Блоттинг и ее техника. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Добавил пользователь Евгений Кузнецов
Обновлено: 14.12.2024

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.
Для корректной оценки результатов ваших анализов в динамике предпочтительно делать исследования в одной и той же лаборатории, так как в разных лабораториях для выполнения одноименных анализов могут применяться разные методы исследования и единицы измерения.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Исследование урогенитального тракта методом ПЦР на ИППП ;

Определение ДНК микроорганизмов, вызывающих наиболее распространенные инфекции передаваемые половым путем (ИППП) в вагинальных, цервикальных и уретральных сос.

тест методом ПЦР на коронавирус Covid-19, мазок из носа и зева на определение РНК вируса SARS-CoV-2;

Для проведения исследования в медицинских офисах необходимо предъявить СНИЛС и документ удостоверяющий личность. Запись на исследование В случае по.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Проведение ПЦР

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
термостабильная ДНК-полимераза;
дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.

Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 - 2 минут.

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.

Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию

Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.

РНК- рибонуклеиновая кислота - биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев - нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.

Нуклеоти́ды - основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию - адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) - гуанин, цитозиновый (C) - цитозин, тиминовый (Т) - тимин, урациловый (U) - урацил. В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов - A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа - A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК - рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.

Праймер - котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

Блоттинг и ее техника. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Бурное развитие молекулярно-генетической диагностики в течение последних десятилетий требует совершенствования имеющихся методов и разработки новых. Современная медицина использует достижения естественных наук, успешно применяя новые технологии диагностики заболеваний. Наряду с традиционными методами молекулярно-генетической диагностики, такими как кариотипирование, секвенирование, метод флуоресцентной диагностики и др., немаловажное место занимает метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на увеличении количества копий определенного фрагмента ДНК.Метод полимеразной цепной реакции, изобретенный во второй половине XX века, по сей день являетсяпопулярным и фундаментальным, т.к. отличается высокой точностью и чувствительностью, а также скоростью проведения, что является несомненным плюсом и основанием для повсеместного использования данного метода.Данная технология считается одной из самых передовых в области диагностики различных инфекций и заболеваний. Разработанный не так давно, метод ПЦР постоянно совершенствуется и обсуждается на страницах медицинских журналов. В статье приведены исторические предпосылки разработки метода ПЦР, методика проведения реакции, описаны ее различные способы проведения. Сделан вывод об актуальности данного метода, описаны примеры областей его использования.

2. Shehnam Shafique. Polymerase Chain Reaction. - N.Y.: LAP Lambert Academic Publishing. 2012. - P. 96.

3. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III—IV групп патогенности: Методические указания. - М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 19 с.

4. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности: Методические указания. - М.: Государственная система санитарно-эпидемиологического нормирования Российской Федерации, 2009.- 31 с.

5. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / пер. с англ.; под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. - М.: Мир, 1999. - 558 с.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе).

Многочисленные открытия в области молекулярной биологии и генетики способствовали открытию ПЦР.В 1869 г. И. Мишер выделил вещество из клеток гноя, которое содержало азот и фосфор. Изначально вещество назвали нуклеином, а когда были определены его кислотные свойства нуклеиновой кислотой.В 1944 г. были проведены эксперименты по трансформации бактерий учеными О. Эвери, К. Маклауда и М. Маккарти. В ходе этих экспериментов было доказано, что за трансформацией бактерий (приобретением болезнетворных свойств безвредной культурой в результате добавления в неё убитых кипячением болезнетворных бактерий) стоит выделенная из пневмококков ДНК.В 1952 г. учеными А. Херши и М. Чейзом был проведен эксперимент с помеченными радиоактивными изотопами ДНК и белками. В результате они выяснили, что в зараженную клетку передается только нуклеиновая кислота, а не белок, как считалось ранее.В 1949-1951 гг. были сформулированы «правила Чаргаффа». Группа биохимика Э. Чаргаффа установила количественное соотношение между различными типами азотистых оснований в составе нуклеотидов ДНК.

Правила Чаргаффа и данные рентгеноструктурного анализа Розалинд Франклин сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК. На основе этих данных в 1953 году Дж. Уотсоном и Ф. Криком был установлен принцип комплементарности. Ученые сделали вывод о том, что ДНК представляет собой двойную полипептидную цепь, образующую спираль благодаря водородным связям между азотистыми основаниями (аденин-тимин и гуанин-цитозин).В 1955 г. произошло открытие фермента ДНК-полимераза А. Корнбергом. Этот фермент способен удлинять полипептидную цепь присоединяя к 3’-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид. Для этого необходимо, чтобы праймер связался с цепью ДНК (матрицей) по принципу комплементарности. Чтобы реакция прошла раствор должен содержать нуклеозидтрифосфаты (дНТФ), которые используются в качестве «строительного материала». В 1971 г. Клеппе с соавторами определили состав реакционной смеси, и принципы использования ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК. Однако, из-за технологической сложности искусственного синтеза праймеров и нестабильности реакции, метод ПЦР было невозможно использовать на практике в полной мере.В 1975 г. Т. Брок и Х. Фриз открыли Thermusaquaticus (грамотрицательную палочковидную экстремально термофильную бактерию). А в 1976 г. была выделена Taq-полимераза - фермент, который способен работать при повышенных температурах (оптимум 72-80°C).В 1983-1984 гг. К. Мюллисом был проведен ряд экспериментов по разработке ПЦР. Ученый первый начал использовать вместо ДНК-полимеразы устойчивую к высоким температурам Taq-полимеразу, что позволило ускорить работу по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллисом в соавторстве с Ф. Фалуном был разработан алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР.

Открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Метод продолжает развиваться, появляются новые модификации, но мы предлагаем рассмотреть методику проведения классической ПЦР.

Методика полимеразной цепной реакции

Метод постановки ПЦР требует наличия в реакционной смеси ряда основных компонентов: праймеры, Taq-полимераза, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, буфер, анализируемый образец.

Праймеры - искусственно синтезируемые олигонуклеотиды, как правило, размером от 15 до 30 нуклеотидов, которые идентичны соответствующим участкам ДНК-мишени. Играют ключевую роль в амплификации, образуя продукты реакции.

Для полимеразной цепной реакции последовательности праймеров очень важны, потому что реакционный цикл имеет определенные величины температур, используемые на этапах нагрева и охлаждения.

Кроме того, большой избыток праймеров в реакционной смеси ПЦР приводит к тому, что они с большей вероятностью сталкиваются с частично комплементарным праймером, чем с полностью комплементарной ДНК матрицой. Таким образом, следует избегать комплементарностипраймеров друг другу.

Taq-полимераза - термостабильный фермент, который обеспечивает достраивание З’-конца второй цепи ДНК по принцип комплементарности. Этот фермент довольно часто используется при проведении стандартной ПЦР.

Taq ДНК полимераза имеет оптимальную температуру репликации - 75-80°C и выдерживает длительное воздействие температур до 96°C. Таким образом, она может оставаться активной после каждого из шагов денатурации.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - «строительный материал», который используется Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК. Включает в себя дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ).

Для оптимального включения оснований в синтезируемую цепь ДНК их обычно добавляют к реакционной смеси ПЦР в эквимолярных количествах. Как правило, конечная концентрация каждого дезоксинуклеозидтрифосфата составляет 0,2 мМ.

Буфер - смесь катионов и анионов используемая в определенной концентрации, обеспечивающая оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН. Значение рН буфера колеблется от 8,0 до 9,5 и стабилизируется Трис-HCl.

Одним из компонентов буфера Taq-полимеразы является ион калия (KCl), который способствует отжигу праймеров. Буферная концентрация ионов магния является еще одним важным фактором для правильного функционирования ДНК-полимеразы. Ионы магния служат кофактором для ДНК полимеразы.

Анализируемый образец - вносимый в реакционную смесь препарат, обычно содержащий искомую ДНК, служащую мишенью для амплификации. В случае отсутствия ДНК-мишени продукт не образуется.

Иногда для удобства детекции или контроля эффективности в состав реакционной смеси могут быть внесены дополнительные компоненты.

Внутренние контроли - несвойственный данному организму фрагмент ДНК, как правило, большего размера, ограниченный специфическими праймерами. Практически представляет собой альтернативную матрицу ПЦР и позволяет контролировать эффективность амплификации в каждой конкретной пробирке.

ДНК-зонды - искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера (около 30 нуклеотидов), комплементарные специфическим ампликонам (продуктам реакции). Могут использоваться для детекции продуктов ПЦР, благодаря прикрепленным к ним изотопным или флуоресцентным меткам.

Для улучшения результатов ПЦР используются различные ПЦР добавки. Эти компоненты способны понижать температуру денатурации матрицы или стабилизируют ДНК-полимеразу.

Обычно используемые ПЦР-добавки включают диметилсульфоксид (ДМСО), сульфат аммония, полиэтиленгликоль, бычий сывороточный альбумин (BSA), желатин, N-триметилглицин и глицерин.

Если в пробе имеется искомая ДНК, с ней происходит ряд последовательных цикличных реакций, которые различаются температурными режимами.

Амплификация может включать в себя множество циклов, но все они состоят из трёх этапов: денатурация, отжиг, элонгация [1].

Денатурация - процесс перехода двухнитевой формы ДНК в однонитевую из-за разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований при воздействии высоких температур.

Отжиг - процесс присоединения праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Отжиг происходит благодаря правилу комплементарностиЧаргаффа. Без соблюдения этих условий праймеры не отжигаются.

Элонгация (синтез). Taq-полимераза достраивает вторую цепь ДНК с 3’-концапраймера.

Температура в реакционной смеси доводится до оптимума работы Taq-полимеразы. Затем она максимально эффективно начинает синтезировать вторую цепь ДНК от 3’-конца праймера, который связан с матрицей, и продвигается в направлении от 3’ к 5’ концу.

Результатом ПЦР будет экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК, описываемое формулой

где А - количество специфических (ограниченных праймерами) продуктов реакции амплификации; М - начальное количество ДНК-мишеней; n - число циклов амплификации.

Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.

Помимо классического варианта ПЦР существует также множество других вариантов постановки ПЦР, которые направлены на решение многих задач: увеличение эффективности реакции и снижения риска образования неспецифических продуктов; реализацию возможности проведения качественного и количественного анализа искомых участков молекулы ДНК/РНК [2].

В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространенными модификациями ПЦР являются:

ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR) - суть этой модификации состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения условий, которые обеспечивают специфический отжиг праймеров.

В момент постановки ПЦР полимеразная активность фермента блокируется антителами или небольшими молекулами типа Affibody, имитирующими антитела, до наступления первой денатурации (при 95°C в течение 10 минут).

ПЦР с «горячим» стартом дает возможность минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа.

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR) - предназначен для амплификации, выделения или идентификации последовательности РНК. Сперва проводят синтез одноцепочечной молекулы ДНК (кДНК), с помощью ревертазы (обратной транскриптазы), используя для матрицы мРНК. Затем образовавшуюся кДНК используют для последующей ПЦР.

Возможность использовать РНК в качестве мишени для ПЦР расширяет спектр применения метода, например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирусы гриппа, ВИЧ и т.д.) представлены именно РНК.

ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» (End-point PCR) - эта модификация позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирку. Таким образом, решается проблема контаминации ампликонами. Однимизвариантовявляетсяметод «FLASH» (FLuorescentAmplification-basedSpecificHybridization - специфическая гибридизации в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флуорофорами).

ПЦР в режиме «реального времени» (Real-Time PCR, ПЦР-РВ) - используется одновременно для амплификации и измерения количества искомой молекулы ДНК. Преимущество состоит в возможности совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце после каждого цикла амплификации в реальном времени.

Для этого используются флуоресцентные красители, которые интеркалируют в двуцепочечные молекулы ДНК или модифицированные дезоксинуклеоты, флуоресцирующие после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР - амплификация двух и более последовательностей ДНК в одной пробирке одновременно. Преимущество этого метода заключается в возможности выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов или генотипирования множественных аллелей и т.д., поместив проб в одну пробирку.

Все перечисленные виды ПЦР не могут быть проведены без необходимого пространства и оборудования.

Организация ПЦР-лаборатории и необходимое оборудование

Организация ПЦР-лаборатории и необходимый список оборудования регламентированы Методическими указаниями (МУ 1.3.2569-09) «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Комплект необходимого оборудования для проведения ПЦР должен включать в себя все необходимые приборы для выделения НК, их амплификации и детекции результатов. Все оборудование должно быть исправным, иметь технический паспорт и инструкцию по эксплуатации. Все приборы должны соответствовать нормам безопасности.

Для предотвращения контаминации исходных образцов используют одноразовые пробирки с плотно закрывающимися крышками и наконечники к микродозаторам, термостаты с твердотельнымтермоблоком, специальные контейнеры для сброса использованных наконечников и пробирок. Смена наконечников является обязательной после каждой проведенной манипуляции [3].

Для каждого отдельного помещения предусмотрено наличие холодильников и морозильников для поддержания определенной температуры, вортексов и ротаторов для перемешивания, центрифуг различной мощности для перемешивания и разделения образцов. Также необходимо наличие комплекта дозаторов различного диапазона объемов и подходящих для них наконечников, штативов для микропробирок, самих микропробирок (центрифужных, градуированных и пр.) различных объемов. Все комнаты должны быть оснащены бактерицидными рецикуляторами для дезинфекции воздуха при помощи УФ, все рабочие поверхности и наружные поверхности корпусов приборов должны быть устойчивы к дезинфекции. Помимо перечисленного списка каждая зона лаборатории должны содержать конкретный набор приборов, необходимых для выполнения соответствующих задач.

Организация зон лаборатории представлена на схеме [4].

Зона приема, регистрации и первичной обработки материала должна быть оборудована центрифугами для осаждения и разделения компонентов проб.

В зоне выделения НК необходимо наличие:

• абактериального бокса для защиты исследователя от патогенных агентов, передающихся воздушно-капельным путем;

• процессора магнитных частиц для экстракции НК;

• нанофотометра для определения количества и качества выделенной из образка ДНК/РНК;

• термостата для поддержания постоянной температуры в пробирках, помещенных в гнезда термоблока;

• дистиллятора для получения дистиллированной воды.

• Зона приготовления реакционной смеси и проведения ПЦР должна содержать:

• амплификатор, необходимый для нагрева/охлаждения пробирок;

• бокс для стерильных работ для обеспечения защиты от контаминации при выделении ДНК и подготовке реакционной смеси.

1 - зона приема, разбора и первичной обработки материала;

2 - зона подготовки проб и выделения НК;

3 - зона приготовления реакционных смесей, проведения ОТ и ПЦР;

4 - зона детекции результатов методом электрофореза и ГиФА;

5 - комната анализа результатов;

7 - комната обеззараживания материала.

Обязательными для зоны детекции результатов являются:

• камера для электрофореза - разделения продуктов амплификации нуклеиновых кислот, а также источник питания, преобразующий переменный ток в постоянный;

• система гель-документации для регистрации результатов и воспроизведения электрофореграмм, включающая в себя трансиллюминатор для детекции результатов в УФ спектре, а также компьютер;

• электронные прецизионные весы для приготовления агарозного геля, который используется при электрофорезе;

• электрическая плитка для тех же целей.

В последней, но немаловажной зоне дезинфекции материалов необходим паровой стерилизатор для обработки образцов водяным паром под давлением.

Состав оборудования может варьировать в зависимости от размера лаборатории и других факторов.

Метод ПЦР находит применение в различных областях диагностики. Его применяют для выявления в клинических образцах вирусов, бактерий, простейших, а также для обнаружения приобретенных и врожденных генетических нарушений и идентификации личности [5].

Автоматизация этапов денатурации, отжига и элонгации с применением современного оборудования позволяет упростить проведение анализа и способствует его широкому применению в различных областях диагностики. Однако повсеместное внедрение данного метода ограничивается необходимостью ручной и трудоемкой подготовки проб идетекции результатов, а также необходимостью в оснащенной лаборатории со всеми необходимыми реактивами и оборудованием.

Сфера применения полимеразной цепной реакции в дальнейшем будет расширяться, т.к. все чаще в клинической практике имеют дело с очень небольшим количеством исследуемого материала, анализ которого возможен только этим методом.

Появление все новых видов ПЦР способствует охвату большего спектра возможностей для применения метода, упрощает и ускоряет его проведение, тем самым позволяя получить наиболее точный, верный и быстрый результат.

X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В начале 1970-х годов норвежскому ученому Хьеллю Клеппе из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны пришла в голову мысль, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась невостребованной. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кэри Маллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию.

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, доорто-фосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию.

1 . Денатурация, или «плавление» ДНК. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96ºС (или до 98ºС, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой прием называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

2. Отжиг - связывание праймеров с матричной ДНК. Когда цепи разошлись, температуру медленно понижают, чтобы парймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается 50-65ºС. Время стадии - 20 - 60 секунд. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифичных продуктов (при заниженной температуре).

3. Синтез (элонгация цепи). ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве «затравки». Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72ºС. Время синтеза зависит от типа ДНК-полимеразы и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.

После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7 - 10 минут. В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.

Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляется автоматически.

Рисунок 1.Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94—96 °C. (2) Отжиг при 68 °C (например). (3) Элонгация при 72 °C (P=полимераза). (4) Закончен первый цикл. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается [1].

Отрицательный результат ПЦР указывает на то, что в исследуемом материале на момент его сдачи не обнаружено никаких следов инфекционных агентов. Большинство случаев показывает отсутствие инфекции, которую пытались найти в исследуемой пробе.

Положительный результат ПЦР указывает на выявление следов инфекции в исследуемой биологической пробе. С большой точностью положительный результат указывает на наличие инфекции в данный момент времени.

Преимуществами диагностики методом ПЦР являются:

большая чувствительность теста позволяет определить даже единичные агенты возбудителя, что дает возможность выявить патологию на ранней стадии, при хронической и скрытой форме;

универсальность метода позволяет использовать почти любой биоматериал для исследования от слюны до клеток кожи;

большой охват - при исследовании одного образца возможно определить наличие нескольких разных возбудителей заболеваний;

точность - высокий уровень этого метода обследования позволяет не выдавать ложных показателей;

скорость - результат готов в среднем за пять часов, то есть пациент на другой день после сдачи биоматериала уже может забрать заключение;

относительно невысокая цена - данный метод диагностики по стоимости не отличается от других лабораторных анализов крови;

используя этот метод, можно сделать доклиническую и ретроспективную диагностику. Первая выявляет патогенные микроорганизмы еще до проявления заболевания, а вторая проводится после перенесенной патологии, что позволяет не дать патологии развиться и вовремя ее вылечить, а также определить латентную форму заболевания, протекающую без явных симптомов.

Но совершенных методов диагностики не существует, поэтому и у ПЦР есть минусы:

высокие требования к соблюдению технологического процесса;

высокие требования к профессионализму лаборантов [2].

«Вложенная» ПЦР (Nested PCR(англ.)) - применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

«Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR(англ.)) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.

ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR(англ.)) - используется дляамплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы иполучают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.

Асимметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) - проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.

Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR(англ.)) - используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе.

Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) - в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.

Touchdown (Stepdown) ПЦР (Touchdown PCR(англ.)) - с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определённой температуре система пройдёт через полосу оптимальной специфичности праймеров кДНК.

Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Polony - PCR Colony) - акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.

ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) - модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч оснований и больше). Используют две полимеразы, одна из которых - Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая - ДНК- полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой.

RAPD PCR (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA PCR, ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК - используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (20 -25 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удается добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов [1].

XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ КАК МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ

Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Многочисленные открытия в области молекулярной биологии и генетики способствовали открытию ПЦР.В 1869 г. И. Мишер выделил вещество из клеток гноя, которое содержало азот и фосфор. Изначально вещество назвали нуклеином, а когда были определены его кислотные свойства нуклеиновой кислотой.В 1944 г. были проведены эксперименты по трансформации бактерий учеными О.Эвери, К.Маклауда и М.Маккарти. В ходе этих экспериментов было доказано, что за трансформацией бактерий (приобретением болезнетворных свойств безвредной культурой в результате добавления в неё убитых кипячением болезнетворных бактерий) стоит выделенная из пневмококков ДНК.В 1952 г. учеными А.Херши и М. Чейзом был проведен эксперимент с помеченными радиоактивными изотопами ДНК и белками. В результате они выяснили, что в зараженную клетку передается только нуклеиновая кислота, а не белок, как считалось ранее.В 1949-1951 гг. были сформулированы «правила Чаргаффа». Группа биохимика Э. Чаргаффа установила количественное соотношение между различными типами азотистых оснований в составе нуклеотидов ДНК.

Правила Чаргаффа и данные рентгеноструктурного анализа Розалинд Франклин сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК. На основе этих данных в 1953 году Дж. Уотсоном и Ф. Криком был установлен принцип комплементарности. Ученые сделали вывод о том, что ДНК представляет собой двойную полипептидную цепь, образующую спираль благодаря водородным связям между азотистыми основаниями (аденин-тимин и гуанин-цитозин).В 1955 г. произошло открытие фермента ДНК-полимераза А. Корнбергом. Этот фермент способен удлинять полипептидную цепь присоединяя к 3'-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид. Для этого необходимо, чтобы праймер связался с цепью ДНК (матрицей) по принципу комплементарности. Чтобы реакция прошла раствор должен содержать нуклеозидтрифосфаты (дНТФ), которые используются в качестве «строительного материала».В 1971 г. Клеппе с соавторами определили состав реакционной смеси, и принципы использования ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК. Однако, из-за технологической сложности искусственного синтеза праймеров и нестабильности реакции, метод ПЦР было невозможно использовать на практике в полной мере.В 1975 г. Т. Брок и Х. Фриз открыли Thermusaquaticus (грамотрицательную палочковидную экстремально термофильную бактерию). А в 1976 г. была выделена Taq-полимераза - фермент, который способен работать при повышенных температурах (оптимум 72-80 °C).В 1983-1984 гг. К. Мюллисом был проведен ряд экспериментов по разработке ПЦР. Ученый первый начал использовать вместо ДНК-полимеразы устойчивую к высоким температурам Taq-полимеразу, что позволило ускорить работу по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллисом в соавторстве с Ф. Фалуном был разработан алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР.

Методика полимеразной цепной реакции

Taq-полимераза - термостабильный фермент, который обеспечивает достраивание З'-конца второй цепи ДНК по принцип комплементарности. Этот фермент довольно часто используется при проведении стандартной ПЦР.

Taq ДНК полимераза имеет оптимальную температуру репликации - 75-80 о C и выдерживает длительное воздействие температур до 96 о C. Таким образом, она может оставаться активной после каждого из шагов денатурации.

Ход реакции

Элонгация (синтез). Taq-полимераза достраивает вторую цепь ДНК с 3'-концапраймера.

Температура в реакционной смеси доводится до оптимума работы Taq-полимеразы. Затем она максимально эффективно начинает синтезировать вторую цепь ДНК от 3'-конца праймера, который связан с матрицей, и продвигается в направлении от 3' к 5' концу.

Результатом ПЦР будет экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК, описываемое формулой: А = М*(2n- n-1)~2n , где

А - количество специфических (ограниченных праймерами) продуктов реакции амплификации;М - начальное количество ДНК-мишеней;n - число циклов амплификации.

ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» (End-point PCR) - эта модификация позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирку. Таким образом, решается проблема контаминации ампликонами. Однимизвариантовявляетсяметод « FLASH » ( FLuorescentAmplification - basedSpecificHybridization - специфическая гибридизации в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флуорофорами).

Организация ПЦР-лаборатории и необходимый список оборудования регламентированы Методическими указаниями (МУ 1.3.2569-09) « Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Комплект необходимого оборудования для проведения ПЦР должен включать в себя все необходимые приборы для выделения НК, их амплификации и детекции результатов. Все оборудование должно быть исправным, иметь технический паспорт и инструкцию по эксплуатации. Все приборы должны соответствовать нормам безопасности.

Организация зон лаборатории представлена на схеме [3]:

абактериального бокса для защиты исследователя от патогенных агентов, передающихся воздушно-капельным путем;

процессора магнитных частиц для экстракции НК;

нанофотометра для определения количества и качества выделенной из образка ДНК/РНК;

термостата для поддержания постоянной температуры в пробирках, помещенных в гнезда термоблока;

дистиллятора для получения дистиллированной воды.

Зона приготовления реакционной смеси и проведения ПЦР должна содержать:

амплификатор, необходимый для нагрева/охлаждения пробирок;

бокс для стерильных работ для обеспечения защиты от контаминации при выделении ДНК и подготовке реакционной смеси.

камера для электрофореза - разделения продуктов амплификации нуклеиновых кислот, а также источник питания, преобразующий переменный ток в постоянный;

система гель-документации для регистрации результатов и воспроизведения электрофореграмм, включающая в себя трансиллюминатор для детекции результатов в УФ спектре, а также компьютер;

электронные прецизионные весы для приготовления агарозного геля, который используется при электрофорезе;

электрическая плитка для тех же целей.

Список литературы

Зорина, В.В. Основы полимеразной цепной реакции /В.В. Зорина. — Москва: ДНК-технология, 2012. — 80с.

Молекулярная клиническая диагностика. Методы /пер. с англ./под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. — Москва: Мир, 1999. — 558с.

Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности: Методические указания. - М.: Государственная система санитарно-эпидемиологического нормирования Российской Федерации, 2009.- 31 с.

Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III — IV групп патогенности: Методические указания.— М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.—19 с.

ShehnamShafique. Polymerase Chain Reaction /ShehnamShafique.- N.Y.:LAP Lambert Academic Publishing. 2012. - P. 96

Читайте также: