Аллергены для диагностики туберкулеза

Анализ эпидемической ситуации по туберкулезу начиная с 90‑х годов свидетельствует о подъеме эндемии заболевания. Отмечается значительное увеличение заболеваемости как населения в целом, так и детей, особенно в группах риска [1]

Анализ эпидемической ситуации по туберкулезу начиная с 90?х годов свидетельствует о подъеме эндемии заболевания. Отмечается значительное увеличение заболеваемости как населения в целом, так и детей, особенно в группах риска [1]. Показатели заболеваемости туберкулезом в группах риска превышают общие показатели в 10 раз (заболеваемость в очагах туберкулеза взрослого населения в 2008 г. составила 864,8 на 100 тыс. контактов, детского — 541,0). В связи с этим совершенствование мероприятий по раннему выявлению заболевания в наиболее подверженных угрозе группах населения является важной задачей фтизиатрии.

Многие годы в мире ведется интенсивный поиск антигенных детерминант, присущих только Mycobacterium tuberculosis и позволяющих дифференцировать вакцинальный иммунитет, развивающийся в результате вакцинации бациллой Кальмета–Герена (БЦЖ), иммунные реакции на непатогенные микобактерии и инфекцию, вызванную M. tuberculosis. Обнаружить антигены, свойственные только M. tuberculosis, удалось лишь после завершения исследования по первичной структуре генома M. tuberculosis. Было установлено, что M. tuberculosis кодирует синтез двух секреторных белков ESAT-6 и CFP-10, которые отсутствуют у M. bovis и большинства непатогенных микобактерий. На основании полученных результатов разработаны такие диагностические тесты, как квантиферон и Т-СПОТ. Данные методики нашли широкое применение во многих странах мира, и в настоящее время проводятся исследования по внедрению их в России. К сожалению, одной из трудностей для широкого их использования является большая трудоемкость и высокая себестоимость. Кроме того, в детской практике необходимость забора крови из вены у ребенка также является препятствием для повсеместного внедрения.

В настоящее время в Российской Федерации разработан новый эффективный метод диагностики начальных проявлений туберкулеза — Диаскинтест®. Диаскинтест® это аллерген туберкулезный рекомбинантный в стандартном разведении, представляет собой рекомбинантный белок (ESAT/CFP), продуцируемый генетически модифицированной культурой Escherichia coli BL21(DE3)/pCFP-ESAT. Комбинация двух антигенов, присутствующих в вирулентных штаммах МБТ и отсутствующих в вакцинном штамме БЦЖ и штаммах других непатогенных микобактерий, делает тест высокоспецифичным [5–13]. В отличие от квантиферона и Т-СПОТ, широко применяемых в других странах, Диаскинтест® вводится внутрикожно и вызывает у лиц с туберкулезной инфекцией специфическую кожную реакцию, являющуюся проявлением гиперчувствительности замедленного типа. У лиц, вакцинированных БЦЖ и неинфицированных МБТ, реакция на препарат Диаскинтест® отсутствует [2–4].

Целью нашей работы было проведение крупномасштабных постмаркетинговых исследований на базе НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И. М. Сеченова и контингентов противотуберкулезных диспансеров Самарской и Рязанской областей.

Материалы и методы

Исследование проведено в 2008 – 2009 гг. Методом сплошного одномоментного отбора сформирована группа из 428 больных локальными формами туберкулеза (из них 328 детей и подростков, 100 взрослых в возрасте от 18 до 45 лет) и 1250 детей и подростков из групп риска по заболеванию туберкулезом. На первом этапе исследования у 265 детей и подростков, больных активным туберкулезом, изучены все известные факторы риска и определена роль туберкулинодиагностики в выявлении заболевания. На втором этапе у 1250 детей и подростков из групп риска по заболеванию туберкулезом, направленных на дообследование в противотуберкулезные диспансеры (ПТД) Рязанской и Самарской областей и в консультационное отделение НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И. М. Сеченова, проведено обследование с использованием традиционного метода выявления — туберкулинодиагностики РМ с 2ТЕ в комплексе с новым методом диагностики — введением внутрикожно аллергена туберкулезного рекомбинантного в стандартном разведении. При необходимости проведено дообследование, с проведением компьютерной томографии для исключения локальной малой формы туберкулеза. При отсутствии признаков интоксикации и отрицательном результате на Диаскинтест® проводилось наблюдение по соответствующей группе диспансерного учета без профилактического лечения. Кроме этого, у 163 пациентов, больных локальными формами туберкулеза в различных его проявлениях (63 ребенка и 100 человек старше 18 лет), проведено комплексное обследование с использованием Диаскинтеста® на разных этапах лечения.

На основании полученных данных определены наиболее подверженные угрозе по заболеванию туберкулезом категории населения, подлежащие обследованию на туберкулез с использованием диагностического препарата Диаскинтест®, и разработан алгоритм диагностики с последующим диспансерным наблюдением за данными пациентами. Статистическую обработку проводили при помощи компьютерной программы SPSS 11,0 с вычислением непараметрического критерия Х2 для категориальных величин, T-критерия для сравнения средних.

Аллергическая диагностика. Основным методом прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота является внутрикожная проба с ППД туберкулином для млекопитающих. В настоящее время туберкулин получают из культурального фильтрата микобактерий, выращенных на синтетической питательной среде, путем осаждения протеиновой фракции (PPD) трихлоруксусной кислотой и сульфатом аммония /А.С. Донченко, 1989; А.Н.Шаров, 1989; А.Х.Найманов, 1993; И.И.Румачик, 1993, 1997; Л.П.Ходун, 1997/.

Туберкулин, при внутрикожном введении, позволяет выявлять инфицированных животных задолго до появления других признаков заболевания. В тоже время эффективность метода во многом зависит от комплекса взаимосвязанных причин: степени распространения инфекции в стаде, характера течения туберкулеза, формы и вида персистирования микобактерий, от механизмов иммунного ответа, различия путей, доз и кратности инфицирования, времени года, физиологического состояния животных, их возраста.

В разных странах для аллергической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота применяют дозы от 2000 до 10000 ME туберкулина для млекопитающих. Выбор дозы зависит от эпизоотической ситуации и иммунологической реактивности животных в конкретном регионе. Оптимальной считают такую дозу туберкулина, которая выявляет наибольшее число животных, зараженных возбудителем туберкулеза и минимальное количество здоровых особей или инфицированных атипичными микобактериями.

Существует мнение о том, что при уменьшении дозы туберкулина ниже 10000 МЕ, часть зараженных животных может не реагировать и остается в стаде, что растягивает сроки оздоровления. Однако в стадах с сильным распространением болезни туберкулин в дозе 10000МЕ одномоментно не выявляет всех инфицированных животных, а средняя чувствительность теста составляет 70-77%. Вместе с тем, регулярная туберкулинизация с интервалом в 30-60 дней позволяет выявить практически всех инфицированных и больных животных. Истинная анергия отмечается не более, чем у 3-4% больных коров.

В неблагополучных по туберкулезу хозяйствах допускается применение двукратной туберкулиновой пробы с целью максимального выявления реагирующих животных (гипердиагностика), которая ранее была обязательной при исследовании скота на туберкулез во всех категориях хозяйств. При учете реакций на первое введение через 72 часа нереагирующим животным повторно вводят туберкулин в той же дозе и в то же самое место и реакции учитывают через 24 часа.

Согласно рекомендаций (МЭБ, 1996), в странах ЕС доза туберкулина была снижена до 2000-2500 МЕ. Для Белоруссии, при улучшении эпизоотической ситуации, оптимальной дозой может быть 5000 МЕ, использование которой без существенного снижения чувствительности на 30-50% уменьшает число неспецифических реакций на туберкулин.

Аллергические реакции на туберкулин у животных могут быть обусловлены не только возбудителем туберкулеза, но и атипичными микобактериями. Обычно применяемая внутрикожная туберкулиновая проба не дает возможности дифференцировать парааллергические реакции у крупного рогатого скота. /А.С. Донченко, 1989; А.И.Завгородний, 1987; А.Н.Шаров, 1989; Ю.Я. Кассича, 1990; А.Х.Найманов, 1993; И.И.Румачик, 1993, 1997; Л.П.Ходун, 1997/.

Для прижизненной дифференциальной аллергической диагностики у животных и птиц применяется симультанная внутрикожная проба: введение туберкулина для млекопитающих как основного аллергена для выявления больных туберкулезом животных (у птиц - туберкулина для птиц), и другого аллергена (туберкулина для птиц, КАМа, других сенситинов), способного в большей степени выявлять особи, инфицированные другими (нетуберкулезными) видами микобактерий. Препараты вводят внутрикожно в симметричные участки шеи с разных сторон. Учет реакции проводят через 72 часа, сравнивая наличие и интенсивность реакций. При отсутствии в стаде туберкулезной инфекции интенсивность реакций у животных будет более выражена на КАМ или туберкулин для птиц, и, наоборот, - при наличии туберкулезной инфекции в стаде - на туберкулин для млекопитающих.

Для дифференциации парааллергических туберкулиновых реакций в ветеринарной практике уже давно используется симультанная проба с применением туберкулина для птиц. /Г.В.Чепик, 1980; И.И.Румачик, 1993, 1997/. Оценку результатов этой пробы проводится по количественному и качественному проявлению реакции на туберкулин как в целом по стаду, так и индивидуально по каждому животному. Животные, инфицированные возбудителем туберкулеза или атипичными микобактериями, реагируют на гомологичный туберкулин в большем количестве и интенсивнее. Преимущественное реагирование крупного рогатого скота только на ППД туберкулин для птиц (более 85%) и незначительное (до 15%) его реагирование на оба туберкулина, при более выраженной интенсивности реакций на туберкулин для птиц и отсутствие или наличии единично реагирующих животные только на ППД туберкулин для млекопитающих со слабо выраженными реакциями, давали основание для предварительного заключения об инфицированности скота данного стада атипичными микобактериями (возбудитель туберкулеза птичьего вида - M.avium -отнесен к III группе атипичных микобактерий по классификации Runyon (1959 г.).

И наоборот, если имеет место преимущественное реагирование скота на ППД туберкулин для млекопитающих, то можно предварительно судить об инфицированности (или заболевании) животных возбудителем туберкулеза (M.bovis или M.tuberculosis).

Если животные реагировали в одинаковой степени на оба туберкулина без какой-либо закономерности, то можно было предположить, что в стаде (на ферме) имеет место смешанная микобактериальная инфекция, т.е. инфицирование животных возбудителем туберкулеза бычьего или человечьего вида и одновременно атипичными микобактериями.

Комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ), разработанный и внедренный в практику в конце 70-х годов (А.Н.Шаров, 1979, 1980), получил широкое применение для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в симультанной аллергической пробе. Симультанную аллергическую пробу с КАМ проводят в соответствии с наставлением. Ее применение рекомендовано через 30-45 дней после первого (или второго) планово исследования при условии выделения реагирующих на туберкулин животных. Хотя в приложении к инструкции (1988 г.) указывается на возможность проведения первичного исследования поголовья сразу симультанно, если ранее постоянно выявлялись реагирующие на туберкулин животные, но бактериологическим исследованием материала от них, диагноз не был подтвержден, а были выделены атипичные микобактерии.

Проводимые сравнительные испытания эффективности ППД туберкулина для птиц и КАМ в симультанной аллергической пробе у крупного рогатого скота явного предпочтения одному из них не дали. Эти аллергены могут в одинаковой степени быть использованы для дифференциации туберкулиновых реакций у скота. Однако обе методики - как с КАМ, так и с туберкулином для птиц - не лишены недостатков.

При математическом анализе результатов симультанной пробы и оценки достоверности интенсивности реакций с КАМ не принимаются во внимание животные, реагирующие только на КАМ и с одинаковой интенсивностью реакций на оба аллергена; при использовании методики симультанной пробы с туберкулином для млекопитающих не учитывались реагирующие только на туберкулин для млекопитающих, только на туберкулин для птиц и реагирующие на оба туберкулина в одинаковой степени. Учитывались только животные, реагировавшие одновременно на оба туберкулина с разной интенсивностью реакций. Такой методический подход более правильный.

Для массовой аллергической диагностики предложен также "Туберкулин очищенный для млекопитающих" Разработанный препарат обладает целым рядом преимуществ, в том числе и по стоимости. "Туберкулин очищенный для млекопитающих" за счет очистки методом ультрафильтрации и высокой специфической активности на 30% дешевле ППД туберкулина. Апробация препарата более, чем на 10000 головах крупного рогатого скота в хозяйствах с разной эпизоотической ситуацией показала, что при равной специфичности с ППД туберкулином Курской биофабрики он обладает достоверно большей специфической активностью, то есть полнее выявляет больных животных в неблагополучном стаде /А.П.Лысенко, Т.Н.Агеева, Г.В.Карпова и др.1997; А.Н.Притыченко, 2002/.

Особенностью аллергической диагностики туберкулеза у свиней является то, что у этого вида животных до сих пор применяется введение одновременно (симультанно) двух аллергенов: ППД туберкулинов для млекопитающих и для птиц. А поскольку в республике туберкулез у свиней отсутствует, то, естественно животные реагируют, в основном, на туберкулин для птиц. Это создает много искусственно надуманных, ничем научно и практически необоснованных ситуаций. В инструкции и наставлении по туберкулезу животных много в этом плане противоречивых пунктов, хотя диагноз на туберкулез у свиней устанавливается на основании п.3.3. Следует в то же время отметить, что у крупного рогатого скота при инфицировании его атипичными микобактериями, в том числе и возбудителем туберкулеза птичьего вида, никаких ограничений не устанавливается (п. 6.6 инструкции), даже молоко от таких животных (стад) идет на общих основаниях.

Анализ научно-практической работы по туберкулезу свиней позволил нам сделать заключение о том, что этот вид животных достаточно исследовать на туберкулез аллергически только одним туберкулином для млекопитающих и это не приведет к ущербу в диагностике и профилактике туберкулеза.

ФГБНУ Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ)

Представлены результаты исследований и обоснование теоретических и практических основ необходимости создания нового комплексного аллергена из нетуберкулёзных микобактерий (НТМБ) для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин. Установлено, что на территории Российской Федерации от реагирующих на туберкулин животных с неспецифическими реакциями до 75% случаев выделяются быстрорастущие НТМБ 4 группы по классификации Раньона.

Комплексный аллерген из микобактерий (КАМ), используемый в ветеринарной практике с 1978 года, готовится из двух видов атипичных микобактерий: M.scrofulaceum (2 группа) и M.intracellulare (3 группа).

Авторы считают, что на современном этапе борьбы с туберкулёзом крупного рогатого скота КАМ необходимо готовить из наиболее часто выделяемых микобактерий 2, 3 и 4 групп, обладающих сенсибилизирующими свойствами. На сенсибилизированных различными видами микобактерий морских свинках установлено, что из НТМБ 4 группы наибольшими сенсибилизирующими свойствами обладают M.fortuitum и M.scrofulaceum.

Основываясь на проведенных исследованиях, в ВИЭВ разработаны новые комплексные аллергены КАМ-2 и КАМ-3, изготовленные из микобактерий 2, 3 и 4 групп.

***
Атипичные микобактерии (нетуберкулёзные микобактерии, НТМБ) широко распространены в природе. НТМБ выделяются повсеместно в различных федеральных округах и климатических зонах Российской Федерации. Анализ выявления этих бактерий на территории нашей страны показывает, что наиболее часто от реагирующих животных с неспецифическими реакциями на туберкулин выделяются быстрорастущие НТМБ 4 группы по классификации Раньона.

Г.К.Параскевов (1988) при исследовании 1033 проб биоматериала от реагировавших на туберкулин животных в 63 случаях выделял микобактерии, из них: 4 (6,3%) – патогенные, а 59 (93,6%) – атипичные. Причём, основную долю (до 77,7%) составляли атипичные быстрорастущие микобактерии 4 группы по классификации Раньона.

Анализ проведённых в ВИЭВ исследований показывает, что при бактериологическом анализе биоматериала от реагировавших на туберкулин животных из благополучных по туберкулёзу хозяйств в большинстве случаев выделяются быстрорастущие атипичные микобактерии 4 группы по Раньону. Отчётные данные производственных ветеринарных лабораторий также подтверждают результаты этих исследований. Так, на территории России ветеринарные лаборатории выделяют атипичные микобактерии в следующем соотношении: 1 группа – 2,0%; 2 группа – 19,7%; 3 группа – 16,8%; 4 группа – 59,5% (А.Х.Найманов, 2004).

Н.С.Боганец (2006) указывает, что ветеринарные лаборатории выделяют атипичные микобактерии: 1 группа – 3,9%; 2 группа – 22,3%; 3 группа – 14,7%; 4 группа – 59,2%. В Сибирском регионе наиболее часто выделяют атипичные микобактерии 4 группы: M.phlei – 12,5%; M.peregrinum – 11,1%; M.smegmatis – 10,1%; M.fortuitum – 8,3%.

М.В.Качкин (2007) в благополучных по туберкулёзу хозяйствах Новосибирской области выделял атипичные микобактерии, которые по групповому составу распределялись: 1 группа – 3,1%; 2 группа – 15,6%; 3 группа – 12,5%; 4 группа – 65,7%.

Н.И.Прокопьева (2004), М.П.Неустроев и соавт. (2009), Н.А.Обоева (2010) установили, что в Якутии у реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота персистируют атипичные микобактерии, близкородственные микроорганизмы Nocardia и Rhodococcus, а также грибы рода Aspergillis. Причем атипичные микобактерии 4 группы выявляются до 75,0% случаев.

А.С.Донченко и соавт. (2011) считают, что основная причина проявления неспецифических реакций на туберкулин в благополучных хозяйствах – сенсибилизация крупного рогатого скота быстрорастущими атипичными микобактериями 4 группы: M.fortuitum и M.smegmatis.

Представленные результаты различных авторов показывают, что на территории России повсеместно выделяются НТМБ, значительную часть которых (от 59,2 до 75,0%) составляют быстрорастущие микобактерии 4 группы по классификации Раньона.

Со времени возникновения проблемы неспецифических реакций были предложены различные методы их дифференциации, однако наибольшее признание и распространение во всем мире получил метод симультанной пробы с туберкулином для млекопитающих и для птиц.

В настоящее время в нашей стране для дифференциации неспецифических реакций применяют симультанную пробу с ППД для млекопитающих и КАМ, а также симультанную пробу с ППД для млекопитающих и ППД для птиц.

Сведения об эффективности этих проб противоречивы. Так, одни авторы считают, что они обладают одинаковой эффективностью, вторые считают более эффективной симультанную пробу с ППД для птиц, третьи – симультанную пробу с КАМ.

В связи с тем, что в последние годы в благополучных хозяйствах Российской Федерации в основном устанавливают сенсибилизацию крупного рогатого скота атипичными микобактериями, а сенсибилизация M.avium выявляется редко, считается, что для дифференциации неспецифических реакций предпочтительно применять симультанную пробу с ППД для млекопитающих и КАМ.

Основным недостатком симультанной пробы является небольшая её эффективность, так как по сообщениям различных авторов из разных регионов симультанная проба с ППД для млекопитающих и КАМ позволяет дифференцировать неспецифические реакции от 0 до 77% случаев. Кроме того, в соответствии с действующим наставлением, она является групповой и дает возможность ориентироваться в ситуации по туберкулёзу лишь в целом по стаду или группе (не менее шести голов) исследуемых животных.

Следует указать и тот факт, что в последние годы при использовании симультанной пробы с КАМ всё чаще стали получать неопределённые результаты исследований при групповом учёте результатов симультанной пробы.

Тем не менее, мы считаем, что главная диагностическая ценность симультанной пробы в том, что при её применении значительно сокращается количество реагирующих на туберкулин животных. Диагностическому убою подлежат только животные, более интенсивно реагирующие на туберкулин или при их отсутствии – реагирующие в равной степени на ППД для млекопитающих и КАМ.

Проведённые нами исследования показывают, что учёт результатов симультанной пробы следует проводить индивидуально по каждой корове, так как в последние годы при групповом учете симультанной пробы и использовании таблицы ведомости учета и таблицы определения достоверности различия реакций на туберкулин и КАМ, практически всегда получаются неопределённые результаты исследований.

Следует учитывать и тот факт, что, в соответствии с утверждёнными нормативными документами, симультанная туберкулиновая проба используется в благополучных хозяйствах в целях дифференциации неспецифических реакций. В благополучных стадах реагирующие животные считаются только подозреваемыми в заражении туберкулёзом. Решающим в установлении диагноза является патологоанатомическое или лабораторное подтверждение туберкулёза у убитых с диагностической целью животных.

Поэтому, учитывая широкое распространение нетуберкулёзных микобактерий, недостаточную изученность и противоречивые данные о сенсибилизирующих свойствах различных видов микобактерий, мы провели исследования по изучению сенсибилизирующих свойств этих микроорганизмов с целью выявления отдельных видов микобактерий, обладающих наибольшими сенсибилизирующими свойствами, для создания нового поколения КАМ.

Материалы и методы

Исследования по изучению сенсибилизирующей роли атипичных микобактерий, а также близкородственных бактерий Nocardia и Rhodococcus провели в Вышневолоцком филиале ВИЭВ (остров Лисий) на морских свинках. Предварительно всех морских свинок исследовали внутрикожной пробой с ППД для млекопитающих в дозе 5 МЕ (25 ТЕ) в 0,1 мл физиологического раствора. В опыт брали только морских свинок, не реагировавших на внутрикожное введение туберкулина. Морских свинок заражали M.fortuitum, M.smegmatis, M.chelonei, M.vaccae, M.phlei, M.flavescens, M.peregrinum, M. intracellulare, M.scrofulaceum, N.transvalensis и R.bronchialis в дозе 5 мг влажной бакмассы культуры микроорганизма в 1 мл физиологического раствора.

Через 21–30 суток после подкожного заражения морских свинок исследовали симультанной пробой с ППД-туберкулином для млекопитающих в дозе 5 МЕ (25 ТЕ) и КАМ в дозе 10 ЕД, в объёме 0,1 мл физиологического раствора внутрикожно с левой и правой стороны в депилированные участки кожи на боках животных. Учёт аллергических реакций проводили через 24–48 часов. За положительную реакцию принимали гиперемию кожи и образование припухлости диаметром 5 мм и более в месте введения аллергенов.

Установлено, что при заражении морских свинок культурами микобактерий в дозе 5 мг в 1 мл физиологического раствора большое количество реагирующих животных выявлено при заражении M. intracellulare (3 группа), M.scrofulaceum (2 группа), M.fortuitum, M.smegmatis, M.chelonei и M.flavescens (4 группа). Причём морские свинки реагировали на КАМ и на ППД для млекопитающих (кроме заражённых M.flavescens и M.peregrinum, которые реагировали только на КАМ).

Морские свинки, заражённые нокардиями, родококками и M.phlei, не реагировали на внутрикожное введение КАМ и ППД для млекопитающих.

Проведённые нами исследования показали, что при заражении культурами микобактерий в дозе 5 мг в 1 мл достигается определенный уровень сенсибилизации у морских свинок. Тем не менее, на эту дозу не реагировали животные, зараженные N.transvalensis, R.bronchialis и M.phlei.

На основании проведённых исследований и анализа результатов этих исследований в ВИЭВ разработаны две опытные лабораторные серии комплексного аллергена из микобактерий КАМ-2 и КАМ-3. КАМ-2 – это опытная лабораторная серия комплексного аллергена из НТМБ, изготовленная из четырёх видов, наиболее часто выделяемых на территории России и обладающих сенсибилизирующими свойствами атипичных микобактерий 2, 3 и 4 группы по классификации Раньона (M.scrofulaceum – 2 группа, M.intracellulare – 3 группа, M.fortuitum и M.smegmatis – 4 группа). КАМ-3 – это опытная лабораторная серия комплексного аллергена из НТМБ, изготовленная из трёх основных видов микобактерий, входящих в состав ППД туберкулина для птиц (M.avium шт. 2282, 3 группа), КАМ (M.scrofulaceum – 2 группа), КАМ-2 (M.fortuitum – 4 группа).

При сравнительном изучении диагностической ценности и дифференцирующей способности ППД-туберкулина для птиц, КАМ, КАМ-2 и КАМ-3 на сенсибилизированных различными видами микобактерий морских свинках установлено, что КАМ-3 по активности и специфичности превосходит все испытанные аллергены.

В настоящее время проводятся сравнительные испытания диагностической ценности биофабричного КАМ и опытных лабораторных серий КАМ-2 и КАМ-3 в благополучных по туберкулёзу хозяйствах, где выявляются реагирующие животные с неспецифическими реакциями на туберкулин.

Выводы

1. На территории Российской Федерации от реагирующих животных с неспецифическими реакциями на туберкулин и различных объектов внешней среды выделяются НТМБ: 1 группа – 2,0%; 2 группа – 19,7%; 3 группа – 16,8%; 4 группа – 59,5%.

2. В связи с широким распространением во внешней среде и выделением от реагирующих животных указанных бактерий для дифференциации неспецифических реакций целесообразно использование симультанной пробы с ППД-туберкулином для млекопитающих и комплексного аллергена из микобактерий (КАМ).

3. В связи с тем, что сенсибилизацию организма крупного рогатого скота к туберкулину вызывают НТМБ 2, 3 и 4 групп по Раньону, комплексный аллерген из микобактерий необходимо готовить из микобактерий указанных групп.

4. Из медленнорастущих НТМБ значительными сенсибилизирующими свойствами обладают M.intracellulare (3 группа) и M.scrofulaceum (2 группа). Из быстрорастущих микобактерий 4 группы наибольшими сенсибилизирующими свойствами обладают M.fortuitum и M.smegmatis.

В ВИЭВ изготовлены опытные лабораторные серии КАМ-2 и КАМ-3. КАМ-2 получен из четырёх видов атипичных микобактерий 2, 3 и 4 групп по классификации Раньона (M.scrofulaceum – 2 группа, M.intracellulare – 3 группа, M.fortuitum и M.smegmatis – 4 грeggf). КАМ-3 изготовлен из трёх основных видов микобактерий, входящих в состав ППД-туберкулина для птиц (M.avium шт.2282, 3 группа), КАМ (M.scrofulaceum – 2 группа), КАМ-2 (M.fortuitum – 4 группа).

1. Боганец Н.С. Бактериологическая диагностика туберкулёза животных и её усовершенствование: автореф. дис. докт. вет. наук. – Омск, 2006. – 38 с.
2. Донченко А.С., Кисленко В.Н., Донченко Н.А. и др. Диагностика туберкулёза животных. – Новосибирск, 2011. – 246 с.
3. Качкин М.В. Комплексная оценка проявления туберкулиновых реакций у животных на территориальном и популяционном уровне с использованием информационных технологий: автореф. дис. канд. вет. наук. – Новосибирск, 2007. – 22 с.
4. Найманов А.Х. Аллергическая диагностика микобактериальных инфекций крупного рогатого скота: дисс. докт. вет. наук. – Москва, 1993. – 354 с.
5. Найманов А.Х. Проблемы диагностики и профилактики туберкулёза крупного рогатого скота в современных условиях / Ветеринарная патология. – 2004. – № 1 – 2 (9). – С. 18 – 23.
6. Найманов А.Х., Устинова Г.И., Толстенко Н.Г., Вангели Е.П., Кучерук О.Д. Проблема неспецифических реакций на туберкулин и совершенствование симультанной пробы для дифференциальной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота // Ветеринария. – 2015 г. – № 6. – С. 20 – 25.
7. Неустроев М.П., Прокопьева Н.И., Протодьякова Г.П. Мониторинг эпизоотической ситуации по туберкулёзу крупного рогатого скота в республике Саха (Якутия) / Сб. науч. трудов ВНИИБТЖ. – 2009. – С. 140 – 143.
8. Овдиенко Н.П., Косенко В.И., Найманов А.Х. и др. Видовая принадлежность микобактерий, выделяемых от крупного рогатого скота и из объектов внешней среды / Проблемы туберкулёза. – 1990. – № 1. – С. 46 – 48.
9. Параскевов Г.К. Причины сенсибилизации крупного рогатого скота к туберкулёзу и мероприятия в хозяйствах в зависимости от вида микобактерий: автореф. дис. канд. вет. наук. – Тбилиси, 1988. – 18 с.
10. Прокопьева Н.И. Особенности контроля эпизоотического процесса туберкулёза крупного рогатого скота в экстремальных условиях Якутии: автореф. дис. докт. вет. наук. – Новосибирск, 2004. – 35 с.
11.Шаров А.Н. Аллергическая диагностика туберкулеза у животных: повышение её эффективности: дисс. докт. вет. наук. – Москва, 1989. – 373 с.

Изобретение относится к иммунологии, в частности к получению биологического препарата для аллергической диагностики туберкулеза.

Известен применяемый для этой цели в мировой практике очищенный РРД (Purified Protein Derivative) туберкулин, представляющий собой белок, выделенный химическим путем из культурального фильтрата возбудителя туберкулеза, выращенного на синтетической питательной среде [1, 2, 3] Белок из культурального фильтрата осаждают трихлоруксусной кислотой, сернокислым аммонием с последующей очисткой его путем многократных переосаждений указанными реактивами или спиртом. Такая методика изготовления туберкулина применяется во всех странах, производящих препарат. Так, в отечественной технологии производства туберкулина для ветеринарных целей белок из культурального фильтрата возбудителя туберкулеза осаждают трихлоруксусной кислотой, переосаждают сернокислым аммонием и освобождают от сульфатов путем диализа против водопроводной воды (схема 1, фиг. 1).

В медицинской практике белок осаждают трихлоруксусной кислотой, затем очищают и обезвоживают спиртом и ацетоном.

Такой туберкулин представляет собой смесь фракций разной молекулярной массы от низкомолекулярных пептидов до высокомолекулярных белковых соединений. Содержащиеся в туберкулине высокомолекулярные белковые фракции обладают антигенными свойствами, индуцируют у животных образование антител и повышенную чувствительность немедленного типа [4] снижают видовую специфичность препарата, что усложняет диагностику туберкулеза и требует применения дополнительных методов исследования при установлении состояния животного по этой болезни.

Процесс производства туберкулина открытый и многостадийный, при обработке белка происходит контаминация его микрофлорой, что приводит к образованию в препарате протеолитических ферментов, снижающих активность туберкулина в процессе хранения [5] и других посторонних белков, отрицательно влияющих на специфичность препарата.

На различных технологических этапах происходят большие потери белка. Эти потери составляют (по отношению к исходному содержанию белка в культуральном фильтрате) при осаждении трихлоруксусной кислотой до 42% сульфатом аммония до 30% при диализе до 4% Окончательный выход белка составляет 20% к исходному [6] Применение при производстве препарата агрессивных химических веществ, сбрасываемых затем в канализацию, загрязняет окружающую среду.

Известно применение при изготовлении очищенного туберкулина метода ультрафильтрации через коллоксилиновые или другие мембраны для концентрирования органических соединений в культуральном фильтрате и удаления неколлоидных составных частей и низкомолекулярных продуктов обмена и аутолиза микобактерий. Туберкулопротеин из такого концентрата осаждают затем дегидратантами (трихлоруксусной кислотой, сернокислым аммонием) [1, 2, 7] что не уменьшает в нем количества высокомолекулярных белков.

Известно также применение в лабораторных исследованиях метода ультрафильтрации с использованием мембран с различной задерживающей способностью для выделения из культурального фильтрата возбудителя туберкулеза белковых фракций различной молекулярной массы с целью изучения их свойств [12, 13] (прототип). Метод заключается в выращивании возбудителя туберкулеза человеческого вида, штамм Н₃₇Rv, на синтетической питательной среде, отделении культурального фильтрата и разделении его на фильтрующих мембранах с задерживающей способностью 10 кДа и 1 кДа. Из части концентрата, содержащего соединения мол.м. 10 кДа и выше, получают туберкулин осаждением белка сернокислым аммонием с последующим обессоливанием раствора, стерилизующей фильтрацией и лиофилизацией.

Однако, несмотря на положительные результаты ряда таких исследований, метод ультрафильтрации для изготовления туберкулина до сих пор не нашел практического применения вследствие малого выхода препарата с узким диапазоном молекулярной массы содержащегося в нем белка и вследствие этого неэкономичностью технологии.

Кроме того, туберкулин, изготавливаемый из M. tuberculosis, содержит больше родовых антигенов микобактерий в сравнении с препаратом, для получения которого используется M. bovis, что обусловливает его невысокую видовую специфичность, а животные, инфицированные M. bovis, реагируют в большей степени на гомологичный аллерген [8, 9, 10] Поэтому для использования в ветеринарии при диагностике туберкулеза у животных более целесообразно для повышения эффективности исследования применять препарат, изготовленный из M. bovis.

Целью изобретения является получение туберкулина, состоящего из наиболее активной и специфичной части белкового спектра возбудителя туберкулеза, при непрерывном и экономичном технологическом процессе без применения химических реактивов.

Это достигается выращиванием на синтетической питательной среде M. bovis, штамм N 8 [11] в течение 6-8 недель, инактивацией культуры автоклавированием, отделением культурального фильтрата от бактериальной массы пропусканием через фильтр-полотно и фильтрующие пластины. Затем полученный культуральный фильтрат пропускают последовательно через мембраны (пластинчатые, рулонные или в виде полых волокон) с задерживающей способностью 100 и 15 кДа.

После ультрафильтрации через мембраны 100 кДа концентрат отбрасывают. Фильтрат подвергают ультрафильтрации через мембраны 15 кДа, фильтрат отбрасывают, а концентрат, содержащий соединения мол.м. от 15 до 100 кДа, используют в качестве целевого продукта (схема 2 технологического процесса изготовления "УФ-туберкулина", фиг. 2).

Как показывает сопоставление схем 1 и 2 (фиг. 1 и 2), при изготовлении "УФ-туберкулина" количество этапов производства сокращается в 2 раза.

П р и м е р 1. Для изготовления "УФ-туберкулина" 100 л культурального фильтрата M. bovis, штамм N 8, выращенного в течение 8 недель на синтетической питательной среде и инактивированного нагреванием, пропускали в режиме концентрирования через фильтрующие мембраны с задерживающей способностью 100 кДа. Степень концентрирования равнялась 50. Таким образом было получено 2 л концентрата и 98 л пермеата.

Концентрат, содержащий соединения мол.м. более 10 кДа, отбрасывали, а пермеат с соединениями менее 100 кДа фильтровали через мембраны с задерживающей способностью 15 кДа также в режиме концентрирования. Степень концентрирования части раствора, содержащей соединения мол.м. от 15 до 100 кДа, равнялась 10. Таким способом было получено 9,8 л концентрата и 88,2 л пермеата, содержащего низкомолекулярные вещества.

Пермеат отбрасывали, а концентрат разводили раствором хлористого натрия, содержащим глицерин и фенол, до получения в 1 мл раствора туберкулина 1 мг белка, 0,85% хлорида натрия, 10% глицерина и 0,3% фенола.

Готовый препарат подвергали стерилизующей фильтрации и расфасовывали в условиях асептики во флаконы вместимостью 10 и 20 мл.

Образцы проверены на активность в сравнении с референтной серией ППД-туберкулина для млекопитающих в соответствии с ГОСТ 16739-88 "Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих" и на видовую специфичность в соответствии с ТУ 10-19-518-87 "Аллерген сухой очищенный комплексный из атипичных микобактерий (КАМ)".

П р и м е р 2. При проверке на морских свинках, сенсибилизированных культурой БЦЖ, установлено, что активность "УФ-туберкулина" была равна 49500 МЕ/мл, что составляет 99% активности референс-препарата туберкулина. По условиям ГОСТ допускается выпуск препарата с содержанием в 1 мл 40-60 тыс. МЕ. Таким образом, изготовленная серия "УФ-туберкулина" по этому показателю соответствует требованиям ГОСТ.

П р и м е р 3. Проведена сравнительная оценка активности "УФ-туберкулинов", содержащих белковые фракции мол.м. более 100 кДа и менее 100 кДа во внутрикожной пробе на морских свинках, сенсибилизированных культурой БЦЖ, в сравнении с референтной серией ППД-туберкулина для млекопитающих. Проверкой установлено, что содержание МЕ в испытываемых препаратах практически одинакового 49500-50000 МЕ в 1 мл.

П р и м е р 4. Проверена видовая специфичность "УФ-туберкулинов", содержащих белковые фракции мол. м. более 100 и менее 100 кДа, на морских свинках, сенсибилизированных смесью культур скотохромогенных (M. scrofulaceum) и нефотохромогенных (M. intracellulare) атипичных микобактерий. При этом установлена более выраженная видовая специфичность "УФ-туберкулина", содержащего белковые фракции мол.м. менее 100 кДа, количество реагирующих на этот препарат животных было меньше в 1,5 раз, и реакция у реагировавших животных в 1,2 раза менее интенсивна.

Результаты опытов 3 и 4 показывают, что активность белков возбудителя туберкулеза не зависит от их молекулярной массы, а видовая специфичность туберкулопротеина повышается с уменьшением молекулярной массы белка. Таким образом, удаление из туберкулина белков мол.м. более 100 кДа повышает его видовую специфичность.

Активные белки содержатся и в части раствора, содержащей соединения мол. м. менее 15 кДа. Однако концентрация таких белков недостаточна для использования в качестве туберкулина с требуемым содержанием международных единиц в миллилитре. Кроме того, в этой части раствора содержится большое количество солей, которые необходимо удалить. В связи с этим методом ультрафильтрации на мембранах 15 кДа проводится концентрирование раствора с соединениями мол. м. от 15 до 100 кДа, и этот концентрат используется в качестве туберкулина.

(56) 1. Seibert F.B. The isolation and properties of the purified psotein derivative of tuberculin Am. Rev. Tuberc. 1934, v. 30, N 6, р. 713-720.

2. Линникова М.А. Очищенный протеино-дериват туберкулина. Проблемы туберкулеза, М. 1939, N 12.

3. Tsumina T. Kuvabara C. Способ получения туберкулина. Патент Японии N 582745, 19.09.73.

4. Петров Р.В. Иммунология. М. Медицина, 1983, с. 368.

5. Безгин В.М. Совершенствование промышленной технологии (ППД) туберкулина и его биохимическая характеристика. Автореф. дисс. канд. биол. наук, М. 1990, с. 27.

6. Шевырев Н.С. Совершенствование промышленной технологии сухого очищенного туберкулина для млекопитающих. Тр. ВГНКИ ветпрепаратов, М. 1972, т. XVIII.

7. Collins F. Lamb J.R. Joung D.B. Infect and Immun. 1988, v. 56, N 5, р. 1260-1266.

8. Lesslie I.W. Hebert C.N. Birn K.T. Comparison of the specificity of human and bovine tuberculin PPD for testing cattle. 1. Republic Ireland Vet. Rec. 1975, v. 96, N 15, р. 332-334.

9. Chaparas S.D. Composition of antigens of various mycobacterial species detected with with a M. tuberculosis reference serum. Amer. Rev. Resp. Dis. 1975, v. 112, N 1, р. 135-137.

10. Baizden L.A. Comparison of the proteins and specificities of human and bovine tuberculosis Amer. J. Vet. Res, 1952, v. 13, N 48, р. 338-344.

11. Инструкция по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопит. утв. ГУВ 30.12.85.

12. Affronti L.F. Ouchterlony O. Lind A. et. al. Tuberculosis, 1983, N 2, р. 66-68.

13. Affronti L.F. Ouchterlony O. Lind A. Ridell M. Wisingerova E.A WHO cooperative effort to isolate a species specific tuberculin skin testing. Int symposium BCG vaccines and tuberculins, part M. Budapest, 1986, p. 503-509.