Баклаборатория по диагностике туберкулеза

Туберкулез давно перестал быть самой распространенной болезнью, но все еще представляет большую опасность для людей. Примерно треть населения является носителем бактерии-возбудителя, которая может передаваться от человека к человеку по воздуху. Поэтому крайне важно вовремя диагностировать туберкулез и принимать все меры для его излечения. Подробнее о лабораторной диагностике туберкулеза, микробиологии этого заболевания и о его лечение вы сможете прочесть в этой статье.

Туберкулез

Что представляет собой туберкулез? Эту болезнь вызывает особая бактерия Mycobacterium tuberculosis. Она преодолевает защиту иммунной системы и начинает бесконтрольно размножаться. В результате инфекция поражает легкие человека, вызывая распад тканей и приводя к серьезному поражению внутреннего органа. В определенный период развития заболевания человек становится заразным, при этом никаких явных симптомов у него может не появляться некоторое время. Так как туберкулез передается по воздуху, такой больной становится опасен для множества людей и прежде, чем болезнь обнаружат, успевает заразить множество здоровых людей. Более того, почти треть всех людей на нашей планете имеет в своем организме бактерии, вызывающие туберкулез. Просто их иммунитет достаточно силен для того, чтобы сдерживать их рост. Такие пассивные носители не могут заразить других до того момента, пока болезнь не перейдет в острую форму. Туберкулез может передаваться не только от человека к человеку, но и через зараженные продукты, в частности, мясо птиц и животных. Для того чтобы избежать эпидемии среди населения, существует метод лабораторной диагностики туберкулеза ГОСТ 26072-89, который позволяет вовремя выявить наличие возбудителя.

В некоторых странах туберкулез распространен больше, чем в других, и влиять на это могут разные факторы. Например, распространение ВИЧ может вызывать также и рост инфицирования туберкулезом, поскольку вторичный иммунодефицит человека делает организм больного открытым для всех болячек. Например, в США наибольшее распространение туберкулез достиг в 1985 году. К 1993 году благодаря мощной государственной поддержке число случаев заражения удалось снизить, но количество больных во всем мире до сих пор вызывает тревогу. Лабораторная диагностика туберкулеза у взрослых крайне важна, так как позволяет на начальной стадии выявить разные формы туберкулеза. В результате пациент получает достаточное лечение, а люди, контактирующие с ним, избегают опасности заражения.

Методы диагностики туберкулеза

Это заболевание опасно. Его очень трудно выявить только с помощью одного метода исследования. Поэтому чаще всего врачи прибегают к дифференциальной диагностике туберкулеза, которая включает в себя несколько способов и позволяет точно установить диагноз. Какие основные методы диагностики можно выявить?

• Флюорография позволяет выявить наличие заболевания по измененному рисунку легких.
• Сбор анамнеза – изучение истории болезни пациента, его жалоб, анкетирование. Сам по себе данный метод не является основанием для постановки диагноза, но опытный специалист вкупе с другими способами может достаточно быстро выяснить причину плохого самочувствия.
• Осмотр пациента – прослушивание легких и перкуссия позволяют выявить хрипы и другие расстройства дыхания.
• Лабораторная диагностика проводится на основе анализов и направлена на выявление возбудителя и атипичных реакций организма (например, воспаления).

Лабораторная и инструментальная диагностика туберкулеза у детей – это достаточно сложная задача, поскольку диагноз сложно подтвердить при помощи микроскопического исследования, а симптомы часто бывают размыты и схожи с другими болезнями. Вот почему детям в школе и в детских садах часто ставят пробу Манту, которая показывает, есть ли иммунный ответ на введенные бактерии.

Лабораторная диагностика туберкулеза

Этот метод является разновидностью клинической диагностики и позволяет выявить наличие заболевания по изменению в химических и количественных составляющих тканей человека. Для лабораторной диагностики могут браться в качестве материалов для исследования следующие жидкости:

Современные методы лабораторной диагностики туберкулеза предполагает использование всех способов одновременно в том случае, если необходим быстрый и четкий ответ. Ведь в некоторых ситуациях счет может идти на часы. Своевременно поставленный диагноз может помочь назначить верное лечение и спасти жизнь пациенту. Лабораторная диагностика туберкулеза включает несколько методов, каждый из которых обладает своими плюсами и минусами.

Микроскопический метод

Микроскопический метод позволяет установить наличие в организме бактерий при помощи реагентов, которые при контакте с возбудителем туберкулеза окрашиваются в определенный цвет. Например, если в организме найдена Mycobacterium tuberculosis в превышающем норму количестве, то контраст становится красного цвета. Для ускорения процедуры микроскопии иногда используют люминесцентный метод, который позволяет выявить возбудителя гораздо быстрее. В этом случае чужеродные организмы подсвечиваются синим или зеленым светом. Несмотря на плюсы в виде быстрого результата и относительно простоты, микроскопический метод не считается идеальным. Он редко показывает точный результат. Если человек болен туберкулезом, но число возбудителей недостаточно для того, чтобы отразиться на цвете контраста, то болезнь запросто можно пропустить. Тем не менее, такой метод все еще используют в некоторых государственных учреждениях.

Бактериологический метод

Среди лабораторных методов диагностики туберкулеза следует отметить бактериологический способ, так как он используется чаще всего. Для данного анализа в качестве исследуемого материала берется мокрота из легких, которая всегда присутствует при туберкулезе легких. Поскольку в ней содержится множество бактерий и грибов, то для идентификации определенной группы микроорганизмов может потребоваться до восьми недель. В течение этого времени лаборант обычно выполняет следующие процедуры:

• Выделяет бактерии из первоначальной пробы.
• Высеивает бактерии и выращивает чистую культуру, изучая ее свойства. Именно этот процесс занимает дольше всего времени, так как микроорганизмам требуется время для размножения.
• Детально исследует клетки.

Для того чтобы бактерии не погибли, их помещают в особую питательную среду, в которой они чувствуют себя точно так же, как и в человеческом организме. Когда чаще всего применяется бактериологический метод? Обычно его используют в тех случаях, когда диагноз уже предварительно установлен и лишь нуждается в дополнительном подтверждении. Бактериологический метод является одним из самых точных способов, но, к сожалению, скорость ответа оставляет желать лучшего.

Проба Манту

Проба Манту – это наиболее ранний вид диагностики туберкулеза. Он был изобретен еще в 1908 году. Это простой и быстрый способ понять, есть ли у человека туберкулез. В больших коллективах (особенно детских) больной может послужить источником заражения для всех остальных. Вот почему проба Манту чаще всего ставится профилактически детям раз в год. При наличии симптомов туберкулеза туберкулин может быть введен повторно.

Во время исследования под кожу в руке пациента вводят антиген возбудителя туберкулеза. Он не является опасным для организма человека и уж конечно же не может заразить его. Процедура проводится с помощью специальной маленькой иглы и практически не вызывает никаких болевых ощущений. Если в вашем организме есть возбудители туберкулеза, то на месте укола образуется большое красное пятно, превышающее принятые нормы. Специалист обычно измеряет его с помощью линейки. Если патология обнаружена, то человека отправляют на дополнительное обследование. Само по себе увеличение реакции Манту не может считаться основанием для постановки диагноза. Но и слишком маленький размер Манту также не является положительным результатом, так как это может указывать на проблемы с иммунитетом.

Для того чтобы метод исследования показал как можно более четкий результат, после подкожного введения туберкулиновой пробы нужно соблюдать несколько правил:

• не чесать место укола;
• не мочить его.

Если же рекомендации не были соблюдены, то об этом обязательно нужно рассказать врачу, так как это может исказить результаты исследований.

Серологический метод

Серологические методы диагностики туберкулеза пришли к нам также из XX века. Однако после многочисленных испытаний ученые осознали, что в отличие от всех остальных инфекций, серологический метод в отношении туберкулеза не обладает нужной чувствительностью и не может гарантировать точную постановку диагноза. Именно поэтому после анализа методов лабораторной диагностики туберкулеза серологический способ не был рекомендован специалистами для массового применения. Возможно, в ближайшем будущем будут созданы более дешевые и эффективные способы серологической диагностики, которые будут способны выявлять специфические антигены туберкулеза, но пока что в медицине применяют другие методы.

Метод ПЦР на данный момент считается одним из самых эффективных лабораторных методов ранней диагностики туберкулеза. Что он собой представляет? Полиразмерная цепная реакция позволяет добиться значительного увеличения некоторых фрагментов ДНК и оценить визуально ее составляющие. Этот метод разработал в 1983 году ученый Кэри Мюллис, и в XXI веке он продолжает использоваться во всем мире. Кроме простого увеличения, ПЦР позволяет производить и некоторые другие манипуляции, которые также способны дать определенную информацию об организме человека.

ПЦР отлично зарекомендовал себя в качестве диагностического способа, поэтому его часто применяют как отдельно, так и в комплексе с другими исследованиями. Для анализа браться может любая жидкость, но чаще всего исследуется слюна или мокрота пациента. Если речь идет о менингите, вызванном туберкулезом, то в этом случае для анализа берут спинномозговую жидкость. Главный плюс данного метода заключается в том, что он обладает высокой чувствительностью и позволяет выявить даже минимальную концентрацию туберкулезной палочки. Кроме того, результат можно получить очень быстро – обычно ответ появляется в течение суток.

Цитология и гистология

К сожалению, во врачебной практике довольно часто встречаются такие случаи, в которых на лицо наличие клинической картины туберкулеза, рентген также показывает изменения в структуре тканей, но по анализам невозможно установить точную причину недомогания. Тем временем без лабораторного подтверждения невозможно грамотно назначить лечение. В этих случаях для исследования может быть использован гистологический или цитологический метод.

Гистологическое исследование представляет собой анализ ткани, который проводится под большим увеличением. Для постановки диагноза чаще всего берут биопсию из легких. Забор тканей происходит с помощью небольшого среза. Данная операция может быть довольно болезненной, поэтому ее делают только при наличии четких показаний.

Цитологическое исследование мокроты считается во многих случаях обязательным при постановке диагноза. Высушенные и предварительно окрашенные мазки рассматривают под большим увеличением. У больных туберкулезом на них можно рассмотреть гнойно-слизистые образования, чуждые здоровым легким. Также отмечается скопление моноцитоидных мононуклеаров. Две этих методики – цитология и гистология обладают высокой информативностью для специалистов, но при этом не требуют больших материальных или временных затрат, поэтому применяются достаточно часто.

Симптомы туберкулеза

Вы можете быть носителем бактерии, вызывающей туберкулез, но если ваш иммунитет при этом довольно сильный, то вы не заболеете. Так называемый скрытый туберкулез не является заразным и не представляет опасности для окружающих. Но для самого больного скрытая форма туберкулеза не является хорошим вариантом, так как может стать активной в любой момент. Такой человек является своеобразной бомбой замедленного действия, которая может активироваться в любой момент. Вот почему лечение одинаково и для скрытой, и для активной формы. Какие основные симптомы туберкулеза?

• Кашель, который не проходит более трех недель.
• Кровянистые выделения из легких (кашель с кровью).
• Потеря веса без особых причин.
• Боль в груди и при дыхании.
• Повышенная температура.
• Потливость и слабость.
• Озноб.
• Потеря аппетита.

Туберкулез может воздействовать не только на легкие, но и на другие внутренние органы: например, на почки, позвоночник и мозг. Если туберкулез распространяется вне легких, то симптомы могут различаться в зависимости от места локализации бактерий. Например, туберкулез позвоночника может заставить вас чувствовать боли в спине, а туберкулез почек приводить к повышенному мочеиспусканию. Однако чаще всего туберкулез начинается именно в легких, поэтому симптомы у пациентов схожи между собой.

Причины и профилактика

Анализ бактериологических методов лабораторной диагностики туберкулеза показывает, что данный способ является весьма эффективным для лечения и предупреждения развития активной формы туберкулеза. Но не всегда удается найти эффективное лечение, особенно на поздних стадиях болезни. Поэтому врачи предпочитают предупреждать болезнь и настаивают на различных профилактических методах. Что может вызвать развитие туберкулеза?

Он появляется лишь от одной микобактерии, которая передается от больного во время разговора, чихания или смеха. Этого оказывается достаточно для того, чтобы собеседник подхватил болезнь. Но шансы заразиться от незнакомца минимальны. Гораздо большую опасность представляют люди, которые не знают о своем заболевании, но находятся с вами в близком контакте. Однако вы можете предпринять следующие меры для предотвращения развития заболевания:

• Избегайте общественных мест и скоплений людей.
• Носите специальную маску.
• Периодически проверяйтесь.

Все перечисленные методы работают лишь на треть. Поскольку все мы живем в окружении других людей, полностью избежать контакта с ними не представляется возможным. Ношение маски может снизить риск заражения. Поэтому все, что на самом деле в наших руках – это заботиться о своем здоровье и вовремя подмечать настораживающие симптомы. Особенно следует быть осторожными людям, которые имеют следующие заболевания:

• сахарный диабет;
• ВИЧ;
• рак;
• болезни почек;
• критично низкую массу тела.

Своевременная дифференциальная диагностика туберкулеза помогает увеличить шансы на полное выздоровление и защищает ваших близких от заражения.

Факты

Вот несколько фактов о туберкулезе, которые заставят вас задуматься.

• Туберкулез входит в тройку основных причин смерти пациентов в возрасте от 15 до 44 лет.
• По оценкам ВОЗ примерно девять миллионов человек в год болеют туберкулезом, из них три миллиона никогда не узнают о своей болезни.
• Симптомы туберкулеза, такие как потливость, потеря веса и невысокая температура могут быть слабо выражены на протяжении многих месяцев, за время которых люди могут заразить около 10-15 человек.
• Туберкулез – это патоген, который может передаваться от человека к человеку исключительно по воздуху.

Лечение

Диагностика и лечение туберкулеза крайне важно для поддержания здоровья. Ведь без лечения 2/3 больных умирают. Однако при своевременном приеме препаратов болезнь является излечимой в 100 % случаев. На ранних стадиях применяются антибиотики, а на поздних может потребоваться и операция. В некоторых случаях бактерии туберкулеза могут мутировать в инфекцию, которая окажется невосприимчивой к стандартным лекарствам. Тогда потребуется более длительное лечение препаратами нового поколения, которые доступны далеко не во всех странах. Также после излечения нередко наступают рецидивы, которые требуют повторного курса лекарств. Микроорганизмы туберкулеза чрезвычайно устойчивы и могут быть уничтожены только специальными и довольно сильными препаратами. При помощи народной медицины и других альтернативных методов вылечить это серьезное заболевание нельзя.

Клиническая диагностика туберкулеза обязательно должна проводиться регулярно даже при отсутствии каких-либо симптомов. Своевременное обследование может предотвратить многие проблемы, связанные со здоровьем.

Задачи лаборатории:

1. Микробиологическая диагностика туберкулеза
2. Микробиологическая диагностика сопутствующих туберкулезу заболеваний
3. Исследование объектов окружающей среды с целью профилактики внутрибольничных инфекций (санитарно-бактериологические исследования)

В настоящее время лаборатория владеет и успешно использует следующие методы диагностики:

Методы бактериоскопии с целью выделения КУМ в диагностическом материале:

• Бактериоскопия по методу Циля – Нельсена;
• Люминесцентная бактериоскопия.

Культуральные методы исследования с целью выделения M.tuberculosis в диагностическом материале и определение ее чувствительности к противотуберкулезным препаратам:

• Посев на жидкие питательные среды с использованием автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960;
• Посев на плотные питательные среды.

Молекулярно-генетические методы исследования, цель которых — обнаружение в диагностическом материале ДНК M.tuberculosis:

• Качественная методика с использованием анализатора GeneXpert (полностью автоматизированная система закрытого типа, которая позволяет выделить ДНК M.tuberculosis из диагностического материала в течение двух часов) с определением чувствительности к рифампицину;
• Количественное определение ДНК в реальном времени с использованием модуля измерительного CFX96 для амплификации нуклеиновых кислот С1000 Touch с определением локуса чувствительности к изониазиду и рифампицину.

В лаборатории работают 14 врачей-бактериологов, 7 из которых имеют высшую квалификационную категорию, 1 – первую и 6 молодых специалистов.

Из 21 работающего среднего медицинского работника – 11 имеют высшую квалификационную категорию, 6 – первую и 1 – вторую.

Ежегодно сотрудниками ЦБЛ осуществляются следующие мероприятия:

— семинары для специалистов клинико-диагностических лабораторий общелечебной сети по бактериоскопической диагностике туберкулеза по методу Циля-Нельсена;

— семинары по организации лабораторного обследования пациентов противотуберкулезных учреждений Омской области;

— кураторские выезды в лаборатории общелечебной сети с целью оказания практической помощи.

История централизованной бактериологической лаборатории

Память – это пища, прежде всего для сердца. Именно она дает возможность человеку ощутить себя частью бесконечного времени. В этой заметке мы хотим воскресить историческую память о создании бактериологической службы наших учреждений, о людях, самоотверженных специалистах, которые создавали и совершенствовали службу на протяжении ряда лет.

Специалисты, стоящие у истоков создания в Омской области противотуберкулезной службы (1923г.) понимали это и в структуре противотуберкулезных диспансеров были предусмотрены клинико-диагностические лаборатории. Эти лаборатории осуществляли бактериоскопическое исследование диагностического материала с целью выделения кислотоустойчивых микроорганизмов по Цилю-Нельсену.

В 1965г. организованы Городские противотуберкулезные диспансеры №4 и №2, имеющие свои клинико-диагностические лаборатории (КДЛ), на базе которых в дальнейшем были развернуты бактериологические лаборатории. Возглавляли эти лаборатории Середа Евгения Ивановна и Подбельский Олег Борисович.

В 1966 году на базе клинико-диагностической лаборатории Омского областного противотуберкулезного диспансера (ОПТД) начали проводиться бактериологические виды исследований. Инициатором этого шага была заведующая клинико-диагностической лабораторией Гамзина Мина Парамоновна, а первым бактериологом противотуберкулезной службы Омской области была замечательный врач, патриот своего дела, Файзель Фрида Адольфовна. Залог успеха в любом деле это энтузиазм и надежное чувство локтя сослуживцев, и без квалифицированных средних медицинских работников- лаборантов в лаборатории, на любом этапе ее работы не обойтись. Хочется помянуть добрым словом первого лаборанта бактериолога Одинцову Нину Матвеевну, которая внесла свой посильный вклад в становлении службы, санитарку Ледовских Валентину Леонтьевну (участника ВОВ). В этот год было сделано 1800 посевов и 315 определений устойчивости к противотуберкулезным препаратам. Вся клинико-диагностическая лаборатория занимала четыре комнаты. Все бактериологические виды исследования проводились в кустарно сработанном боксе. Из средств индивидуальной защиты – ватно-марлевая маска да резиновые перчатки. На этом этапе большую помощь в организации службы, как и в последующие годы, оказывал Московский научно-исследовательский институт туберкулеза МЗ РСФСР (зав. лабораторией Должанский, врачи Калюк А.Н., Немсадзе М.А.). С августа 1968 года клинико-диагностическую лабораторию возглавила врач высшей квалификационной категории Суровец Светлана Игоревна.

В 1968 году на базе КДЛ Городской туберкулезной больницы №21 заведующей Кремер Людмилой Борисовной организована бактериологическая лаборатория, где в разное время работали врачи-бактериологи Виноградова Ксения Михайловна и Мухина Антонина Ивановна.

С 1969 года бактериологические виды исследований стали проводится в Городских противотуберкулезных диспансерах №2 и №4. В диспансере №4 бактериологическую службу организовала врач бактериолог высшей квалификационной категории Хомякова Светлана Петровна, которая долгие годы возглавляла лабораторию, была бессменным председателем профсоюзного комитета, пользовалась огромным уважением в коллективе.

Служба развивалась. С 1978 года в пяти района Омской области (Калачинском, Тарском, Исилькульском, Тюкалинском, Черлакском) были созданы при туберкулезных кабинетах посевные пункты, где осуществлялся посев диагностического материала с цель выделения M.tuberculosis. Выделенные культуры для идентификации и определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам доставлялись в лабораторию Областного противотуберкулезного диспансера. В лабораторию ОПТД была принята врач бактериолог Лосева Альбина Вениаминовна, до конца своих дней не изменившая выбранной профессии. Это был веселый, отзывчивый человек, сумевший сплотить вокруг себя достойный коллектив и привить любовь к профессии. Вечная ей память.

Количество проводимых бактериологических исследований не удовлетворяло потребности в них. В 1984 году приказом Областного отдела здравоохранения была создана централизованная бактериологическая лаборатория при Областном противотуберкулезном диспансере, огромная заслуга в этом принадлежит Суровец Светлане Игоревне. Только она помнит, сколько порогов пришлось обить, сколько бумаги извести, чтобы поставить службу на достойный уровень. Было утверждено штатное расписание: 5 ставок врачей, 14 средних медицинских работников, 5 ставок санитарок. Был выделен транспорт, которым по графику диагностический материал из районов области доставлялся в лабораторию и на котором врачи выезжали в районы области для оказания практической помощи.

В 1985 году Областной противотуберкулезный диспансер был объединен с Городской туберкулезной больницей № 21, которая имела к тому времени бактериологическую лабораторию, организованную врачом-бактериологом Мухиной Антониной Ивановной. Она и возглавляла лабораторию до 1985 года, а затем до конца своей жизни проработала врачом-бактериологом в этой лаборатории. Под новую лабораторию, созданную в результате объединения, были выделены помещения во вновь строящемся корпусе в соответствии с требованиями СНиП.

— лаборатория оснащена компьютерной техникой, бактериологическим анализатором ВАСТЕК, в лаборатории осуществляется ПЦР диагностика;

— бактериологическая лаборатория помимо исследований с целью выделения M.tuberculosis, выполняет исследования на сопутствующую туберкулезу микрофлору;

— все врачи, проработавшие более 10 лет, имеют высшие квалификационные категории.

МЕТОДЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Бактериологическая лаборатория играет существенную роль в выявлении, диагностике туберкулеза, выборе рациональных схем химиотерапии и оценке их эффективности. Бактериологическая диагностика включает обработку клинического материала, микроскопическое исследование, выделение микроорганизма с применением культуральных методов, идентификацию микобактерий с использованием бактериологических и биохимических гестов, а также определение лекарственной чувствительности микобактерий.

Существует несколько групп методов, используемых для выявления МБТ в различном диагностическом материале: рутинные (микроскопия, культуральное исследование), биологические (биопроба, определение вирулентности штаммов МБТ). автоматические системы (MGIT, ВАСТЕС, МВ/ВасТ, ESP Culture System и др.), молекулярной енетические методики (PCR. I.CR, NASBA, Q-Bela и др.). Каждый из этих методов обладает определенной чувствительностью и специфичностью, что необходимо учитывать при клинической интер­претации полученных результатов.

Бактериоскопическое исследование мокроты с окраской мазка по Цилю-Нильсену для выявления кислото­устойчивых микобактерий (КУБ) является наиболее быстрым, доступным и экономически эффективным из существующих методов выявления больных туберкулезом. Оно может быть осуществлено в любой клинико- диагностической лаборатории (КДЛ) лечебно-профилактических учреждений всех уровней и ведомств. Бактериоскопия мокроты представляется чрезвычайно информативной для выяснения эпидемиологической опасности пациента для окружающих, которая коррелирует с числом микобактерий в образце. Бактериоскопическое исследование, проведенное должным образом, имеет положительную прогностическую ценность для легочного туберкулеза, более 90%. Разрешающая способность данного метода составляет 50-100 тыс. микобактерий в 1 миллилитре мокроты и существенно зависит от ряда факторов: правильности сбора мокроты, подготовленности лабораторного персонала и разрешающей способности используемых микроскопов. При микроскопии мазков, приготовленных из проб, взятых в течение трех последовательных дней, результативность метода повышается на 20-30%. Однако нет необходимости использовать более 4-5 проб мокроты.

Метод окраски по Цилю-Нильсену наиболее часто используется при бакгериоскопичсском выявлении микобактерий. Он заключается в следующем: мазки мокроты окрашивают фуксином при нагревании, затем обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают метиленовым синим. В результате микобактерий окрашиваются в малиновый цвет, а фон — в синий. Это специфическое окрашивание обусловлено способностью микобактерий удерживать краситель при обработке кислотой или спиртом.

В бактериологических лабораториях, выполняющих большое количество исследований (100 и более ежедневно), используется люминесцентная микроскопия. Данный метод основан на способности липидов микобактрий воспринимать люминесцентные красители (акридиновый оранжевый, аурамин, родамин и др.) и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. В зависимости от красителей, микобактерий туберкулеза дают четкое ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое - на темно-зеленом фоне. Метод люминесцентной микроскопии обладает большей чувствительностью, чем световая микроскопия, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала (микроскопия осадка), поскольку люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить измененные микобактерий, утратившие кислотоуетойчивость. в связи с чем они не выявляются при бактериоскопии по Цилю-Нильсену. Мазки для люминесцентной микроскопии готовят из осадка, полученного после обработки диагностического материапа детергентом с последующим отмыванием либо нейтрализацией. При положительном результате бактериоскопии мазков, окрашенных флуорохромами, должна быт ь проведена подтверждающая микроскопия мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену

Бактериоскопическое исследование необходимо проводить очень тщательно. Обычно образец исследуют в течение 15 минут (что соответствует просмотру 300 полей зрения), чтобы сделать заключение об отсутствии или наличии КУБ в препарате. При окрашивании флюорохромами для исследования одного мазка требуется меньше времени.

Основным диагностическим материалом для бактериоскопии на КУБ служит мокрота. Результаты бактериоскопического исследования на КУБ других биологических материалов (различных жидкостей, тканей, гноя, мочи и т.д.) имеют ограниченное значение для диагностики туберкулеза. Так. исследование 9

мазков из осадка центрифугированной мочи не всегда позволяет получить достоверные результаты, поскольку в моче могут присутствовать нетуберкулезные микобактерий. Поэтому выявление КУБ в моче не всегда свидетельствует о наличии специфического процесса. В мазках из осадка промывных вод желудка и других материалов могут обнаруживаться кислотоустойчивые са-профиты, которые легко спутать с МВТ.

Количество обнаруженных КУБ определяет степень тяжести заболевания и опасности больного для окружающих. Следовательно, исследование должно быть не только качественным, но и количественным. В современных эпидемиологических и экономических условиях бактериоскопическое исследование мокроты у обратившихся в ЛПУ за врачебной помощью лиц с клиническими симптомами, подозрительными на туберкулез, является приоритетным направлением в тактике раннего выявления данного заболевания. Возрастание роли этого метода связано также с возникновением в последние годы остропрогрессирующих форм заболевания, сопровождающихся выраженными клиническими проявлениями и обильным

Материал для бактериологического исследования собирают асептически. Перед проведением бактериологического исследования поступившие в лабораторию пробы обрабатывают растворами кислот или щелочей с последующим центрифугированием. Это необходимо дня разжижения и концентрации образца, а также для предотвращения контаминации, поскольку пробы мокроты вязкие по консистенции и содержат большое количество микрофлоры. Около 1 мл разжиженного и деконтаминированного клинического образца засевают в пробирки со средой и инкубируют при 37°С в течение 10 недель.

Для культивирования микобактерий используют плотные (яичные, агаровые) и жидкие питательные среды. Яичные среды содержа! цельные яйца или яичный желток, а также фосфолипидьг, белки и другие ингредиенты. С целью предотвращения контаминации к среде добавляют некоторые красители, например, малахитовый зеленый, а также антибиотики. Поэтому яичные среды (Левеншейна-Йенсена, Финна), на которЕлх культивируют микобактерий. имеют сине-зеленый цвет. Использование яичных сред позволяет получить видимый рост колоний М tuberculosis через 18-24 дня в виде сухого морщинистого налета кремового цвета. Однако качество ингредиентов, из которых готовится среда, иногда значительно варьирует, что может влиять на воспроизводимость результатов. По сравнению с яичными агаровые среды имеют ряд преимуществ: они готовятся из полусинтетических основ, что обеспечивает более стабильное качество и воспроизводимость результатов. Детекция роста МБТ на агаровых средах возможна через 10-14 дней. Однако агаровые среды дороже, требуют присутствия СОг в атмосфере и инкубируются в термостате не более 1 месяца.. Как правило для выделения микобактерий используется набор из двух разных питательных сред.

Автоматические системы. Разработка радиометрической системы ВАСТЕС 460 (Becton Dickinson) ознаменована собой качественный прорыв в быстрой детекции микобактерий и определении их лекарственной чувствительности

Автоматические системы, предназначенные для выявления микобактерий туберкулеза, позволяют проводить детекцию роста микобактерий в 2-3 раза быстрее, чем классические методы. Положительный результат анализа должен обязательно подтверждаться бактериоскопически. В практике бактериологических лабораторий исследование с использованием автоматических систем обязательно проводится параллельно с исследованием на плотных питательных средах

Идентификации микобактерий. Несмотря на то, что морфология колоний, наличие пигмента и ростовые характеристики дают некоторое

с С. Таким образом, две цепочки ДНК остаются в растворе в не связанном друг с другом состоянии до тех пор. пока температура не будет понижена. На следующем этапе, получившем название этапа отжига праймеров, который проходит при 40-60°С, с участками одноцепочечных молекул ДНК, фланкирующими последовательность-мишень, связываются праймеры. Это короткие участки РНК длиной около 20 нуклеотидов. Каждая из затравок связывается только с одной цепочкой ДНК. Следующий шаг ПЦР умножение последовательности-мишени с помощью полимеразы. Поскольку инкубационная система на этапе денатурации ншреваегся до 90-95°С, в ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза, выделенная из Thermus aquaticus. Этап достройки затравок проходит при 70-75°С. На этом заканчивается первый цикл амплификации. Далее все этапы повторяются 20-25 раз. В результате количество ДНК-мишени возрастает в геометрической профессии.

На практике из патологического материала, взятого от больных, при помощи специальных методов выделяют ДНК. К ней добавляют реакционный буфер, смесь нуклеозидтрифосфатов, праймеры, полимеразу и 1 12

проводят амплификацию в программируемом термостате (термоциклере). Результат учитывают с помощью электрофореза в агарозиом геле или с помощью иммобилизованных фрагментов ДНК. Присутствие в пробе последовательности-мишени свидетельствует о наличии МБТ в исследуемом образце. ПЦР позволяет выявлять 1-10 бактериальных клеток в 1 мл биологического материала. Специфичность реакции — 97-98%.

Исследованию методом ПЦР подлежат мокрота, бронхиальный секрет, плевральная и другие жидкости, моча, периферическая и менструальная кровь, соскобы эпителиальных клеток цервикального канала.

Следуег отметит ь, что с помощью ПЦР нельзя определить активность туберкулезного процесса, поэтому интерпретировать полученный результат необходимо с учетом клинико-рентгенологических данных. Метод ПЦР можно использовать как дополнительный диагностический метод при дифференциальной диагностике в комплексе с другими методами лабораторной диагностики туберкулеза и нельзя использовать в качестве скринингового метода для выявления больных туберкулезом из-за возможности ложноположительных резуль- iuiob. Кроме ю10. препятствием для широкого использования данного метода служит необходимость использования дорогостоящего оборудования и диагностических наборов.

ПЦР — не единственный амплификационный метод детекции микобактерий. Применение амплификационных методик для выявления различий в генетической структуре чувствительных и устойчивых штаммов —• еще один новый подход к определению лекарственной чувствительности микобактерий. Проводит ь данные исследования стало возможным благодаря определению нуклеотидных последовательностей генов, мутации в которых при водят к возникновению резистентности к противотуберкулезным препарат ам. При использовании амплификационных методов значительно сокращаются сроки исследования. Главным ограничением для их применения служит существование других механизмов резистентности. С помощью амплификационных методик не обнаруживается около 10% случаев устойчивости к рифампицину, 20% — к изониазиду и 40% — к стрептомицину. Поэтому молекулярные методы, никогда не смогут полностью заменить классические культуральные методы определения лекарственной устойчивости МБТ.

Исследования по эпидемиологии туберкулеза в течение длительного времени тормозились отсутствием точного и воспроизводимого метода субтитрования клинических изолятов для изучения распространения штаммов МБ'Г. Совершенствование молекулярно-генетических методов позволило разработать высокоспецифичные маркеры для типирования штаммов МБТ.

Штаммы МБГ невозможно различить с помощью рутинных биохимических тестов или серологических методов. Устойчивость к ПТП в некоторых случаях является воспроизводимым маркером, но этот маркер не является общепринятым. До недавнего времени единственным пригодным методом для типирования штаммов МВТ служил метод фаг оптирования. Однако он технически сложен и использовался в немногих лабораториях, поскольку не позволяет добиться необходимой специфичности, и с его помощью можно выделить лишь ограниченное число фаготипов.

Генотипирование позволяет использовать в качестве маркеров тонкие различия в хромосоме микобактерий, не вызывающие фенотип и ческих различий. Поскольку получаемая в результате исследования картина индивидуачьна для конкретного штамма (как отпечатки патьцев для человека), данный метод получил название геномной дактилоскопии (DNA fingerprint).

Для типирования чаще всего используют специфичную для М tuberculosis повторяющуюся мобильную последовательность ДНК, которая демонстрирует необходимый уровень полиморфизма. Число копий этой последовательности высоко у большинства изолятов М. tuberculosis (7-20), низко у большинства изолятов М. bovis от животных (1-4) и у различных штаммов А/, hovis BCG (1-2).

Метод генотипирования основан на использовании рсстрикционных эндонуклеаз. которые распознают специфические последовательности и нарезают ДНК на фрагменты разной длины. Содержание гуанина и цитозина в микобактериальной ДНК высоко (около 65%), поэтому целесообразным признано использование энзимов, распознающих фрагменты, богатые аденином и тимином, и разрезающих Д11К на небольшое число крупных фрагментов.

Использование метода в стандартном варианте осложняется необходимостью экстракции почти 1 мкг

ДНК из каждою изолята. Поэтому в настоящее время разработаны два варианта метода геномной дактилоскопии, основанные на использовании ПЦР. Они позволяют использовать очень маленькое количество ДНК и получать картину, сопоставимую по специфичности со стандартным методом. В таких вариантах исследование может быть выполнено на бактериях из нескольких колоний или старых нежизнеспособных культурах, а также клинических бактериоскопически положительных образцах.

Выделенные при вспышке заболевания изоляты МБТ с большой долей вероятности демонстрируют одинаковую генотипическую картину. Поэтому изоляты, связанные с конкретной вспышкой заболевания, можно легко идентифицировать. Однако пока не проведено масштабное исследование с целью определения предполагаемого числа возможных геногипических вариантов в конкретном географическом регионе.

Первым применением генотипирования изолятов МБТ было отслеживание вспышек туберкулеза. Так, с использованием этого метода была установлена причина вспышки туберкулеза, вызванной инъекциями контаминированных лекарственных препаратов. Эта работа продемонстрировала полезность геномной дактилоскопии для проведения эпидемиологических исследований и показала, что с использованием данного метода можно идентифицировать изоляты, связанные со вспышкой, среди большого количества изолятов. Доказана полезность геномной дактилоскопии в отслеживании распространения полирезистентных штаммов. В результате нескольких исследований было описано нозокомиальное распространение таких штаммов среди ВИЧ-инфицированных больных. В каждом из таких исследований были идентифицированы 1 или 2 штамма, связанные со вспышкой заболевания. Используемая для типирования последовательность ДНК не кодирует лекарственную чувствительность, поэтому резистентность к ПТП не влияет на картину фингерпринта. Однако в данном случае фингерпринт может служить маркером данного штамма и указывать на лекарственную резистентность новых изолятов с таким же фингерпринтом.

При эпидемиологических исследованиях вспышек полирезистентного туберкулеза лекарственная устойчивость указывает на возможность эпидемиологической связи между штаммами, геномная дактилоскопия обеспечивает окончательное доказательство. Метод даже более полезен для проведения исследования полирезистентных изолятов, поскольку это единственный метод доказательства родства штаммов. Широкомасштабное применение этого метода ко всем изолятам в данной географической зоне может выявить циркулирующие штаммы МБТ и идентифицировать ранее неизвестные источники распростра­нения туберкулезной инфекции. Однако в настоящее время еще не установлено, является ли такое применение метода практически осуществимым, поскольку лабораторное изучение изолятов МБТ легче, чем исследования, необходимые для отслеживания распространения штаммов с использованием геномной дактилоскопии. Метод можно также использовать для подтверждения кросс-контаминации культур и других ошибок, допускаемых при лабораторном исследовании.