Иммунологические тесты на инфекционное заболевание

Добавил пользователь Владимир З.
Обновлено: 14.12.2024

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.
Для корректной оценки результатов ваших анализов в динамике предпочтительно делать исследования в одной и той же лаборатории, так как в разных лабораториях для выполнения одноименных анализов могут применяться разные методы исследования и единицы измерения.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Исследование урогенитального тракта методом ПЦР на ИППП ;

Определение ДНК микроорганизмов, вызывающих наиболее распространенные инфекции передаваемые половым путем (ИППП) в вагинальных, цервикальных и уретральных сос.

тест методом ПЦР на коронавирус Covid-19, мазок из носа и зева на определение РНК вируса SARS-CoV-2;

Для проведения исследования в медицинских офисах необходимо предъявить СНИЛС и документ удостоверяющий личность. Запись на исследование В случае по.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Проведение ПЦР

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
термостабильная ДНК-полимераза;
дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.

Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 - 2 минут.

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.

Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию

Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.

РНК- рибонуклеиновая кислота - биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев - нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.

Нуклеоти́ды - основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию - адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) - гуанин, цитозиновый (C) - цитозин, тиминовый (Т) - тимин, урациловый (U) - урацил. В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов - A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа - A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК - рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.

Праймер - котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

Иммунологические тесты на инфекционное заболевание

В иммунологических анализах используется одно из нижеуказанного:

Антиген - для выявления антител к возбудителю в образце биологического материала от пациента

Антитело - для обнаружения антигена возбудителя в образце биологического материала от пациента

Подготовка образцов различна, но если анализ нужно отсрочить, то их, как правило, следует поместить в холодильник или заморозить, чтобы предотвратить чрезмерно быстрый рост бактерий.

Тесты агглютинации

В тестах агглютинации (например, латексная агглютинация, коагрегация) очень маленькие частица (латексные бусинки, желатиновая частица, бактерия) соединяется с антигеном или антителом реагента. Получающаяся комплексная частица смешивается с образцом (например, спинномозговая жидкость, сыворотка); если искомое антитело или антиген присутствуют в экземпляре, то наступает перекрестное связывание частиц в виде их агглютинации, которую можно измерить.

Если результаты положительны, исследуемая биологическая жидкость последовательно разводится и проверяется. Агглютинация с более разведенными растворами указывает на более высокие концентрации целевого антигена или антитела. Титр правильно фиксировать как реципрокный при агглютинации в самом разведенном растворе; например, 32 указывает, что агглютинация произошла в растворе, разведенном 1/32 от начальной концентрации.

Обычно тесты агглютинации быстрые, но менее чувствительны, чем многие другие методы. Они могут также определять серотипы некоторых бактерий.

Фиксация комплемента

Реакция связывания комплемента измеряет потребление комплемента (фиксацию комплемента) антителами в сыворотке или спинномозговой жидкости. Тест используется для диагноза некоторых вирусных и грибковых инфекций, особенно кокцидиомикоза Диагностика Кокцидиоидомикоз - диссеминированное заболевание, которое распространяется в легких или через кровоток, вызывается грибками Coccidioides immitis и C. posadasii; обычно проявляется. Прочитайте дополнительные сведения

Образец инкубируется при известных количествах комплемента и антигена. Степень фиксации комплемента указывает на относительное количество антитела в образце.

Анализ может измерить титры антитела IgM и IgG или может быть модифицирован, чтобы обнаружить определенные антигены. Анализ точный, но имеет ограниченное применение, является трудоемким и требует многочисленных средств по контролю.

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментные анализы используют антитела, связанные с ферментами, чтобы обнаружить антигены или обнаружить и определить количество антител. Примеры:

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Иммуносорбентный анализ с ферментной меткой (тИФА).

Поскольку чувствительность большинства иммуноферментных анализов высокая, то они обычно применяются для скрининга. Титры могут быть определены последовательным разведением образца, как и при тесте на агглютинацию.

Чувствительность анализа хотя обычно и высокая, может изменяться в зависимости от возраста пациента, серотипа микроба, типа образца или стадии клинической болезни.

Анализ на осаждение

Анализы на осаждение измеряют антиген или антитело в жидкостях тела степенью видимого осаждения комплексов антигена-антитела в пределах геля (агароза) или в растворе. Есть много типов анализа на осаждение (например, двойная диффузия по Оухтерлони, встречный иммуноэлектрофорез), но их применение ограничено.

Обычно проба крови смешивается с тестируемым антигеном, чтобы обнаружить защитные антитела, чаще всего при грибковой инфекции или пиогенном менингите. Поскольку положительный результат требует большого количества антитела или антигена, чувствительность низкая.

Анализ вестерн-блота

Анализ вестерн-блота выявляет антибактериальные антитела в образце материала, взятом от пациента (например, сыворотка, другая жидкость тела) по их реакции с антигенами (например, вирусные компоненты), которые были иммобилизированы на мембрану блоттингом.

У анализа вестерн-блота, как правило, хорошая чувствительность, хотя часто меньшая, чем у скрининговых тестов, таких как ELISA, но в общем он имеет высокую специфичность. Обычно используется, чтобы подтвердить положительный результат, полученный при скрининг-анализе.

Техническими модификациями вестерн-блот-анализа являются

Линейный иммуноанализ (ЛИА)

Рекомбинантный иммуноблоттинг (RIBA), при котором используются синтетические или рекомбинантно продуцированные антигены

Иммунохроматографический анализ, который позволяет быстро проводить скрининг образцов на специфические микробные антигены или антитела пациента

Из трех вариантов иммунохроматографический анализ легче провести, и он наиболее распространен для использования — например, для обнаружения микроорганизмов, которые продуцируют токсин Шига Инфекции, вызываемые Escherichia coli O157: H7 и другими энтерогеморрагическими E. coli (EHEC) Грамотрицательные бактерии Escherichia coli O157:H7 и другие энтерогеморрагические E. coli (EHEC), как правило, вызывают острую диарею с кровью, которая может привести к гемолитико-уремическому. Прочитайте дополнительные сведения , Cryptococcus neoformans Диагностика Криптококкоз - это легочная или диссеминированная инфекция, приобретенная при вдыхании почвенной пыли, зараженной инкапсулированными дрожжевыми грибками Cryptococcus neoformans or C. Прочитайте дополнительные сведения

Диагностика инфекционных заболеваний

Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания.

Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов.

бактериологические;
серологические;
метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК или РНК возбудителя инфекционного заболевания в исследуемом материале.

У одних пациентов для диагностики этиологии инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях решающее значение имеют данные серологических исследований, в третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР. Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту необходимо использовать данные различных методов лабораторных исследований.

Бактериологические методы исследования

Бактериологические исследования наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60% в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.

Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне. Истинно-патогенные бактерии в большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания у любого здорового человека. Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.

Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.

Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов.

микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из доставленного биоматериала;
выращивание культуры микроорганизмов (культивирование);
идентификацию бактерий;
определение чувствительности к антимикробным препаратам и оценку результатов исследования.

Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал первоначально подвергается микроскопическому исследованию.

Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму или другими красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева, носа, глаза). Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видов микроорганизмов в биологическом материале, а также дают предварительную информации об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет врачу сразу начать лечение (эмпирическое). Иногда микроскопия позволяет выявить микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания микробов, обнаруженных в мазке.

Культивирование микроорганизмов. Посев исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этих целей используют различные питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов микроорганизмов. Оптимальными являются питательные среды, содержащие кровь животного или человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов. Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и селективные (предназначенные для определенного вида микроорганизмов) среды. Посев осуществляют на стерильные чашки Петри, в которые предварительно заливают питательную среду для роста микроорганизмов.

Микроскопия мазков, окрашенных по Граму

1 - стрептококки; 2 - стафилококки; 3 - диплобактерии Фридленда; 4 - пневмококки

Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные среды, оптимальные для культивирования определенного вида бактерий.

Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических, ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта.

Идентификация - это комплекс бактериологических методов изучения бактерий, позволяющий определить вид микроорганизма. В Лаборатории «Ситилаб» идентификация большинства видов бактерий и грибов осуществляется на автоматическом бактериологическом анализаторе с использованием диагностических панелей зарубежного производства: на бланке результата исследования в виде наименования микроорганизма или его рода, например, Streptococcus pneumoniae (пневмококк) или Eschrichia coli (кишечная палочка).

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. Чувствительность к антимикробным препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов, имеющих этиологическое значение для данного заболевания. Поэтому в направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать препарат для лечения больного.

В Лаборатории «Ситилаб» определение чувствительности выделенной чистой культуры большинства видов бактерий и грибов осуществляется на автоматическом бактериологическом анализаторе с использованием диагностических панелей зарубежного производства к широкому спектру современных антибактериальных препаратов (от 6 до 32 препаратов, в зависимости от выделенного микроорганизма) с определением минимальной ингибирующей концентрации (МИК). На бланке результатов определения чувствительности к антибактериальным препаратам обозначение R указывает на резистентность, I - умеренную чувствительность, S - чувствительность микроорганизма к данному препарату.

Оценка результатов исследования. Принадлежность условно-патогенных микроорганизмов к естественной микрофлоре организма человека создает ряд трудностей при оценке их этиологической роли в развитии гнойно-воспалительных заболеваний. Условно-патогенные микроорганизмы могут представлять нормальную микрофлору исследуемых жидкостей и тканей или контаминировать их из окружающей среды. Поэтому для правильной оценки результатов бактериологических исследований необходимо знать состав естественной микрофлоры изучаемого образца. В тех случаях, когда исследуемый биоматериал в норме стерилен, как, например, спинномозговая жидкость, экссудаты, все выделенные из него микроорганизмы могут считаться возбудителями заболевания. В тех случаях, когда исследуемый материал имеет собственную микрофлору, как, например, отделяемое влагалища, кал, мокрота, нужно учитывать изменения ее качественного и количественного состава, появление несвойственных ему видов бактерий, количественную обсемененность биоматериала. Так, например, при бактериологическом исследовании мочи степень бактериурии (число бактерий в 1 мл мочи), равная и выше 10 5 , свидетельствует об инфекции мочевых путей. Более низкая степень бактериурии встречается у здоровых людей и является следствием загрязнения мочи естественной микрофлорой мочевых путей.

Установить этиологическую роль условно-патогенной микрофлоры помогают также нарастание количества и повторность выделения бактерий одного вида от больного в процессе заболевания.

Врач-клиницист должен знать, что положительный результат бактериологического исследования в отношении биологического материала, полученного из в норме стерильного очага (кровь, плевральная жидкость, спинномозговая жидкость, пунктат органа или ткани), всегда тревожный результат, требующий немедленных действий по оказанию медицинской помощи.

Серологические методы исследования

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Серологические реакции используются в двух направлениях.

1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого. В этом случае из двух компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, гомологичных применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Достоверные результаты получают при исследовании «парных» сывороток крови больного, взятой в начале заболевания (3-7-й день) и через 10-12 дней. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.

2. Установление родовой и видовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

Серологические исследования не обладают 100%-й чувствительностью и специфичностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к антигенам других возбудителей. В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учетом клинической картины заболевания. Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Western-blot для подтверждения результатов скрининговых методов.

В последние годы прогресс в области серологических исследований связан с разработкой тест-систем для определения авидности специфических антител к возбудителям различных инфекционных заболеваний.

Авидность - характеристика прочности связи специфических антител с соответствующими антигенами. В ходе иммунного ответа организма на проникновение инфекционного агента стимулированный клон лимфоцитов начинает вырабатывать сначала специфические IgM-антитела, а несколько позже и специфические IgG-антитела. IgG-антитела обладают поначалу низкой авидностью, то есть достаточно слабо связывают антиген.

Затем развитие иммунного процесса постепенно (это могут быть недели или месяцы) идет в сторону синтеза лимфоцитами высокоспецифичных (высокоавидных) IgG-антител, более прочно связывающихся с соответствующими антигенами. На основании этих закономерностей иммунного ответа организма в настоящее время разработаны тест-системы для определения авидности специфических IgG-антител при различных инфекционных заболеваниях.

Высокая авидность специфических IgG-антител позволяет исключить недавнее первичное инфицирование и тем самым с помощью серологических методов установить период инфицирования пациента. В клинической практике наиболее широкое распространение нашло определение авидности антител класса IgG при токсоплазмозе и цитомегаловирусной инфекции, что дает дополнительную информацию, полезную в диагностическом и прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности при беременности или планировании беременности.

Метод полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать.

Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной частицы.

Введение в реакцию дополнительного этапа - синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы - позволило тестировать РНК-вирусы, например, вирус гепатита С. ПЦР - это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

В ПЦР может быть использован различный биологический материал - сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость и т.д. В первую очередь ЦПР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких как вирусные гепатиты В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д.

Тесты на восприимчивость

Анализы на чувствительность определяют устойчивость микроба к антибактериальным препаратам путем воздействия на него стандартизированных концентраций антибактериальных препаратов. Анализ на чувствительность можно проводить для бактерий, грибов и вирусов. Для некоторых организмов результаты, полученные по одному препарату, предсказывают результаты по подобным лекарствам. Таким образом, не все потенциально активные препараты проверяются.

Анализ на чувствительность проводится в пробирке и, возможно, не учитывает многих факторов естественных условий (например, фармакодинамику и фармакокинетику, особенность концентрации препарата в определенных тканях и органах, иммунитет организма человека), которые влияют на успех лечения. Таким образом, результаты анализов на чувствительность не всегда предсказывают исход лечения.

Анализ на чувствительность может быть качественным, полуколичественным или с использованием методов выделения нуклеиновых кислот. Анализ позволяет также оценить эффект совместного применения различных антибактериальных препаратов (тестирование совместных эффектов).

Качественные методы

Качественные методы менее точны, чем полуколичественные. Результаты обычно говорят об одном из следующего:

Некоторые штаммы, для которых не установлены критерии устойчивости, могут быть отмечены как "Чувствительный" и "Не чувствительный". Определение статуса с помощью концентраций специфического препарата S, I, и R базируется на нескольких факторах, в частности, данных фармакокинетики, фармакодинамики, клинических и микробиологических исследованиях.

Обычно используемый дисковый метод диффузии (также известный как тест Кирби - Бауэра) подходит для быстро растущих организмов. Пропитанные антибиотиком диски помещают в агаровые пластины, на которых находится тестируемый микроорганизм. После инкубации (как правило, 16-18 часов) измеряется диаметр зоны ингибиции вокруг каждого диска. У каждой комбинации антибиотик-микроорганизм есть различные диаметры, имеющие значение S, I или R.

Полуколичественные методы

Полуколичественные методы определяют минимальную концентрацию препарата, который тормозит рост определенного организма в пробирке. Эту минимальную подавляющую концентрацию (МПК) фиксируют как число, которое может затем быть интерпретировано от 1 до 4 групп: S (чувствительный), I (промежуточное звено) или (резистентный) R, а иногда нечувствительный. Определение МПК используется прежде всего для выделения бактерий, включая микобактерии и анаэробы, иногда для грибов, особенно вида Candida.

Минимальная обезвреживающая (бактерицидная) концентрация (MБК) может также быть определена, но технически это трудно, и стандарты для интерпретации еще не согласованы. Ценность анализа MБК состоит в том, что он указывает, может ли препарат быть бактериостатическим или бактерицидным.

Антибиотик может быть растворен в агаре или бульоне, в который затем добавляют микроорганизм. Посветление бульона - золотой стандарт, но он является трудоемким, потому что только одна концентрация препарата может быть проверена в одной пробирке. Более эффективный метод использует стрип-полоску пленки из полиэстера, пропитанную антибиотиком в соответствующей концентрации. Полоску кладут на агаровую пластинку, содержащую вводимый материал, и МПК определяется по месту на полоске, где начинается ингибиция; большое количество антибиотиков можно проверить на одной пластинке.

МПК позволяет осуществить корреляцию между чувствительностью микроорганизма к препарату и достижимой концентрацией свободного препарата в ткани (т.е., не связанный с белком). Если концентрация в ткани свободного препарата выше, чем МПК, то вероятность успешного лечения высока. Обозначения S, I, и R, полученные с помощью МПК исследования, как правило, коррелируют с достижимой концентрацией свободного препарата в сыворотке, плазме или в моче.

Методы, основанные на выявлении нуклеиновых кислот

Эти методы, объединяющие различные методы выявления нуклеиновых кислот Методы идентификации инфекционного заболевания, основанные на выявлении нуклеиновых кислот Идентификация нуклеиновых кислот (молекулярная) становится обычным явлением в клинической медицине, быстрая идентификация в результате применения данного метода позволяет подобрать пациенту. Прочитайте дополнительные сведения , сходны с теми, которые используются для идентификации микроорганизмов, но модифицированы с целью обнаружения известных резистентных генов или мутаций. В качестве примера - mecA, ген резистентности к оксациллину у S. aureus; в присутствии этого гена микроорганизм считается устойчивым к большинству beta -лактамных антибиотиков, независимо от очевидных результатов тестов на чувствительность. Хотя известно множество таких генов, но их выявление не дает права однозначно судить о резистентности в естественных условиях. Кроме того, поскольку могут присутствовать новые мутации или другие гены резистентности, их отсутствие не гарантирует восприимчивости к препарату. По этим причинам обычные фенотипические тесты на чувствительность остаются стандартным подходом для оценки чувствительности бактерий и грибов к антимикробным препаратам.

Тем не менее методы идентификации нуклеиновых кислот являются предпочтительными для

быстрой диагностики мультирезистентного туберкулеза Резистентность к препарату Туберкулез (ТБ) является хронической прогрессирующей микобактериальной инфекцией, часто имеющей латентный период после начального инфицирования. Чаще всего ТБ поражает легкие. Симптомы включают. Прочитайте дополнительные сведения

Быстрое обнаружение возможной резистентности микроорганизмов, непосредственно полученных из положительных культур крови

Читайте также: