В эксперименте кишечную палочку выращивали

Расшифровка строения ДНК – результат многолетнего труда различных ученых – физиков, химиков и биологов. Начало было положено медиком и химиком русского происхождения Ф. Левиным. В двадцатых годах XX века он установил, что нуклеиновые кислоты – полимеры, образованные из мономеров нуклеотидов, в состав которых входят пуриновые основания – аденин и гуанин, и пиримидиновые – тимин, цитозин и урацил. В эксперименте, проведенном совместно с русским физиологом Е. С. Лондоном, Левину удалось выделить ДНК. Через двадцать лет американский биохимик Эрвин Чаргафф показал, что количество оснований А и Т соответствует количеству Ц и Г. В 1953 г. американский химик Лайнус Полинг опубликовал статью, в которой теоретически доказывал, что минимум энергии в глобулярных белках достигается при конфигурации молекулы, свернутой в спираль. Ошибка Полинга заключалась в том, что он предположил спираль трехцепочной. Подтверждение спиральной модели строения ДНК было получено рентгенологами Морисом Уилкинсом и Розалиндой Франклин.

Для расшифровки результатов рассеяния рентгеновских лучей понадобилось разработать новые методы анализа, т. к. впервые изучалось рассеяние на спиралевидных структурах. Результаты экспериментов подтвердили предположения Полинга и позволили рассчитать шаг спирали. На основании этих работ в 1953 г. Джеймс Уотсон и Френсис Крик предложили модель двойной спирали молекулы ДНК.

К этому времени было доказано, что важнейшими функциями ДНК является хранение и передача наследственной информации от родителей к потомкам. Передача наследственной информации происходит в результате:

репликации родительской ДНК,
транскрипции генетической информации на матрицу РНК,
трансляции информации с РНК в белковую форму.

Было известно, что цепочки ДНК состоят из четырех оснований, обозначаемых А, Т, Ц, Г. Причем шариковые модели демонстрировали, что по чисто геометрическим причинам на противоположных цепочках друг напротив друга могут располагаться только пары Уотсон и Крик считали, что две цепочки ДНК достраиваются автоматически, т. к. одной цепочки достаточно для построения другой. Стоял вопрос о том, как происходит удвоение ДНК: делится ли исходная молекула на фрагменты, если делится, то на какие, и как из этих фрагментов получается новая молекула. Рассматривались три гипотезы.

Консервативная репликация.
Молекула ДНК служит матрицей для образования совершенно новой молекулы ДНК. В результате одна из образующихся клеток получает исходную молекулу ДНК, а другая – вновь синтезированную.
Полуконсервативная репликация.
Две цепи исходной молекулы ДНК расходятся вследствие разрыва слабых водородных связей между азотистыми основаниями. Каждая из них служит матрицей для образования новой цепи, а возникающие между азотистыми основаниями водородные связи соединяют старую и новую цепи, восстанавливая целостность молекулы. В результате каждая новая клетка получает гибридную молекулу ДНК, состоящую из одной старой и одной новой цепи.
Дисперсная репликация.
ДНК распадается на короткие фрагменты, используемые в качестве матриц для построения фрагментов двух новых молекул ДНК, которые затем образом соединяются между собой.

В 1957 г. Метью Мезелсон и Франклин Сталь поставили один из самых красивых биологических экспериментов, исследуя механизмы репликации ДНК. Для определения способа репликации ДНК необходимо четко различать материнские и дочерние молекулы. Мезелсон и Сталь выращивали бактерии кишечной палочки () на среде, содержащей в качестве источника азота его тяжелый изотоп – 15 N. Молекула ДНК содержит большое количество атомов азота, при делении ДНК азот для новых цепочек берется из внешней среды. Тяжелый изотоп азота включался в состав молекулы ДНК и служил надежной меткой. Для того чтобы пометить практически всю бактериальную ДНК, необходимо было культивировать на такой среде в течение как минимум 12 поколений.

Мезелсон и Сталь длительное время культивировали на среде с 15 N. После этого бактерии быстро переносили на среду, содержащую более легкий изотоп азота 14 N. Благодаря тому, что клетки культивировались на двух различных средах, в состав молекул их ДНК входили оба изотопа азота: 14 N и 15 N. Отличить такие молекулы друг от друга можно было по плотности, поскольку масса нуклеотидов молекулы ДНК, содержащих 15 N больше, по сравнению с обычной молекулой. ДНК бактериальных клеток, выращенных на среде с 15 N, имела плотность 1,724 г/см 3 , а ДНК клеток, выращенных на среде с 14 N – 1,710 г/см 3 .

После переноса культуры с одной среды на другую через каждое поколение Мезелсон и Сталь отбирали пробы. Контролем служила бактериальная культура, содержавшаяся на среде с 15 N. Из каждой пробы бактериальных клеток путем центрифугирования извлекали ДНК. После этого ее смешивали с раствором хлористого цезия (CsCl) плотностью 1,7 г/см 3 , и вновь центрифугировали с очень высокой скоростью в течение нескольких дней. В результате осаждения молекул CsCl его раствор приобретал градиент плотности от 1,65 г/см 3 в верхней части пробирки до 1,8 г/см 3 у ее дна. В соответствии с этим, молекулы ДНК концентрировались в строго определенной области: у дна, в центре или в верхней части пробирки. Локализация ДНК устанавливалась на спектрофотометре, поскольку было известно, что она поглощает лучи с длиной волны 260 нм. Этот метод Мезелсон и Сталь разработали и опубликовали совместно с Джермом Виноградом в 1957 г., непосредственно перед проведением эксперимента по репликации ДНК.

Определяя плотность ДНК в каждой из проб, Мезелсон и Сталь обнаружили, что спустя одно поколение после переноса культуры со среды с 15 N на среду с 14 N плотность ДНК была промежуточной между и Спустя два поколения половина бактериальных клеток содержала ДНК с легким изотопом азота ( 14 N), а другая половина – такую же, как и в предыдущем поколении, ДНК промежуточной плотности. Через три поколения на среде с 14 N в ¾ клеток содержалась легкая ДНК, а ¼ часть клеток сохраняла ДНК промежуточной плотности. Т. о., соотношение между числом генераций и распределением плотности ДНК точно соответствовало полуконсервативному типу репликации.

Вместе с тем, из гипотезы полуконсервативной репликации следовало, что ДНК с промежуточной плотностью между и должна быть гибридной. Это значит, что одна из ее цепей должна содержать только тяжелый изотоп азота ( 15 N), а другая – только легкий ( 14 N). Проверяя это предположение, Мезелсон и Сталь нагревали полученную ими ДНК промежуточной плотности в течение 30 минут при температуре 100 °С на водяной бане. При таких условиях двойная спираль молекулы ДНК денатурирует, образуя две отдельных цепочки, однако ковалентные связи между нуклеотидами в каждой из них не разрушаются. Проведя центрифугирование денатурировавшей ДНК в градиенте плотности хлористого цезия, Мезелсон и Сталь обнаружили, что в результате образовалось две фракции различной плотности. Плотность одной из них совпадала с плотностью молекул ДНК, содержащих тяжелый изотоп азота ( 15 N), тогда как плотность другой была идентична плотности молекул ДНК с легким изотопом азота ( 14 N). Из этого следовало, что молекула ДНК промежуточной плотности, образовавшаяся в первом поколении после переноса со среды с тяжелым изотопом азота на среду с легким изотопом, представляет собой гибридную молекулу. В ее состав входят две цепи – материнская, содержащая исключительно 15 N и вновь синтезированная дочерняя, содержащая только 14 N. Эти данные также подтвердили верность модели и полуконсервативный характер репликации ДНК.

Результаты своего эксперимента Мезелсон и Сталь опубликовали годом позже. В дальнейшем, было проделано множество экспериментов по репликации ДНК различных организмов – от прокариот до эукариот. Во всех случаях репликация ДНК шла исключительно по полуконсервативному типу. Это позволило подтвердить справедливость модели молекулы ДНК на которой базируется вся современная генетика.

Как самый долгий биологический эксперимент породил новое существо

Долговременный эксперимент по эволюции E.coli — попытка ученых в экспериментальных условиях наблюдать эволюционные процессы. Может возникнуть вопрос, почему для этих нужд ученые использовали именно кишечную палочку, а не собаку или лошадь? Одна из причин в том, что E.coli очень быстро размножается. Другая особенность, делающая бактерию удобной для исследований, — небольшой размер генома, который позволяет достаточно быстро определить, какие мутации возникают в генах со сменой поколений. Кроме того, E.coli можно без вреда для нее заморозить на длительное время.

Материалы по теме

Долговременный эксперимент по эволюции E.coli оказался удобной платформой для того, чтобы решить данную проблему. Ученые под руководством Ричарда Ленски проанализировали полные геномы 264 клонов из 12 популяций, в которых, в конечном итоге, сменилось 50 тысяч поколений. Предварительные результаты продемонстрировали, что приспособленность микроорганизмов, которая определяется как скорость роста популяции, увеличилась на 70 процентов по сравнению с той, что была у предкового штамма.

Молекулярные биологи расшифровали геномы кишечных палочек, принадлежащих поколениям 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10 000, 15 000, 20 000, 30 000, 40 000, 50 000, с помощью метода секвенирования нового поколения. Всего было найдено более 14 тысяч мутаций, которые привели к потере 1,4 процента общего генома. При этом на половину популяций (Ara−1, Ara−2, Ara−3, Ara−4, Ara+3 и Ara+6) приходилось 96,5 процента точечных мутаций (мутаций, затрагивающих один нуклеотид). Это объясняется тем, что некоторые изменения в генах привели к нарушению процессов восстановления поврежденной ДНК, в результате чего скорость мутирования у этих штаммов значительно повысилась. Склонность к мутациям также придавали IS-элементы (Insertion Sequence) — короткие фрагменты ДНК, которые способны перемещаться и размножаться внутри генома, не выполняя никакую полезную функцию. Например, в популяции Ara+1 31,8 процента мутаций представляли собой вставки IS-элементов, а у популяции Ara−5 (поколение 30 000) доля этого же типа мутации достигала 38,7 процента.

Ученые отмечают, что склонность к генетическим изменениям лишь незначительно повышала приспособляемость организма, поскольку в то же время увеличивалось число не только полезных, но и вредных мутаций. В гипермутированных E.coli отличить полезные генетические изменения от моря остальных мутаций (нейтральных и негативных) становится очень затруднительно. Поэтому исследователи обратили свое внимание на популяции, где скорость генетических изменений осталась на предковом уровне. На основе данных они построили модель зависимости между временем и числом полезных мутаций, которая позволяла точно предсказать уровень приспособленности у микроорганизмов из поколения 50 000. Чтобы снизить влияние статистической неопределенности, биологи обратились к дополнительным доказательствам.

Во-первых, так как нейтральные мутации не оказывают никакого влияния на приспособляемость, на них не действует естественный отбор, поэтому скорость их накопления должна быть сравнима с общей частотой мутаций. К таким генетическим изменениям, в частности, относят синонимичные замены, при которых изменение одного нуклеотида в гене на другой не приводит к замене аминокислоты в белке. Ученые рассчитали, во сколько раз несинонимичные мутации накапливаются быстрее, чем синонимичные. Результаты показали, что после 500-го поколения скорость была больше в 17,1 раза, а после 50 000-го — в 3,4 раза. Это говорит о том, что большинство несинонимичных мутаций были полезными и повышали приспособляемость организмов.

Исследователи также выяснили, что большинство мутаций, произошедших в ранних поколениях, были драйверными и оказывались полезными для кишечной палочки. С течением времени их доля снижалась, однако они не пропадали полностью.

Авторы статьи подчеркивают, что штаммы E. coli, участвующие в долговременном эксперименте, могут отличаться от многих природных популяций в важных аспектах, включая низкую частоту мутаций, отсутствие полового размножения и стабильные условия окружающей среды. Эффекты, которые могут накладывать неучтенные факторы на скорость накопления различных видов мутаций, должны быть учтены в будущих экспериментах.

03 февраля 2020

Герой февраля: кишечная палочка Escherichia coli

Скромная бактерия за полстолетия с момента ее открытия в конце XIX в. стала настоящей волшебной палочкой для молекулярной биологии. Сейчас результаты опытов с ее использованием занимают главы и тома профессиональных и популярных изданий. Конечно, в нашем путеводителе по модельным организмам E. coli должна была занять свое почетное место.

Двенадцать модельных организмов

Escherichia и Eschrichtius — Болезнь путешественников — Главная модельная бактерия — Учебник молекулярной генетики — Невезение с CRISPR/Cas

Рисунок 1а. Escherichia длиной 2 мкм

Рисунок 1б. Теодор Эшерих (1857–1911)

Рисунок 1в. Eschrichtius длиной 14 метров

Рисунок 1г. Даниэль Фредрик Эшрихт (1798–1863)

Клетки с относительно тонкой клеточной стенкой, не окрашивающиеся красителем генцианом фиолетовым (окраской бактерий по методу датского микробиолога Кристиана Грама).

Зачем же такую опасную бактерию сделали модельной? Дело в том, что в условиях культивирования кишечная палочка часто теряет патогенность, становится неспособной жить в естественных для себя условиях (то есть одомашнивается). И этим свойством в 1940-е годы воспользовались микробиологи, проведя с лабораторными штаммами E. coli (например, со знаменитым штаммом К12) много прорывных для науки экспериментов.

Так, манипулируя мутированными штаммами кишечной палочки, которые уже научились получать при помощи облучения, Джошуа Ледерберг и Эдуард Лаури Тейтем в 1947 году обнаружили способность разных штаммов обмениваться генетическим материалом и спасать друг друга от образовавшихся дефектов, проявлявшихся в неспособности расти на минимальной питательной среде. Так был открыт процесс конъюгации бактерий, который затем послужил важным инструментом для картирования бактериального генома . Ведь тогда это можно было делать только косвенными, микробиологическими методами — сама природа генетического кода была неизвестна.

Кстати, Джошуа Ледерберг был некоторое время мужем Эстер Ледерберг, первооткрывательницы бактериофага лямбда [3].

С начала 1950-х годов исследования по молекулярной генетике с использованием кишечной палочки и ее вирусов в качестве основного инструмента росли как снежный ком. Не будет преувеличением сказать, что к 70-м годам E. coli написала учебник молекулярной генетики! Вспомним открытие генетического кода, в котором участвовало несколько коллективов физиков и молекулярных биологов, в том числе Френсис Крик, Георгий Гамов и другие выдающиеся люди того времени [6]. Основные эксперименты по расшифровке кода велись на бесклеточных лизатах кишечной палочки.

Позднее обнаружилось, что E. coli хорошо подходит для зародившейся в 1960–1970-е годы биотехнологии [7]. Бактерия хорошо переносит введение в свою клетку гетерологичных (то есть чужеродных) генов и во многих случаях способна синтезировать их продукты без вреда для себя. Белки, полученные таким способом, стали называть рекомбинантными, и теперь они широко используются в медицине и других практических задачах.

Кишечная палочка — возможно, самый исследованный организм с точки зрения молекулярной биологии. Тем не менее у элементов ее генома до сих пор обнаруживают новые свойства. Это одновременно плохо (как же мало мы знаем!) и хорошо (будет чем заняться!). Совсем недавно на защите диссертации я услышал о том, как у одной из генных кассет эшерихии, участвующей в каскаде переработки сульфолипидов, также обнаружена и лактазная активность [8]. До этого такая активность была известна только у знаменитого лактозного оперона Жакоба и Моно, описанного в 1961 году!

Кажется, что E. coli — модельный организм без недостатков. Тем не менее биотехнологам не повезло, что у этой бактерии от природы нет системы бактериального иммунитета CRISPR/Cas [9], о которой я уже упоминал в эссе о бактериофаге лямбда [3]. Именно поэтому эту систему, ныне незаменимую в генной инженерии, открыли относительно поздно.

Кишечная палочка-выручалочка — это здорово (рис. 2). Но теперь пора переместиться в мир ядерных организмов. Удобным инструментом для молекулярной биологии и генетики эукариот оказались одноклеточные грибы — дрожжи — и гаплоидный плесневый гриб — нейроспора. Как они дошли до такой одноклеточной и гаплоидной жизни и что было открыто с их помощью — читайте в следующем материале нашего путеводителя по модельным организмам через месяц.

Благодарность

Что за сообщество такое, просветите :)

Ученые подвели первые итоги самого продолжительного в истории научного эксперимента

Группа учены из Великобритании (Шотландия), Германии и США подвела первые результаты самого долгосрочного научного эксперимента в истории. Цель эксперимента состоит в изучении жизнеспособности микробов в изоляции за 500-летний период. Окончательно итоги будут подведены аж в 2514 году, а сейчас микробиологи представили результаты первых пяти лет исследования – это около 1 процента от общей протяженности эксперимента, говорится в статье, опубликованной в журнале PLOS ONE.

Объектом исследования является сенная палочка (Bacillus subtilis), открытая в 1835 году и являющаяся одним из наиболее изученных представителей рода бацилл. По словам ученых, бактериальные споры представляют собой невероятно устойчивые формы жизни. В ответ на экстремальные условия они способны перестраивать свою ДНК, чтобы адаптироваться под них.

Самый продолжительный эксперимент в истории науки должен ответить сразу на несколько вопросов, которые в конечном итоге позволят лучше разобраться в том, как развивалась жизнь на нашей планете более 3,5 миллиарда лет назад и возможно ли существование жизни на других планетах с другими условиями окружающей среды.

В частности, ученых интересует как долго жизнеспособность сохраняется при отсутствии влаги и воздуха, как быстро бактерии возродятся, вернувшись к привычной среде, какова скорость гибели спор и когда это происходит?

При подготовке эксперимента высушенные бактерии сенной палочки поместили в сотни герметично запечатанных колб. Колбы поместили в два ящика – один находится в Эдинбургском университете, другой – в лондонском Музее естествознания. Еще несколько образцов подвергаются воздействию очень низких температур и радиации. В течение первых 24 лет с начала эксперимента каждые 2 года ученые будут открывать по несколько колб и проверять состояние бактерий. После этого проверка образцов будет проводиться 1 раз в 25 лет.

В первых подведенных результатах ученые отмечают, что полная изоляция пока никак не повлияла на состояние сенной палочки. Образцы оказались такими же жизнеспособными, как и на начало эксперимента. Часть образцов Bacillus subtilis, подвергавшихся воздействию низкой температуры (-80 градусов Цельсия) и радиации погибли, однако у выживших ученые не обнаружили изменений в ДНК – она не отличается от образцов бактерий, которые находятся в герметичных колбах.

Исследователи прекрасно понимают, что окончательные результаты эксперимента смогут подвести лишь потомки спустя множество поколений, поэтому все результаты первых лет наблюдений тщательно конспектируются как на цифровых носителях, так и на бумаге с учетом всех установленных правил, которые также будут копироваться каждые 25 лет и впоследствии передаваться будущим поколениям.

В ходе эволюционного эксперимента патогенный гриб превратился в полезного симбионта

Эволюционные эксперименты, проведенные сингапурскими биологами, показали, что потенциально патогенный гриб Candida albicans всего за несколько недель жизни в кишечнике мыши может превратиться в полезного симбионта, защищающего хозяина от грибных и бактериальных инфекций посредством активации систем врожденного иммунитета. Эта эволюционная трансформация происходит при условии, что бактерии в мышином кишечнике были предварительно уничтожены антибиотиками. В отсутствие конкуренции со стороны бактерий отбор поддерживает мутации, лишающие гриб способности образовывать гифы и попутно придающие ему свойства, потенциально полезные для хозяина. При наличии в кишечнике нормальной бактериальной микрофлоры те же самые мутации делают гриб неконкурентоспособным. Поэтому если не кормить мышь антибиотиками, то гриб, в зависимости от возраста мыши, либо вообще не выживает в ее кишечнике, либо выживает, но не эволюционирует в полезного симбионта.

Взаимоотношения между животными и обитающими в их кишечнике микроорганизмами варьируют от антагонистических до мутуалистических (взаимовыгодных). Понимание причин, от которых зависит, будут ли наши микробы враждовать с нами или дружить, важно для развития медицины. Однако о факторах, которые направляют эволюцию кишечных микробов в сторону взаимовыгодного сотрудничества с хозяином, до сих пор известно немного.

Гриб Candida albicans часто встречается у людей в пищеварительном тракте и половых путях. Обычно он ведет себя как мирный комменсал, но иногда вызывает серьезные заболевания (см. Candidiasis). Изучение взаимоотношений C. albicans c хозяином затрудняется тем, что привычные лабораторные животные, такие как мыши, не являются естественными хозяевами этого гриба. В кишечнике взрослой мыши C. albicans не выживает, по-видимому, не выдерживая конкуренции с обычными кишечными микробами. Однако ученые всё-таки нашли два способа поселить C. albicans в мышином кишечнике. Во-первых, можно накормить мышь антибиотиками, чтобы убить бактериальную микрофлору. После этого C. albicans успешно колонизирует пищеварительный тракт мыши. Во-вторых, можно заразить грибом юного мышонка, у которого нормальная микрофлора еще не сформировалась. В этом случае можно обойтись без антибиотиков. Кроме того, можно ввести клетки C. albicans в кровь, но это плохо заканчивается для мыши: гриб разрастается в почках и других органах, и животное погибает.

Микробиологи и иммунологи из Сингапура решили выяснить, как гриб C. albicans адаптируется к новой для него среде обитания — кишечнику мышей, лишенных бактериальной микрофлоры.

Для начала мышам, регулярно получающим антибиотики, скормили по порции C. albicans. Заражение прошло успешно: гриб прижился в кишечнике подопытных животных. После этого каждую неделю гриб пересаживали в следующего хозяина — другую мышь, сидящую на антибиотиках, — скармливая ему фекалии предыдущего.

За ростом приспособленности гриба к новым условиям следили, оценивая скорость его размножения в кишечнике безбактериальных мышей по сравнению с исходным штаммом. Уже через 10 недель (то есть после 10 пересаживаний из одной мыши в другую) приспособленность подопытных штаммов C. albicans увеличилась на 10–15%. Таким образом, грибы успешно адаптировались к новой среде. Теперь нужно было выяснить, как им это удалось и почему.

Сначала ученые проверили, играет ли какую-то роль в адаптации гриба к мышиному кишечнику взаимодействие с системой адаптивного (приобретенного) иммунитета хозяина. Для этого эксперимент повторили на мышах, которые не только сидели на антибиотиках, но еще и были лишены способности вырабатывать приобретенный иммунитет. У этих мышей не работает ген Rag1, необходимый для формирования функциональных B- и T-лимфоцитов. Результат воспроизвелся: приспособленность гриба за 10 недель выросла примерно так же, как и в случае с обычными безбактериальными мышами. Это значит, что для успешной адаптации гриба к жизни в мышином кишечнике не требуется взаимодействие с адаптивным иммунитетом хозяина.

Помешают ли бактерии, в норме обитающие в мышином кишечнике, успешной адаптации гриба? Заразить грибом взрослых мышей с нормальной кишечной микрофлорой (не принимающих антибиотики) авторам не удалось, как это никому не удавалось и раньше. По-видимому, сложившаяся бактериальная микрофлора не позволяет грибу размножаться в мышином кишечнике. Тогда исследователи перешли к экспериментам с двухнедельными мышатами, в чьем кишечнике C. albicans приживается даже без антибиотиков.

Оказалось, что если мышатам, зараженным грибом, не давать антибиотиков, то гриб в их кишечнике хотя и выживает, но не может так же хорошо адаптироваться к новой среде, как в случае с антибиотиками. После 5–10 недель жизни в мышатах, которых кормили антибиотиками, приспособленность C. albicans к новым условиям выросла почти так же сильно, как и после 10 недель жизни во взрослых безбактериальных мышах. Однако после тех же 5–10 недель жизни в мышатах, не получавших антибиотики, приспособленность гриба осталась на исходном уровне.

Эти и другие эксперименты показали, что в присутствии нормальных мышиных кишечных бактерий грибу не удается приобрести какие-то свойства, которые повышают его конкурентоспособность в кишечнике безмикробных мышей.

Что же это за свойства? Оказалось, что все штаммы C. albicans, чья приспособленность к жизни в мышином кишечнике увеличилась в ходе проведенных экспериментов (и во взрослых безбактериальных мышах, и в мышатах, и в мышах без адаптивного иммунитета) утратили способность к формированию многоклеточных нитей — гиф. Эти штаммы могут существовать только в дрожжевой форме, то есть как отдельные клетки (рис. 1). По-видимому, умение образовывать гифы помогает грибу выживать в присутствии кишечных бактерий, но замедляет размножение в кишечнике безмикробной мыши.

Чтобы понять генетические основы произошедших изменений, авторы отсеквенировали геномы 28 штаммов C. albicans, успешно адаптировавшихся к жизни в кишечнике безмикробных мышей, и сравнили их с геномом исходного штамма.

Оказалось, что у всех адаптированных штаммов закрепились значимые (несинонимичные, меняющие кодируемый белок) мутации хотя бы в одном из 34 белок-кодирующих генов, функции которых связаны с гифообразованием, построением клеточной стенки и регуляцией транскрипции (рис. 2).

Рис. 2. Мутации, закрепившиеся у 28 штаммов C. albicans, адаптировавшихся к жизни в мышином кишечнике. По горизонтальной оси — штаммы гриба, по вертикальной — 34 гена, в которых хотя бы у одного штамма закрепилась несинонимичная мутация. Красным цветом показаны мутации, находящиеся в отсеквенированных геномах в гомозиготном состоянии, синим — в гетерозиготном. Видно, что чаще всего отбор поддерживал мутации гена FLO8, который кодирует регулятор транскрипции (Transcription factor), влияющий на формирование гиф (Filamentation). Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Чаще всего (у 22 штаммов из 28) закреплялись мутации, выводящие из строя ген FLO8. Этот ген кодирует транскрипционный фактор, регулирующий гифообразование. Все закрепившиеся в нем мутации делают кодируемый белок нефункциональным (посредством появления преждевременного стоп-кодона или сдвига рамки считывания). Дополнительные эксперименты подтвердили, что грибы с инактивированным геном FLO8, во-первых, не образуют гиф, во-вторых, обладают повышенной конкурентоспособностью в кишечнике безбактериальных мышей.

Таким образом, ход адаптации C. albicans к жизни в кишечнике безбактериальных мышей оказался предсказуемым и воспроизводимым: всегда утрачивается способность к гифообразованию, причем чаще всего это происходит за счет мутаций, выводящих из строя ген FLO8.

Ранее было показано, что и гифообразование, и FLO8 влияют на вирулентность C. albicans, определяя способность гриба вызывать системную инфекцию при попадании в кровь (F. Cao et al., 2006. The Flo8 Transcription Factor Is Essential for Hyphal Development and Virulence in Candida albicans). Поэтому авторы предположили, что штаммы, приспособившиеся к жизни в мышином кишечнике, могли при этом стать менее вредоносными.

Эксперименты по совместному культивированию C. albicans с клетками млекопитающих (мышиными макрофагами и человеческими клетками эпителия толстой кишки) подтвердили, что штаммы C. albicans, приспособившиеся к жизни в кишечнике безбактериальных мышей, не так сильно повреждают клетки, как исходный штамм. Введение исходного штамма в кровь приводит к разрастанию грибных гиф в почках уже через двое суток, а через 3–4 дня все мыши погибают. Инъекцию такого же количества клеток C. albicans, адаптированных к безбактериальному мышиному кишечнику, мыши благополучно переживают. При этом гриб обнаруживается в тканях только в дрожжевой форме. Штаммы, эволюционировавшие в кишечнике мышат, не получавших антибиотики, не только не разучились образовывать гифы, но и в полной мере сохранили свою смертоносность при попадании в кровь.

Таким образом, в ходе адаптации к жизни в кишечнике безбактериальных мышей гриб C. albicans действительно стал менее опасным для хозяина.

Авторы допускают, что на основе выведенных ими штаммов удастся в будущем разработать вакцины нового типа, которые будут защищать даже людей с нарушенной системой адаптивного иммунитета (больных СПИДом, людей после трансплантации и др.)

Возможно, новые открытия в этой области позволят нам в будущем эффективно управлять эволюцией наших микроскопических сожителей, превращая врагов в друзей и не позволяя мирным комменсалам становиться опасными патогенами.

Читайте также: