Энтеропатогенная кишечная палочка гост
3 Постановлением Государственного комитета Российской Федерации по стандартизации и метрологии от 27 июля 2001 г. N 297-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 30726-2001 введен в действие в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 июля 2002 г.
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.
1 Область применения
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта бактерий вида Escherichia coli (E.coli) и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агаризованные селективно-диагностические среды.
Выбор метода определения количества E.coli зависит от предполагаемой обсемененности продукта бактериями семейства Enterobacteriaceae и осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 30518*.
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52816-2007.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе
ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
____________
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.
ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов
ГОСТ 29184-91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae
ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности
ГОСТ 30518-97/ГОСТ Р 50474-93 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)
ГОСТ 30519-97/Р 50480-93* Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002).
3 Сущность методов
Методы выявления и определения НВЧ E.coli основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных колб (пробирок), пересеве культуральной жидкости на поверхности агаризованной селективно-диагностической среды для дальнейшего подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний E.coli.
Методы определения количества E.coli посевом в или на агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве определенного количества продукта или его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных для E.coli колоний, подтверждении по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к E.coli.
4 Отбор и подготовка проб
5 Аппаратура, материалы, реактивы (в т.ч. индикаторы)
6 Подготовка к анализу
6.1 Приготовление растворов и реактивов
6.1.1 Реактив Кларка: 0,1 г метилового красного растворяют в 300 см этилового спирта и добавляют 200 см дистиллированной воды. Реактив хранят в посуде из темного стекла не более 1 мес при температуре (4±2) °С.
6.1.2 Реактивы Ковача и Эрлиха готовят по ГОСТ 30519.
6.1.4 Приготовление индикаторных бумажек для обнаружения индола: 3-5 г парадиметиламинобензальдегида, 10 см концентрированной фосфорной кислоты и 50 см этилового спирта тщательно перемешивают в фарфоровой ступке. В полученном растворе смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают узкими полосками шириной около 1 см. Цвет полученных бумажек - желтый. Индикаторные бумажки хранят не более 1 мес в темном месте.
6.1.5 Раствор гидроокиси калия массовой концентрации 400 г/дм : 40 г гидроокиси калия переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.
6.1.6 Реактивы и растворы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.
6.2 Приготовление питательных сред
6.2.1 Бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью готовят по ГОСТ 30518.
6.2.2 Бульон Мак-Конки готовят по ГОСТ 30518.
6.2.3 Бульон глюкозо-фосфатный, сухой промышленного производства.
6.2.4 Бульон мясо-пептонный с триптофаном: 0,05 г L-триптофана растворяют в 100 см мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6-7 см и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.
6.2.5 Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1.
6.2.6 Среду Кесслер готовят по ГОСТ 30518.
6.2.7 Среда Кларка: в 1 дм дистиллированной воды при нагревании растворяют 5,0 г пептона, 5,0 г глюкозы, 5,0 г фосфорнокислого двузамещенного калия, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,2±0,1). Среду разливают по 5-6 см в пробирки и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 15 мин или дробным методом - текучим паром по 30 мин три дня подряд.
6.2.8 Среда (типа Клиглера) для первичной дифференциации энтеробактерий, сухая промышленного производства.
6.2.9 Среда Козера: в 1 дм дистиллированной воды при нагревании растворяют 1,5 г фосфорнокислого двузамещенного натрия-аммония, 1,0 г фосфорнокислого однозамещенного калия, 0,2 г сернокислого магния и 2,5 г лимоннокислого натрия, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,2±0,1) при 25 °С. Среду стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 15 мин.
После стерилизации к 1 дм среды добавляют 10 см спиртового раствора бромтимолового синего массовой концентрации 5 г/дм , затем среду разливают по 6-7 см в стерильные пробирки. Приготовленная среда имеет оливково-зеленый цвет.
6.2.12 Среда Эндо, сухая промышленного производства.
6.2.13 Трехсахарный агар готовят по ГОСТ 30519.
6.2.14 Среды из сухих препаратов промышленного производства готовят по прописям, указанным на этикетках.
6.2.15 Тест-системы для биохимической идентификации промышленного производства.
7 Проведение анализа
7.1 Посевы для определения количества E.coli в 1 г (см ) продукта и выявления Е.соli в определенной навеске продукта проводят по ГОСТ 30518.
Посевы на агаризованной и жидких средах инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24-48 ч. Чашки Петри инкубируют дном вверх. Посевы просматривают через (24±3) ч, отмечают положительные посевы в жидких средах, а окончательный учет проводят через (48±3) ч.
Положительными считают посевы в жидкие среды, в которых имеет место рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды, образовании газа, подкислении среды (то есть изменении цвета среды).
7.2 Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших в жидких средах, к E.coli делают пересевы по ГОСТ 26670 на поверхность среды Эндо, приготовленной по 6.2.12.
Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение (24±3) ч.
7.3 Посевы на агаризованной среде по 7.1 и 7.2 просматривают после инкубирования и отмечают рост характерных для Е.соli колоний.
На среде Эндо Е.соli образуют колонии от бледно-розового до темно-красного цвета часто с металлическим блеском.
Для дальнейшего подтверждения принадлежности выросших колоний к E.coli отбирают по три колонии каждого типа.
Из отобранных колоний приготавливают мазки, окрашивают их по Граму по ГОСТ 30425. Параллельно в каждой отобранной колонии у бактерий по ГОСТ 29184 определяют отсутствие оксидазы.
Оксидазоотрицательные бактерии пересевают на поверхность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара. Посевы инкубируют до появления видимого роста при температуре (36±1) °С.
7.4 У оксидазоотрицательных грамотрицательных культур (палочки размером 1,1 1,5х2 6 мкм), выросших в пересевах по 7.3, определяют возможность образования индола, ацетоина, сероводорода, утилизации цитрата, интенсивность ферментации углеводов с образованием кислоты, ферментацию сорбита, глюкозы и лактозы.
E.coli образует индол.
7.4.2 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауэра)
Культуру высевают в пробирки со средой Кларка, приготовленной по 6.2.7. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 48 ч.
После инкубирования посевов к 1 см отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см раствора -нафтола, приготовленного по 6.1.3, и 0,2 см раствора гидроокиси калия, приготовленного по 6.1.5. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Проявление розового окрашивания через 15-60 мин указывает на положительную реакцию.
E.coli не образует ацетоин.
7.4.3 Определение утилизации цитрата
Культуру высевают в пробирки со средой Козера, приготовленной по 6.2.9, или на поверхность среды Симмонса, приготовленной по 6.2.10. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24-48 ч. Изменение оливково-зеленого цвета сред на васильковый, синий указывает на положительную реакцию.
E.coli не утилизирует цитрат.
7.4.4 Определение интенсивности ферментации углеводов с образованием кислоты (реакция с метил-рот)
Культуру высевают в пробирки с глюкозо-фосфатным бульоном или средой Кларка или используют посевы после отбора 1 см культуральной жидкости по 7.4.2. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 48 ч. К 5 см культуральной жидкости прибавляют 5-10 капель реактива Кларка, приготовленного по 6.1.1. Появление через 1 мин красного цвета культуральной жидкости указывает на ферментацию углеводов до рН ниже 5,0.
E. coli интенсивно ферментирует углеводы (реакция с метил-рот положительная).
7.4.5 Определение ферментации сорбита, глюкозы и лактозы
Культуру высевают в среды Гисса с сорбитом или глюкозой, или лактозой приготовленные по 6.2.11. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч, а на среде Гисса с лактозой при температуре (44±1) °С в течение 24 ч.
E. coli ферментирует глюкозу, лактозу и сорбит.
При ферментации глюкозы образуется газ. Ферментацию глюкозы можно учитывать в засеянных косяках трехсахарного агара или среды Клиглера по изменению цвета столбика среды и образованию в нем газа.
Ферментацию лактозы учитывают по изменению цвета скошенной поверхности среды Клиглера.
Ферментацию сорбита учитывают по изменению цвета среды.
У культур типичных для Е. соli по всем изученным признакам, но не ферментирующим сорбит, изучают возможность ферментации целлобиозы на среде, приготовленной по 6.2.11, при температуре (36±1) °С в течение 24 ч. Е. соli не ферментирует целлобиозу, цвет среды не меняется.
7.4.6 Определение образования сероводорода
Образование сероводорода учитывают в посевах на среду Клиглера или трехсахарный агар после инкубирования посевов при температуре (36±1) °С в течение 24 ч. Почернение в столбике среды указывает на образование сероводорода.
Е. соli не образует сероводород.
7.4.7 Для биохимической идентификации выявленных бактерий допускается использование тест-систем промышленного производства.
8 Обработка результатов анализа
8.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
8.2 К бактериям Е.соli относят оксидазоотрицательные не образующие спор грамотрицательные палочки, обладающие способностью ферментации лактозы при температуре (44±1) °С, ферментирующие глюкозу и сорбит, дающие положительную реакцию с метил-рот, образующие индол, необразующие ацетоин и не утилизирующие цитрат. Бактерии не ферментирующие сорбит и целлобиозу, но по другим биохимическим признакам давшие типичные для Е.соli реакции, относят к сорбитотрицательным штаммам Е.соli. Основные дифференцирующие признаки видов рода Escherichia приведены в приложении А.
8.3 Посевы навески продукта в жидкие среды считают положительными, если при последующем пересеве и подтверждении характерных колоний хотя бы в одной колонии будут обнаружены Е.соli.
8.4 НВЧ Е.соli в 1 г (см ) продукта определяют по количеству положительных колб (пробирок) по ГОСТ 26670.
8.6 Результаты определения количества Е.соli и выявления их в определенной навеске продукта записывают по ГОСТ 26670.
Кишечная палочка (эшерихия коли, лат. Escherichia coli; общепринятое сокращение E. coli) — вид грамотрицательных палочковидных бактерий, факультативных анаэробов, входящий в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека.
Вид эшерихия коли (E. coli) включён в род эшерихии (лат. Escherichia), семейство энтеробактерии (лат. Enterobacteriaceae), порядок энтеробактерии (лат. Enterobacteriales), класс гамма-протеобактерии (лат. γ proteobacteria), тип протеобактерии (лат. Proteobacteria), царство бактерии.
Кишечные палочки (Escherichia coli) устойчивы во внешней среде, длительное время сохраняются в почве, воде, фекалиях. Хорошо переносят высушивание. Кишечные палочки обладают способностью к размножению в пищевых продуктах, особенно в молоке. Быстро погибают при кипячении и воздействии дезинфицирующих средств (хлорной извести, формалина, фенола, сулемы, едкого натра и др.). 
Кишечные палочки более устойчивы во внешней среде по сравнению с другими энтеробактериями. Прямой солнечный свет убивает их в течение нескольких минут, температура 60°С и 1 % раствор карболовой кислоты — в течение 15 минут.
Часть кишечных палочек имеет жгутики и подвижны. У других кишечных палочек жгутики и способность к движению отсутствуют.
Число кишечных палочек Escherichia coli среди других представителей микрофлоры кишечника не превышает 1%, но они играют важнейшую роль в функционировании желудочно-кишечного тракта. Кишечные палочки E. coli являются основными конкурентами условно-патогенной микрофлоры в отношении заселения ими кишечника. Кишечные палочки E.coli забирают из просвета кишечника кислород, который вреден для полезных для человека бифидо- и лактобактерий. Кишечные палочки E. coli вырабатывают ряд необходимых для человека витаминов: В1, В2, В3, В5, В6, биотин, В9, B12, К, жирные кислоты (уксусную, муравьиную, а ряд штаммов также молочную, янтарную и другие), участвует в обмене холестерина, билирубина, холина, желчных кислот, оказывает влияние на всасывание железа и кальция.
Escherichia coli в кишечнике человека появляются в первые дни после рождения и сохраняются на протяжении жизни на уровне 10 6 -10 8 КОЕ/г содержимого толстой кишки. В фекалиях здорового человека кишечные палочки (типичные) выявляются в количестве 10 7 -10 8 КОЕ/г, при этом количество лактозонегативных кишечных палочек не должно превышать 10 5 КОЕ/г, а гемолитические кишечные палочки должны отсутствовать.
Отклонения от указанных значений является признаком дисбактериоза:
- снижение типичных кишечных палочек до 10 5 -10 6 КОЕ/г, или повышение содержания типичных эшерихий до 10 9 -10 10 ; КОЕ/г определяется, как первая степень микробиологических нарушений
- повышение концентрации гемолитических кишечных палочек до 10 5 -10 7 КОЕ/г определяется, как вторая степень микробиологических нарушений
При избыточном росте кишечной палочки, как следствии дисбактериоза, кроме бактериофагов, при медикаментозной терапии применяются различные пробиотки (Бифидумбактерин, Лактобактерин, Ацилакт, Аципол и др.) и/или адекватные конкретному штамму e. coli и причине дисбактериоза антибиотики (у взрослых).
Патогенные серотипы кишечных палочек могут быть причиной эшерихиозов — различных инфекционных заболеваний, протекающих с интоксикацией, лихорадкой, обычно с поражением желудочно-кишечного тракта, реже — мочевыводящих, желчевыводящих путей, других органов или с развитием сепсиса. Эшерихиозы чаще встречаются у детей раннего возраста. Механизм распространения эшерихиозов ЖКТ — фекально-оральный. Чаще всего заражение происходит через загрязнённую пищу или воду.
Escherichia coli (кишечная палочка) — наиболее часто встречающийся возбудитель спонтанного бактериального перитонита — воспаления брюшной полости при отсутствие очевидного источника инфекции.
Энтеропатогенная кишечная палочка имеет два важных фактора вирулентности:
- фактор колонизации, за счет которых происходит прилипание ETEC к энтероцитам тонкой кишки
- токсический фактор: штаммы ETEC продуцируют термолабильные (LT) и/или термостабильные (ST) энтеротоксины, вызывающие секрецию сока и электролитов, что приводит к водянистой диарее. ETEC не разрушают кисточковую кайму и не внедряются в слизистую оболочку кишечника
Энтерогеморрагические кишечные палочки (EHEC) являются причиной геморрагического колита, а также тяжелого заболевания — гемолитико-уремического синдрома (микроангиопатической гемолитической анемии, сочетающейся с почечной недостаточностью; аббревиатура ГУС или HUS).
Для геморрагического колита характерно острое начало в виде сильных спастических болей в животе и водной диареи, которая вскоре становится кровавой. Лихорадка обычно отсутствует, но у некоторых температура тела может достигать 39 °С. В легких случаях геморрагический колит продолжается 7–10 дней. Приблизительно в 5 % случаев геморрагический колит осложняется геморрагическим синдромом, острой почечной недостаточностью и гемолитической анемией.
Источником инфекции мая 2011 года в Германии и других европейских странах являлся штамм продуцирующей шига-токсин STEC (синоним: продуцирующей веротоксин - VTEC) энтерогеморрагической кишечной палочки.
Заражение STEC или VTEC-кишечной палочкой происходит чаще всего через продукты питания или при близком контакте с больными людьми или животными. Для начала заболевания достаточно небольшого числа STEC/VTEC Escherichia coli.
Установлено, что возбудителем европейской инфекции мая 2011 года является кишечная палочка серологической группы E. coli O104 (серотип E. coli O104:H4), имеющая в своем геноме ген, ответственный за продукцию шига-подобного токсина 2-го типа. В отличие от классических энтерогеморрагических кишечных палочек (E. coli О157:Н7), штаммы E.coli O104:H4 не имеют еае-гена, ответственного за продукцию белка интимина, который является фактором адгезии.
Штаммы E. coli O104:H4, выделенные от пациентов, характеризовались резистентностью к бета-лактамным антибиотикам за счет продукции бета-лактамазы расширенного спектра, но оставались чувствительными к группе аминогликозидов (гентамицин) и фторхинолонам.
После заражения энтерогеморрагической кишечной палочкой инкубационный период длится чаще всего от 48 до 72 часов, но может быть и от 1 до 10 дней. Симптомы заражения включают схваткообразные боли в животе и диарею, нередко с кровью. Могут наблюдаться лихорадка и рвота. Большинство больных выздоравливают в течение 10 дней. Иногда инфекция может приводить к опасным для жизни состояниям, таким как гемолитико-уремический синдром.
Инфицирование кишечными палочками (а также другими уропатогенными микробами, обитающими в кишечнике) мочеполовых органов, особенно у женщин, часто происходит непосредственно из желудочно-кишечного тракта при недостаточном соблюдении гигиены или применении специфических сексуальных практик. Кишечные палочки являются причиной:
- около 80 % внебольничных инфекций мочевыводящих путей
- 64 % всех заболеваний острым простатитом
- 80 % всех хронических простатитов
- для пациентов старше 35 лет — большей части всех эпидидимитов (воспалительный процесс в придатке яичка), орхитов (воспаление яичка) и эпидидимоорхитов (сочетанное воспаление яичка и придатка яичка)
- 70-95 % инфекций мочевых путей, достигающих мочевого пузыря или почки восходящим путем
- других заболеваний мочеполовых органов
При наличии симптомов или при заборе мочи катетером диагностический порог может быть значительно уменьшен. В частности, при наличии клинической симптоматики (лихорадка, озноб, тошнота, рвота, боли в поясничной области, дизурия) и выделении не менее 10 лейкоцитов в 1 мкл мочи, критерием для диагностики острого пиелонефрита является наличие не менее 10 4 кишечных палочек (или других патогенных энтеробактерий) в 1 мл свежевыпущенной мочи. Острый цистит диагностируется при наличии соответствующей клинической симптоматики, выделении не менее 10 лейкоцитов в 1 мкл мочи и обнаружении не менее 10 2 кишечных палочек (или других колиформных бактерий) в 1 мл мочи.
Штамм кишечной палочки Escherichia coli Nissle 1917 (DSM 6601) считается наиболее эффективным пробиотиком, помогающим уменьшить воспаление и оттянуть следующий приступ язвенного колита (Пробиотики. Что это такое и что они могут дать?). Этот штамм входит, в частности, в состав пробиотика Mutaflor (фирма Ardeypharm).
Специально подобранные штаммы эшерихии коли входят в состав лекарств: Хилак форте (штамм DSM 4087), Бификол (штамм М-17), Колибактерин (штамм М-17) и других.
Антибактериальные средства (из имеющих описание в данном справочнике), активные в отношении кишечной палочки: амоксициллин, левофлоксацин, нифурател, нифуроксазид, рифаксимин, фуразолидон, ципрофлоксацин, норфлоксацин, офлаксацин, моксифлоксацин, доксициклин (не все штаммы).
Escherichia coli устойчива к клотримазолу.
Текст ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli
ВНЕСЕН Еосстандартом России
2 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 19 от 24 мая 2001 г.)
За принятие проголосовали:
Наименование национального органа по стандартизации
Госстандарт Республики Беларусь
Госстандарт Республики Казахстан
3 Постановлением Еосударственного комитета Российской Федерации по стандартизации и метрологии от 27 июля 2001 г. № 297-ст межгосударственный стандарт РОСТ 30726—2001 введен в действие в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 июля 2002 г.
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.
Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания на территории Российской Федерации без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
Food-stuffs. Methods for detection and determination of Escherichia coli
Дата введения 2002—07—01
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта бактерий вида Escherichia coli (E.coli) и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агари-зованные селективно-диагностические среды.
Выбор метода определения количества E.coli зависит от предполагаемой обсемененности продукта бактериями семейства Enterobacteriaceae и осуществляется в соответствии с требованиями ЕОСТ 30518*.
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ЕОСТ 9284—75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 10444.1—84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе
ГОСТ 24104—88** Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
ГОСТ 26668—85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26669—85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26670—91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов
ГОСТ 29184—91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae
ЕОСТ 30425—97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности
ГОСТ 30518—97/ГОСТ Р 50474—93 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)
ГОСТ 30519—97/Р 50480—93*** Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella
Методы выявления и определения НВЧ Е.СоИ основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных колб (пробирок), пересеве культуральной жидкости на поверх-
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52816—2007.
** С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104—2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.
*** На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52814—2007 (ИСО 6579:2002).
ность агаризованной селективно-диагностической среды для дальнейшего подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к E.coli.
Методы определения количества E.coli посевом в или на агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве определенного количества продукта или его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных для E.coli колоний, подтверждении по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к E.coli.
Отбор и подготовка проб — по ЕОСТ 26668, ЕОСТ 26669.
Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ЕОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:
весы лабораторные общего назначения по ЕОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и допустимой погрешностью ±10 мг (для взвешивания продукта) и весы с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности (для взвешивания реактивов);
микроскоп биологический с приспособлением для фазово-контрастного микроскопирования, обеспечивающий увеличение 900—1000 х ; петлю бактериологическую; поплавки (трубки Дархема); стекла предметные по ГОСТ 9284;
термостаты с диапазоном рабочих температур 28—55 °С, позволяющие поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью ± 1 °С; бриллиантовый зеленый; генцианвиолет;
желчь говяжью сухую или натуральную; магний сернокислый; метиловый красный; метиловый фиолетовый;
натрий-аммоний фосфорнокислый двузамещенный; сорбит;
феноловый красный; целлобиоза.
6.1.1 Реактив Кларка: 0,1 г метилового красного растворяют в 300 см 3 этилового спирта и добавляют 200 см 3 дистиллированной воды. Реактив хранят в посуде из темного стекла не более 1 мес при температуре (4+2) °С.
6.1.2 Реактивы Ковача и Эрлиха готовят по ГОСТ 30519.
6.1.3 Спиртовой раствор а-нафтола готовят по ГОСТ 30519.
6.1.4 Приготовление индикаторных бумажек для обнаружения индола: 3—5 г парадиметиламино-бензальдегида, 10 см 3 концентрированной фосфорной кислоты и 50 см 3 этилового спирта тщательно перемешивают в фарфоровой ступке. В полученном растворе смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают узкими полосками шириной около 1 см. Цвет полученных бумажек — желтый. Индикаторные бумажки хранят не более 1 мес в темном месте.
6.1.5 Раствор гидроокиси калия массовой концентрации 400 г/дм 3 : 40 г гидроокиси калия переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 и растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.
6.1.6 Реактивы и растворы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.
6.2.1 Бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью готовят по ГОСТ 30518.
6.2.2 Бульон Мак-Конки готовят по ГОСТ 30518.
6.2.3 Бульон глюкозо-фосфатный, сухой промышленного производства.
6.2.4 Бульон мясо-пептонный с триптофаном: 0,05 г L-триптофана растворяют в 100 см 3 мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6—7 см 3 и стерилизуют при температуре (121+1) °С в течение 20 мин.
6.2.5 Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1.
6.2.6 Среду Кесслер готовят по ГОСТ 30518.
6.2.7 Среда Кларка: в 1 дм 3 дистиллированной воды при нагревании растворяют 5,0 г пептона,
5,0 г глюкозы, 5,0 г фосфорнокислого двузамещенного калия, охлаждают до 45—55 °С и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,2+0,1). Среду разливают по 5—6 см 3 в пробирки и стерилизуют при температуре (121+1) °С в течение 15 мин или дробным методом — текучим паром по 30 мин три дня подряд.
6.2.8 Среда (типа Кл игл ера) для первичной дифференциации энтеробактерий, сухая промышленного производства.
6.2.9 Среда Козера: в 1 дм 3 дистиллированной воды при нагревании растворяют 1,5 г фосфорнокислого двузамещенного натрия-аммония, 1,0 г фосфорнокислого однозамещенного калия, 0,2 г сернокислого магния и 2,5 г лимоннокислого натрия, охлаждают до 45—55 °С и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,2+0,1) при 25 °С. Среду стерилизуют при температуре (121+1) °С в течение 15 мин.
После стерилизации к 1 дм 3 среды добавляют 10 см 3 спиртового раствора бромтимолового синего массовой концентрации 5 г/дм 3 , затем среду разливают по 6—7 см 3 в стерильные пробирки. Приготовленная среда имеет оливково-зеленый цвет.
6.2.10 Среда Симмонса: к среде Козера перед стерилизацией добавляют 18—20 г агара. Среду после стерилизации и добавления раствора бромтимолового синего разливают по 6—7 см 3 в стерильные пробирки или в чашки Петри. Среду в пробирках скашивают.
Цитратный агар Симмонса выпускается промышленностью в сухом виде.
6.2.11 Среды с углеводами (среды Гисса) готовят по ГОСТ 10444.1 или используют для приготовления сухие среды промышленного производства.
Допускается сухую среду Гисса с углеводами готовить на основе сухого питательного агара: к 7,3 г сухого питательного агара прибавляют 3,65 г соответствующего углевода (глюкозы, лактозы, целлобиозы или сорбита), 0,38 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 3,65 г натрия хлористого, 0,02 г бромкрезолового пурпурового. Смесь тщательно перемешивают в фарфоровой ступке и хранят герметично закрытой в темном месте. Полученные 15 г порошка рассчитаны на приготовление 1 дм 3 среды. При приготовлении среды порошок тщательно размешивают в дистиллированной воде, кипятят 1—2 мин, не допуская пригорания, фильтруют, разливают по 5—6 см 3 в пробирки и стерилизуют при температуре (110+1) °С в течение 20 мин или дробным методом — текучим паром по 30 мин три дня подряд. Приготовленная среда имеет фиолетовый цвет.
6.2.12 Среда Эндо, сухая промышленного производства.
6.2.13 Трехсахарный агар готовят по ГОСТ 30519.
6.2.14 Среды из сухих препаратов промышленного производства готовят по прописям, указанным на этикетках.
6.2.15 Тест-системы для биохимической идентификации промышленного производства.
7.1 Посевы для определения количества E.coli в 1 г (см 3 ) продукта и выявления E.coli в определенной навеске продукта проводят по ЕОСТ 30518.
Посевы на агаризованной и жидких средах инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 24—48 ч. Чашки Петри инкубируют дном вверх. Посевы просматривают через (24+3) ч, отмечают положительные посевы в жидких средах, а окончательный учет проводят через (48+3) ч.
Положительными считают посевы в жидкие среды, в которых имеет место рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды, образовании газа, подкислении среды (то есть изменении цвета среды).
7.2 Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших в жидких средах, к E.coli делают пересевы по ГОСТ 26670 на поверхность среды Эндо, приготовленной по 6.2.12.
Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение (24+3) ч.
7.3 Посевы на агаризованной среде по 7.1 и 7.2 просматривают после инкубирования и отмечают рост характерных для E.coli колоний.
На среде Эндо E.coli образуют колонии от бледно-розового до темно-красного цвета часто с металлическим блеском.
Для дальнейшего подтверждения принадлежности выросших колоний к E.coli отбирают по три колонии каждого типа.
Из отобранных колоний приготавливают мазки, окрашивают их по Ераму по ЕОСТ 30425. Параллельно в каждой отобранной колонии у бактерий по ЕОСТ 29184 определяют отсутствие оксидазы.
Оксидазоотрицательные бактерии пересевают на поверхность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара. Посевы инкубируют до появления видимого роста при температуре (36+1) °С.
7.4 У оксидазоотрицательных грамотрицательных культур (палочки размером 1, Н1,5 х 2^6 мкм), выросших в пересевах по 7.3, определяют возможность образования индола, ацетоина, сероводорода, утилизации цитрата, интенсивность ферментации углеводов с образованием кислоты, ферментацию сорбита, глюкозы и лактозы.
7.4.1 Определение образования индола
Культуру высевают в пробирку с бульоном Хоттингера, приготовленным по 6.2.5, или мясо-пептонным бульоном с триптофаном, приготовленным по 6.2.4. Под пробку в пробирку помещают полоску индикаторной бумажки, приготовленной по 6.1.4. Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 24 ч. Если за время инкубирования посевов в среде накапливается индол, то желтый цвет индикаторной бумажки меняется на цвет от сиренево-розового до интенсивного малинового.
Образование индола можно определить с помощью реактивов Эрлиха и Ковача, приготовленных по 6.1.2. Для этого к 5 см 3 24-часовой культуры добавляют 1 см 3 одного из реактивов. Образование красного слоя на поверхности культуральной жидкости указывает на положительную реакцию.
Е.соИ образует индол.
7.4.2 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауэра)
Культуру высевают в пробирки со средой Кларка, приготовленной по 6.2.7. Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 48 ч.
После инкубирования посевов к 1 см 3 отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см 3 раствора а-нафтола, приготовленного по 6.1.3, и 0,2 см 3 раствора гидроокиси калия, приготовленного по 6.1.5. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Появление розового окрашивания через 15—60 мин указывает на положительную реакцию.
Е.соИ не образует ацетоин.
7.4.3 Определение утилизации цитрата
Культуру высевают в пробирки со средой Козера, приготовленной по 6.2.9, или на поверхность среды Симмонса, приготовленной по 6.2.10. Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 24—48 ч. Изменение оливково-зеленого цвета сред на васильковый, синий указывает на положительную реакцию.
Е.соИ не утилизирует цитрат.
7.4.4 Определение интенсивности ферментации углеводов с образованием кислоты (реакция с метил-рот)
Культуру высевают в пробирки с глюкозо-фосфатным бульоном или средой Кларка или используют посевы после отбора 1 см 3 культуральной жидкости по 7.4.2. Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 48 ч. К 5 см 3 культуральной жидкости прибавляют 5—10 капель реактива Кларка, приготовленного по 6.1.1. Появление через 1 мин красного цвета культуральной жидкости указывает на ферментацию углеводов до pH ниже 5,0.
Е.соИ интенсивно ферментирует углеводы (реакция с метил-рот положительная).
7.4.5 Определение ферментации сорбита, глюкозы и лактозы
Культуру высевают в среды Еисса с сорбитом или глюкозой, или лактозой приготовленные по 6.2.11. Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 24 ч, а на среде Еисса с лактозой при температуре (44+1) °С в течение 24 ч.
E.coli ферментирует глюкозу, лактозу и сорбит.
При ферментации глюкозы образуется газ. Ферментацию глюкозы можно учитывать в засеянных косяках трехсахарного агара или среды Кл игл ера по изменению цвета столбика среды и образованию в нем газа.
Ферментацию лактозы учитывают по изменению цвета скошенной поверхности среды Кл игл ера.
Ферментацию сорбита учитывают по изменению цвета среды.
У культур типичных для E.coli по всем изученным признакам, но не ферментирующим сорбит, изучают возможность ферментации целлобиозы на среде, приготовленной по 6.2.11, при температуре (36+1) °С в течение 24 ч. E.coli не ферментирует целлобиозу, цвет среды не меняется.
7.4.6 Определение образования сероводорода
Образование сероводорода учитывают в посевах на среду Кл игл ера или трехсахарный агар после инкубирования посевов при температуре (36+1) °С в течение 24 ч. Почернение в столбике среды указывает на образование сероводорода.
E.coli не образует сероводород.
7.4.7 Для биохимической идентификации выявленных бактерий допускается использование тест-систем промышленного производства.
8.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
8.2 К бактериям E.coli относят оксидазоотрицательные не образующие спор грамотрицательные палочки, обладающие способностью ферментации лактозы при температуре (44+1) °С, ферментирующие глюкозу и сорбит, дающие положительную реакцию с метил-рот, образующие индол, необразующие ацетоин и не утилизирующие цитрат. Бактерии не ферментирующие сорбит и целлобиозу, но по другим биохимическим признакам давшие типичные для E.coli реакции, относят к сорбитотрицатель-ным штаммам E.coli. Основные дифференцирующие признаки видов рода Escherichia приведены в приложении А.
8.3 Посевы навески продукта в жидкие среды считают положительными, если при последующем пересеве и подтверждении характерных колоний хотя бы в одной колонии будут обнаружены Е.соИ.
8.4 НВЧ E.coli в 1 г (см 3 ) продукта определяют по количеству положительных колб (пробирок) по ЕОСТ 26670.
8.6 Результаты определения количества Е.соИ и выявления их в определенной навеске продукта записывают по ЕОСТ 26670.
Основные дифференцирующие признаки видов рода Escherichia
Читайте также: