, носа, мочеполового тракта, где вирусы репродуцируются. Затем по лимфатическим сосудам вирусы попадают в кровь и заносятся в различные органы и ткани.

Инкубационный период при первичном герпесе составляет в среднем 6-7 дней. Заболевание начинается с жжения, зуда, покраснения, отека на ограниченных участках кожи и слизистых оболочек, затем на этом месте появляются пузырьковые высыпания, наполненные жидкостью. Иногда заболевание сопровождается повышением температуры тела и нарушением общего состояния. При подсыхании пузырьков рубцов не образуется. Первичный герпес у новорожденных протекает тяжело и нередко заканчивается смертью. Однако у большинства людей первичная инфекция остается нераспознанной, так как протекает бессимптомно.

После первичной инфекции (явной и бессимптомной) 70-90 % людей остаются пожизненными носителями вируса, который сохраняется в латентном состоянии в нервных клетках чувствительных ганглиев. Нередко у носителей появляются рецидивы болезни в результате переохлаждения, перегревания, менструации, интоксикации, различных инфекционных заболеваний, стрессов, нервно-психических расстройств. Для рецидивирующего герпеса характерны повторные высыпания на коже и слизистых оболочках, нередко в тех же местах. Наиболее частой локализацией рецидивирующего герпеса, вызванного ВПГ типа 1, являются губы, крылья носа, полость рта, конъюнктива глаз. ВПГ типа 2 поражает мочеполовую систему и вызывает герпес новорожденных. Доказана роль ВПГ типа 2 в развитии рака шейки матки. Сравнительно редко встречаются генерализованные формы рецидивирующего герпеса, в частности поражения нервной системы и внутренних органов.

Иммунитет. В результате первичной герпетической инфекции в организме образуются сывороточные и секреторные антитела, которые обусловливают иммунитет к первичному герпесу, но не препятствуют сохранению вируса и возникновению рецидивов. Рецидивирующий герпес возникает при высоком уровне антител к вирусу герпеса. Основное значение в развитии рецидивирующего герпеса имеет состояние клеточного иммунитета.

Лабораторная диагностика. Материалом для исследования являются содержимое герпетических пузырьков, слюна, соскобы с роговой оболочки глаза, кровь, цереброспинальная жидкость, в летальных случаях . кусочки головного и спинного мозга.

Экспресс-диагностика заключается в обнаружении гигантских многоядерных клеток с внутриядерными включениями в мазках-отпечатках из высыпаний, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Для дифференциации от других вирусов, принадлежащих к этому семейству, используют РИФ, ИФА, РИА, ПЦР. Выделение вируса проводят на куриных эмбрионах, культуре клеток и на лабораторных животных (мыши-сосунки), идентифицируют вирус с помощью РИФ или РН. В последние годы в диагностике простого герпеса начали применять моноклональные антитела, что дает возможность определить серотип вируса. Для серодиагностики заболевания используют РСК, РН, РИФ, ИФА.

Специфическая профилактика и лечение. Для профилактики тяжелых форм рецидивирующего герпеса в период ремиссии применяют многократное введение инактивированной, культуральной герпетической вакцины. Вакцинация, а также применение иммуномодуляторов, например реаферона, удлиняют межрецидивный период и облегчают течение последующих рецидивов. В остром периоде с лечебной целью используют химиотерапевтические препараты (виразол, ацикловир, оксолиновую, тебро-феновую, флореналовую мази, бонафтон), интерфероны и индукторы интерферона.

Вирус цитомегалии

Цитомегалия - инфекционное заболевание, возбудителем которого является цитомегаловирус (ЦМВ) Cytomegalovirus hominis (от греч. cytys - клетка, megas - большой). Вирус вызывает цитомегаловирусную инфекцию человека, характеризующуюся поражением почти всех органов (преимущественно слюнных желез) с образованием в них гигантских клеток с внутриядерными включениями, протекающую в различных формах - от бессимптомного носительства до тяжелой генерализованной формы, заканчивающейся летальным исходом.

Вирус впервые выделен К. Смитом в 1956 г.

Таксономия, морфология, антигенная структура. Возбудитель цитомегалии - ДНК-содержащий вирус, относится к семейству Herpesviridae, роду Cytomegalovirus.

Морфология, химический состав типичны для семейства герпесвирусов. Диаметр вирусной частицы (вириона) около 180 нм. В центре вириона находится двенадцатигранный нуклеокапсид, содержащий генетическую информацию - двухнитевую ДНК-вируса. Установлено 2 антигенных серотипа вируса.

Резистентность. Вирус термолабилен, чувствителен к дезинфицирующим средствам и жирорастворителям.

Эпидемиология. Цитомегаловирусная инфекция широко распространена на земном шаре. Источником вируса является больной человек или носитель. Вирус выделяется со слюной, мочой, секретами организма, реже фекалиями. Предполагается, что ведущий механизм передачи инфекции - контактно-бытовой, возможны аэрогенный и фекально-оральный механизмы передачи. Цитомегаловирус обладает высокой способностью проникать через плаценту (вертикальная передача), вызывая внутриутробную патологию плода.

Патогенез и клиническая картина. Патогенез не вполне выяснен. Инфекция связана с длительным носительством вируса, который в латентном состоянии сохраняется в слюнных железах, почках и других органах. Активация латентной инфекции происходит при иммунодефицитных состояниях, иммунодепрессивной терапии. Вирус поражает ЦНС, костный мозг, почки, печень, клетки крови. У беременных женщин цитомегалия может приводить к недоношенности, мертворождению, развитию аномалий у плода.

Иммунитет. У больных независимо от клинической формы инфекции, а также у носителей образуются антитела, которые, однако, не препятствуют сохранению вируса в организме и выделению его в окружающую среду. Интенсивность развития болезни находится под контролем клеточной иммунной системы хозяина.

Лабораторная диагностика. Обследованию на цитомегалию в первую очередь подлежат дети с поражением ЦНС и врожденными уродствами, а также женщины с неблагополучно протекающей беременностью. Исследуемый материал - слюна, моча, мокрота, цереброспинальная жидкость, кровь, пунктат печени.

Специфическая профилактика и лечение. Разработана живая аттенуированная вакцина. Для лечения применяют химиотерапевтические препараты (ганцикловир, фоскорнет натрия), иммуномодуляторы, интерферон.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Проблеме диагностики герпесвирусных инфекций посвящено множество научных публикаций, однако в последнее время все более возрастает интерес к этому вопросу со стороны клиницистов разных специальностей. По данным литературы, вирусом простого герпеса инфицировано 65-90 % взрослого и детского населения планеты. Местом локализации первичной герпесвирусной инфекции чаще всего является слизистая оболочка полости рта.

Несмотря на широкое и разностороннее изучение данной патологии, отмечается тенденция к росту распространенности герпетических стоматитов, особенно среди детского населения. Наделю герпетической инфекции среди всех поражений слизистой полости рта у детей приходится около 80 %, у 8-20% пациентов заболевание принимает рецидивирующий характер. При этом вирус может поражать практически все органы и ткани человеческого организма. У детей грудного и раннего возраста, после исчезновения антител, полученных интерплацентарно от матери, герпетическая инфекция, как правило,протекает в виде острого герпетического стоматита. Хроническая герпетическая инфекция в полости рта проявляется в виде рецидивирующего герпетического стоматитаили герпеса губ.

Современные наблюдения специалистов позволяют говорить о изменении клинической картины герпетического стоматита и выделении атипичных форм заболевания, а именно геморрагической, геморагически-некротической, язвенной, отечной, элефанзиазоподобной, рупеоидной, зудящей, эритематозной и папулезной, герпетиформной экземы Капоши, генерализованного герпеса. В литературе упоминается импетигоподобная форма герпеса, при которой высыпания на слизистой оболочке полости рта сочетаются со стрептококковым импетиго в периоральной зоне. Атипичные формы заболевания затрудняют диагностику. Таким образом, высокая инфицированность населения и распространенность заболевания, наличие атипичных форм и отсутствие четких диагностических алгоритмов свидетельствуют об актуальности этой проблемы.

Материалом для исследования при герпетической инфекции полости рта являются:

Соскоб и мазок-отпечаток с элементов поражения, слюна, кровь.

На сегодняшний день существует большое количество лабораторных методов диагностики герпесвирусных инфекций.

Выделяют три основных диагностических подхода:

1). изоляция и идентификация вирусаиз клинического материала;

2). непосредственное исследование материала на наличие вируса, вирусного антигена или нуклеиновых кислот

3). серологическая диагностика, основанная на установлении значительного прироста вирусных антител в течение болезни.

В настоящее время применяется ускоренный вирусологический метод выявления вирусов. При этом методе материал, полученный от больных, культивируется совместно с культурой клеток Vero в течение 24-х часов. После предварительной обработки применяется реакция непрямой иммунофлюорисценциии результаты оценивают под люминисцентным микроскопом.Этот метод позволяет выбрать антивирусный препарат для лечения герпетической инфекции и оценить эффективность противовирусной терапии через 1,5-2 месяца после окончания лечения. Результаты обследования готовы через 2-е суток.

Биологическая проба состоит в заражении чувствительных лабораторных животных (белых мышей или кроликов) биоматериалом, полученным от больного. Метод рекомендуют использовать в спорных случаях герпесвирусной инфекции и для диагностики атипичных форм.

Микроскопические методы исследования герпеса:

включают цитологическую диагностику и электронную микроскопию. Исследуемый материал для микроскопических методов получают путем соскоба или мазка-отпечатка с пораженных участков слизистой и кожи.

Цитологический метод простой, доступный, рассматривается как экспресс-метод, так как результаты исследования получают через 2-3 часа. Его чувствительность и специфичность не превышают 70-75 %. Метод нашел широкое применение в стоматологической практикедля проведения дифференциальной диагностики в сложных случаях и оценки эффективности лечебных мероприятий.

К методам экспресс-диагностики герпеса относится:

Электронная микроскопия. Метод позволяет выявить вирусные частицы в исследуемом образце. Для успешного определения вируса его концентрация в пробе должна быть примерно 1ˑ10 6 частиц в 1 мл. Но поскольку концентрация возбудителя в материале обычно незначительна, то требуется предварительное центрифугирование. Однако метод электронной микроскопии не позволяет дифференцировать вирусы простого герпеса и ветряной оспы, цитомегалии, поскольку они морфологически практически одинаковы. Использование метода ограничивается его трудоемкостью, малодоступностью, дороговизной, поэтому он применяется в основном в научных целях. Для получения результатов метода электронной микроскопии необходимо около 3-х часов, чувствительность метода составляет 70 %, специфичность около 100 %.

В настоящее время главенствующую роль в верификации герпесвирусных инфекций играют методы ДНК-диагностики, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ДНК-гибридизация.

Гибридизация ДНК – высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его специфического связывания (гибридизации) с меченой комплементарной молекулой ДНК-диагностикума. В качестве маркера применяют ферменты (пероксидазу, щелочную фосфатазу) и изотопы. Недостатком метода является его длительное время выполнения- в среднем 5-7 суток, а также высокая частота ложноотрицательных результатов при низком количестве вирусной ДНК в исследуемой пробе.

Наиболее широко используемым методом диагностики герпетической инфекции является полимеразная цепная реакция (ПЦР), предложенная Мюллисом в 1983 году. В основе метода лежит катализируемая ферментом ДНК-полимеразой многократное образование копий (ампликация) определенного участка ДНК, представляющего диагностический интерес. Для ампликации отбирают уникальный ген, который наиболее четко отличает определяемый патоген от прочих.

Различают качественный, полуколичественный и количественный варианты метода. При проведении качественной ПЦР определяют лишь факт присутствия вируса, однако не возможным является оценка его репродуктивной активности, что не позволяет провести дифференциальную диагностику между латентными, персистирующими и реактивными формами инфекции. Полуколичественная ПЦР дает информацию о содержании копий вирусных ДНК в виде условных обозначений (+, ++, +++, ++++). Методом, позволяющим получить числовые значения, отражающие репродуктивную активность вируса является количественная ПЦР. Полученный количественный результат не соответствует истинному содержанию ДНК возбудителя в исследуемой пробе. При этом существует определенная пропорциональность между исходным количеством ДНК вируса и конечным результатом исследования. Такая пропорциональность соблюдается лишь при проведениидиагностики в стандартных условиях с использованием одних и тех же реактивов, поэтому сравнительный анализ полученных результатов в динамике проводят при обследовании пациента в одной лаборатории.

Ложноотрицательные результаты возможны при несоблюдении технологий и использовании некачественных реактивов. Ложноположительные данные возможны при подсчете результатов методом электрофореза, что обусловлено контаминацией воздушной среды рабочего пространства ампликонами при предварительных постановках, поэтому используют открытые методики подсчета результатов с надлежащей вентиляцией помещений и закрытые, которые являются более предпочтительными, так как предполагают отсутствие прямогоконтактамежду продуктами реакции и воздушной средой.

Наиболее точной является методика ПЦР в реальном времени (real time ПЦР). Ее особенностью является подсчет количества амплифицированных ДНК по мере их накопления после каждого цикла, а не в конце постановки ПЦР.

Даже количественная ПЦР не всегда позволяет отдифференцировать латентную и реактивированную инфекции. В этом случае рекомендуют использовать ПЦР обратной транскрипции, с помощью которой подсчитывают количество вирусной м-РНК, которое свидетельствует об интенсивности экспрессии вирусных генов. ПЦР является точным методом, так как для получения результата достаточно иметь в пробе всего одну молекулу ДНК возбудителя. Чувствительность ПЦР составляет 98%, а специфичность – 94 %. РезультатыПЦР можно получить уже через 3-6 часов после начала проведения.В стоматологической практике ПЦР широко применяется в диагностических целях. Установлена зависимость уровня вирусной активности в ротовой жидкости от степени тяжести герпетической инфекции.

Определения вирусных антигенов возможно при помощи реакции иммунофлюорисценции.

Этот метод основан на использовании иммуноглобулинов, меченных красителями и дающих зеленовато-желтую или красную флюорисценцию. Результаты метода учитывают при люминисцентой микроскопии препаратов обработанных меченными антителами. Метод иммунофлюорисценции используют в двух вариантах: прямой (ПИФ) и непрямой (НИФ). При прямом методе красителями метят антитела, непосредственно взаимодействующие с антигеном. При непрямом методе с исследуемым антигеном взаимодействуют специфические антитела, а уже с ними антивидовые антитела, меченые флюорохромом. Эти методы в какой то мере дублируют результаты ПЦР и могут быть полезны для исключения ложноположительных или ложноотрицательных результатов ДНК-диагностики. Чувствительность метода – 55-75 %, специфичность – 90 %. Метод нашел широкое применение в стоматологической практике для уточнения диагноза.

Серологические методы диагностики герпеса:

(реакции нейтрализации, связывания комплемента, гемагглютинации, иммунофлюорисценции и др.) позволяют оценить характер и напряженность специфического гуморального иммунитета. Все эти методы позволяют с разной степенью достоверности установить факт инфицирования пациента с вирусом. Диагностика основывается на наличии противогерпетическихIg M и Ig G. Наличие специфического Ig M свидетельствует об остроте процесса (первичная инфекция, реинфекция, реактивация). При первичной герпесвирусной инфекции противогерпетический Ig M появляется на 7-14 сутки после инфицирования и циркулирует 1-3 месяца. У отдельных лиц может сохраняться на протяжении длительного времени, давая ложную информацию об остроте процесса. Противогрепетические Ig G являются антителами вторичного иммунного ответа. При первичной инфекции выявляются во второй половине инфекционного процесса, а также при латентной, персистирующей инфекции и реактивации вируса. Рекомендуют применять метод парных сывороток, оценивая титр специфических антител с промежутком в 2-3 недели. Однако четырехкратное повышение титра специфическогоIg G является диагностическим критерием лишь при первичном инфицировании. Проведение серологических исследований позволяет оценить иммунный статус организма. Так, расхождение между показателями ПЦР, свидетельствующими о высокой репродуктивнойактивности вируса, и данными серологических исследований, показывающими низкий титр специфических антител, свидетельствует о недостаточности специфического гуморального иммунного ответа и является показанием к назначению заместительной терапии (препаратов специфических иммуноглобулинов) или средств, повышающих антителогенез (полиоксидоний, спленин и др.).

Иммунологические исследования являются обязательными при манифестных формах инфекции, так как вирус способен оказывать иммуносупрессивное действие на зараженный организм. Результаты таких исследований позволяют выявить иммунный дефект и назначить рациональную терапию. Метод применяется для выбора средств иммунотерапии и оценки их эффективности при лечении герпетических стоматитов.

Таким образом, диагностическими критериями герпетической инфекции полости рта являются:

-выявление вирусных агентов в крови, слюне, соскобах и мазках-отпечатках с элементов поражения достоверными методами: ПЦР, методом иммунофлюорисценции;

- в спорных случаях для экспресс-диагностики необходимо проводить цитологическое исследование с целью выявления клеток Тцанка;

- для диагностики первичной герпетической инфекции важным является выявление вирус-специфических иммуноглобулинов M и G.

При постановке диагноза обязательно учитывают наличие клинических признаков герпетической инфекции (типичных элементов поражения).

Для назначения рациональной противовирусной и иммунотерапии рекомендуется проведение следующих исследований:

- определение противогерпетических антител классаM, G и А для оценки напряженности специфического гуморального иммунитета;

- иммунологическое исследование проводят при тяжелом или атипичном течении и частых рецидивах герпетической инфекции, при низкой чувствительности к лечению ацикловиром и его аналогами.