Цитология: прямой цитогенетический метод выделения хромосом клеток

Добавил пользователь Евгений Кузнецов
Обновлено: 14.12.2024

Исследование, направленное на выявление количественных и качественных изменений клеток, наличия внутри- и внеклеточных включений и микроорганизмов в биоматериале, полученном при оперативном вмешательстве. Используется для диагностики широкого спектра онкологических, инфекционных, аутоиммунных и идиопатических заболеваний различных систем и органов.

Синонимы русские

Цитологический мазок, мазок на цитологию.

Синонимы английские

Cytopathology, Smear tests, Imprint cytology.

Метод исследования

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок на предметном стекле.

Общая информация об исследовании

Цитологическое исследование - метод лабораторной диагностики, позволяющий выявить качественные и количественные изменения клеток, наличие внутри- и внеклеточных включений и микроорганизмов. Исследоваться могут мазки-отпечатки, смывы, соскобы с поверхности органов и тканей, а также жидкости полостей тела, полученные при оперативном вмешательстве. Наибольшее значение имеет интраоперационное цитологическое исследование, применяемое для диагностики и определения тактики лечения опухоли в процессе оперативного вмешательства.

Точность цитологического исследования несколько различается в зависимости от того, с какого органа или ткани был получен мазок. Наибольшая частота ложноотрицательных результатов наблюдается при исследовании мазков-отпечатков молочной железы, лимфатических узлов, щитовидной железы, яичника и мягких тканей. Диагностика злокачественного образования с помощью цитологического метода особенно трудна при наличии высокодифференцированных опухолей, включая тубулярную и лобулярную карциному молочной железы, высокодифференцированную фолликулярную карциному щитовидной железы, саркому низкой степени злокачественности и пограничную цистаденому яичника. Такие опухоли, как инфильтративный рак желудка, скирр молочной железы, опухоль Крукенберга и Бреннера, некоторые опухоли мягких тканей и кожи, имеют выраженный фиброзный компонент, что также затрудняет проведение полноценного цитологического анализа. Частота ложноотрицательных результатов цитологического исследования составляет около 6 %. Таким образом, отрицательный результат цитологического исследования недостаточен для исключения злокачественного образования.

Результат интраоперационного цитологического исследования может быть получен в более короткие сроки, чем гистологический анализ криостатных срезов, при этом точность обоих методов сопоставима.

Цитологическому исследованию могут быть подвергнуты плевральная, перикардиальная, асцитическая, синовиальная и спинномозговая жидкости. В зависимости от того, с какой целью проводят цитологическое исследование, в образце биоматериала оценивают следующие параметры: клеточный состав и его количественные изменения (макрофаги, нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, эритроциты, эпителий), качественные изменения клеток (наличие многоядерных клеток, атипичных клеток эпителиального и неэпителиального происхождения), включения (кристаллы, амилоид), микроорганизмы (бактерии, грибы, вирусы).

Что такое цитогенетическое исследование?

Цитогенетическое обследование — анализ на выявление нарушений хромосомного набора человека. Хромосомы представляют собой плотно упакованные нити ДНК, которая содержит информацию о геноме человека. Количество и структура хромосом строго специфична для каждого вида. У человека в ядрах соматических (не половых) клеток содержится в норме 46 хромосом (23 пары). Одна из пар — половые хромосомы — определяет пол человека. У женщины имеется 2 X хромосомы, такой кариотип обозначается как 46XX, у мужчины есть одна X и одна Y хромосома (кариотип 46XY). Неполовые хромосомы называются аутосомами.

Хромосомы в обычном состоянии клетки в ядре не видны, они становятся видны под микроскопом только на определенных фазах деления клеток. Для изучения кариотипа используются клетки в метафазе митоза.

Для проведения исследования у пациента берут кровь и выделяют из нее уже известные Вам лимфоциты. Для того, чтобы заставить их делиться нужна чужеродная стимуляция. Однако при кариотипировании используются специальные вещества (митогены), которые заставляют лимфоциты делиться независимо от их специфичности. В этом главное отличие от СКЛ. (Там никакие химические стимуляторы не применяются).

Через несколько дней деления культура обрабатывается специальным веществом, которое останавливает процесс деления клеток именно на той стадии, когда видны хромосомы. Из клеток культуры готовятся специальные мазки на стеклах, которые будут использованы для исследования. Для получения дополнительной информации о структуре хромосом используется специальная окраска (G-бэндинг) в результате которой каждая хромосома приобретает специфическую поперечную исчерченность. Каждая такая полоска называется G-блоком.

Теперь хромосомы полностью готовы для анализа.

Первая стадия анализа называется кариологией. В большинстве центров, производящим генетическое исследование анализ ограничивается только этой стадией. Специалист генетик анализирует под микроскопом 12-15 клеток на предмет выявления количественных и структурных аберраций. К количественным аберрациям относятся изменения числа хромосом. Например, при синдроме Дауна имеется лишняя 21-я хромосома. Структурные аберрации представляют собой изменение самих хромосом (инверсия — поворот участка хромосомы на 180., делеция — выпадение участка хромосомы, транслокация — перенос части одной хромосомы на другую хромосому, и т. д.). Аберрации могут носить регулярный и нерегулярный характер. Регулярные аберрации обнаруживаются в большом проценте клеток или во всех клетках. Они возникают в момент зачатия или в первые дни после зачатия. Нерегулярные мутации чаще всего являются свидетельством дейстия на организм неблагоприятных факторов (радиация, химические вредности и пр.).

Для выяснения следов действия вредных факторов на геном анализа 12-15 клеток бывает недостаточно (в большинстве случаев после такого анализа пациенты получают узенькую бумажку, в которой указано, что он мужчина, а она женщина).

Поэтому следующей стадией генетического обследования, которая очень важна для пациентов с бесплодием и невынашиванием беременности, является анализ на аберрации. Это расширенное генетическое обследование, при котором подробно анализируется 100 клеток, и расчитывается процент аномальных метафаз. Этот анализ хорошо выявляет возможные следы действия вредных факторов на геном человека. Из-за трудоемкости анализа (на исследование одного человека уходит целый рабочий день специалиста очень высокой квалификации) немногие медицинские центры делают анализ на аберрации.

Цитогенетические исследования

Цитогенетическое исследование - это качественное и количественное изучение набора хромосом для выявления аномалий, которые могут явиться причиной бесплодия, наследственных заболеваний или рождения ребенка с врожденными пороками развития.

Показания к назначению цитогенетического исследования

Цитогенетический метод используется для изучения кариотипа человека и диагностики наследственных заболеваний, вызванных хромосомными мутациями. Также он представляет диагностическую ценность при выявлении мутагенного воздействия лекарственных веществ.

подозрение хромосомной патологии по симптомам;
первичная аменорея;
бесплодие неясного генеза;
многократные спонтанные аборты, замершая беременность;
врожденные пороки развития у ребенка;
задержка умственного и физического развития у ребенка;
случаи мертворождения, врожденных пороков развития и ранней детской смертности в семье;
нарушение формирования половых различий у новорожденного.

Цитогенетическое исследование (кариотипирование) проводится у детей для обнаружения генетических заболеваний и у семейных пар при бесплодии. Также анализ необходим перед проведением вспомогательной репродуктивной технологии (ЭКО, ИКСИ).

Как подготовиться к исследованию

Кариотипирование назначается после консультации врача-генетика по показаниям.

Генетическая диагностика требует соблюдения следующих правил подготовки:

за 1,5-2 часа до сдачи необходимо принять пищу, так как нельзя сдавать анализ натощак;
накануне исключить алкоголь, курение, значительные физические нагрузки;
исключить прием антибиотиков за один месяц до сдачи;
не рекомендуется одновременная сдача анализов, требующих строгой подготовки (клинические, биохимические);
нельзя сдавать анализ на фоне инфекционных/воспалительных заболеваний (отложить на две недели).

Молекулярное исследование может проводиться прямой и непрямой методикой. Прямой метод - это цитогенетический анализ клеток костного мозга, эмбриона или опухолей. Для непрямого метода в качестве материала используются лейкоциты периферической крови (лимфоциты), которые исследуют после специальной подготовки.

Результаты исследования

Результат составляется согласно Международной номенклатуре цитогенетики. Запись кариотипа должна отвечать стандартному формату: [общее количество аутосом], [половые X или Y-хромосомы], [особенности].

В норме человеческий кариотип выглядит так:

46, XY - нормальный мужской;
46, XX - нормальный женский.

Варианты патологии могут выражаться различными формами кариотипов. Различают следующие виды хромосомных нарушений:

количественные аномалии (триплоидия, полиплоидия, моносомия, дисомия, трисомия, полисомия, аномалии половых хромосом);
структурные аномалии (делеции, инверсии, транслокации, кольцевая хромосома, изохромосома).

Структурные аномалии встречаются редко, но характеризуются тяжелой симптоматикой. Обнаружение хромосомных перестроек цитогенетическим анализом позволяет определить причину бесплодия и спрогнозировать риск рождения детей с генетическими заболеваниями.

Факторы, влияющие на результаты исследований

На качество диагностики влияет соблюдение подготовки, курение, алкоголь, физические нагрузки и стресс. Состав рациона питания и прием лекарственных препаратов не оказывают никакого влияния.

Основными факторами являются:

правильно выбранный материал для цитогенетического исследования;
качество окрашивания препарата;
квалификация врача-цитогенетика.

Достоверные результаты требуют соблюдения всех этапов анализа. После взятия крови лимфоциты культивируются на специальной среде, активирующей митоз (деление клеток). При достижении метафазы добавляется вещество, останавливающее деление (колхицин/колцемид). В эту фазу набор хромосом наиболее различим. После обработки гипотоническим раствором лимфоциты переносят на предметное стекло, фиксируются и окрашиваются. Окрашенный препарат изучается под световым микроскопом. Цитогенетическое исследование клеток костного мозга не требует дополнительных воздействий на клетки.

Интерпретация результата

Расшифровка результатов должна проводиться врачом. При постановке диагноза учитываются результаты цитогенетического исследования хромосом, анамнез, клиническая картина и показатели других лабораторных тестов.

В норме кариотип человека состоит из 22 пар аутосом и двух половых хромосом (46XX, 46XY).

При генетических заболеваниях кариотипы могут представляться следующим образом:

Структурные патологии записываются в форме: [номер хромосомы], [плечо], [номер участка], [номер полосы]. Длинное плечо обозначается буквой q, а короткое - буквой p. Делеции, выявленные у мужчины, зачастую являются причиной мужского бесплодия. А в некоторых случаях они могут провоцировать врожденные патологии у плода.

Если выявлен патологический хромосомный набор, то в обязательном порядке показана консультация медицинского генетика. Только специалист может провести правильную интерпретацию результатов. Если патология обнаружена на этапе планирования беременности, врач объяснит паре риск рождения больного ребенка. Дальнейшее решение будут принимать будущие родители.

Сделать цитогенетический анализ можно в клинике «Профимедика». Мы используем оборудование, позволяющее получить изображение высокого качества, поэтому при выполнении анализа участки хромосом исследуются с точностью 99,9%. Благодаря генетической диагностике супружеские пары могут зачать здорового малыша, предотвратить произвольное прерывание беременности и подготовиться к проведению вспомогательных репродуктивных технологий.

Научная электронная библиотека

Цитогенетика - наука, изучающая клеточные основы наследственности и изменчивости, структуру и функции хромосом. Предметом медицинской цитогенетики является исследование связи изменчивости хромосом с патологией у человека. Цитогенетика человека является интенсивно развивающейся областью современной генетики. Это связано с тем, что значительная часть множественных врожденных пороков развития и нарушений полового развития, умственной отсталости и отдельных форм злокачественных новообразований, эндокринных и гематологических заболеваний у человека связана с изменением числа или структуры хромосом. Кроме того, сведения о структурно-функциональных особенностях хромосом человека имеют и общебиологическое значение, внося неоценимый вклад в наши представления об организации и эволюции генетических структур [3].

Цитогенетический метод (кариотипирование) - метод, позволяющий выявить отклонения в структуре и количестве хромосом, которые могут стать причиной бесплодия, наследственной болезни и рождения больного ребенка [3]. Цитогенетические методы можно разделить на три группы: способы получения препаратов хромосом, их окрашивание и анализ.

Цитология: прямой цитогенетический метод выделения хромосом клеток

Цитогенетический анализ клеток костного мозга (кариотип) - исследование, целью которого является оценка количества и структуры хромосом клеток кроветворной ткани.

Стандартное кариотипирование клеток костного мозга, стандартная цитогенетика в метафазных пластинках.

Chromosome Analysis, Bone Marrow, Karyotype, Cytogenetics, Cytogenetic Analysis, Chromosome Studies, Chromosome Karyotype.

Дифференциальное окрашивание хромосом.

Взятие костного мозга для исследования проводится посредством пункции кости. Манипуляцию выполняет врач. Чаще всего костный мозг аспирируется из грудины или задних остей подвздошных костей. После выбора места пункции и обработки кожи над ним раствором антисептика врач проводит послойную местную анестезию до надкостницы. После введения анестетика ждут наступления анестезии не менее одной минуты. Пункцию выполняют специальной иглой, которая имеет внутри стержень. Её продвигают сквозь мягкие ткани до надкостницы, затем с усилием внедряют вглубь костного вещества. После этого убирают стержень и шприцем набирают костный мозг. Во время аспирации возможно возникновение болевых ощущений из-за перепада давления в полости кости. Полученный костный мозг переливают в вакутейнер, содержащий гепарин натрия, и отправляют в лабораторию.

Большинство опухолей кроветворной системы связаны с возникновением генетических изменений в столовой клетке крови, которые приводят к её злокачественной трансформации и появлению опухолевого клона. Генетические нарушения специфичны для определенного заболевания, поэтому их обнаружение считается достоверным диагностическим критерием. Кроме того, наличие некоторых генетических аномалий может влиять на прогноз заболевания, его чувствительность к тем или иным способам лечения и, соответственно, помогает выбрать наилучшую тактику терапии. Стандартное цитогенетическое исследование клеток костного мозга представляет собой изучение количества и структуры хромосом клеток и позволяет выявить геномные (нарушения в количестве хромосом) и хромосомные (изменения в их структуре) мутации.

Хромосомы - структуры в ядре клетки, в которых компактно собрана генетическая информация в виде ДНК. Когда клетка находится в состоянии покоя, хромомосы упакованы в клеточном ядре и визуально различить их друг от друга невозможно. Однако в одну из фаз деления клетки, которая называется метафаза, хромосомы выстраиваются в одну плоскость в центре клетки, формируя так называемую метафазную пластинку. Именно такие метафазные пластинки и изучаются в процессе цитогенетического исследования. Кроветворные клетки костного мозга постоянно делятся, поэтому часть из них во время взятия как раз будет находиться в метафазе своего деления. Преимущество такого метода цитогенетического исследования в том, что оно не требует дополнительных воздействий на клетки для стимуляции деления и получения метафаз. После обработки биоматериала различными химическими веществами клетки фиксируют на предметных стеклах и производят окраску. Существует несколько методов окраски хромосом, каждый из которых позволяет лучше дифференцировать те или иные особенности их строения. Хромосомы анализируется как с помощью микроскопа, так и с использованием компьютерных аналитических систем, которые существенно повышают качество и скорость исследования.

Кариотипирование проводится как минимум на двадцати хорошо окрашенных, полных метафазных пластинках с хорошим разбросом хромосом. Исследователь подсчитывает их количество и проводит оценку структуры каждой путем сопоставления двух аналогичных хромосом и сравнения их с цитогенетическими картами.

Для чего используется исследование?

Для выявления хромосомных аномалий в клетках костного мозга при диагностике и последующем мониторинге эффективности лечения при заболеваниях системы кроветворения.

Когда назначается исследование?

Для верификации диагноза и определения прогностических факторов при злокачественных новообразованиях гемопоэтической ткани (острые и хронические лейкозы, лимфомы, множественная миелома и другие моноклональные гаммапатии, миелодиспластические синдромы).
В целях мониторинга эффективности лечения.
В целях мониторинга сохранения ремиссии заболевания.

Что означают результаты?

Нормальный кариотип человека выглядит следующим образом:

46,ХХ - нормальный кариотип женщины,

46,XY - нормальный кариотип мужчины,

- где первая цифра - это общее количество хромосом, а после запятой перечислены половые хромосомы.

Количество проанализированных метафаз, а также метафаз, в которых выявлены мутации, записывается в квадратных скобках. Для записи генетических аномалий существуют специальные правила, соответственно которым будет написан результат исследования при выявлении какой-либо мутации.

Количественные аномалии хромосом записываются как их общее число, перечисление половых хромосом и номер отсутствующей или лишней хромосомы с соответствующим знаком минус или плюс.

Для обозначения структурных аномалий используются специальные буквенные символы:

t - транслокация - участок одной хромосомы переносится на другую,

del - делеция - потеря участка хромосомы,

inv - инверсия - поворот участка хромосомы на 180 градусов,

- после которых указывается номер хромосомы, на которой они обнаружены, а также ее участок.

В заключении цитогенетического исследования содержится информация о виде мутации и доле метафазных пластинок, в которой она выявлена.

Что может влиять на результат?

Соблюдение правил взятия и преаналитической подготовки биоматериала, опыт и квалификация врача-цитогенетика.
При аспирации костного мозга для нескольких анализов последние его порции могут быть значительно разведены периферической кровью. Поэтому материал для цитогенетического исследования необходимо набирать сразу после пункции. Разведение кровью приведет к невозможности получить необходимое количество метафазных пластинок, так как клетки периферической крови не находятся в состоянии деления.
Недостаточное количество костного мозга также может быть причиной невозможности правильного выполнения анализа.

Важные замечания

В некоторых случаях стандартное цитогенетическое исследование неинформативно. Это бывает при недостаточном количестве метафазных пластинок в исследуемом образце, а также если изменения в хромосомах слишком малы и визуально не меняют ее структуру или количество клеток с мутацией на фоне лечения значительно сократилось. В такой ситуации рекомендуется выполнение исследования методом FISH .

Читайте также: