Иммунологические тесты в диагностике туберкулеза

Существует целый ряд универсальных феноменов, препаратов и иммунологических тестов, которые первоначально были обнаружены именно при туберкулезе или на модели иммунного ответа на микобактерии. К ним относят БЦЖ и туберкулин , такой феномен, как кожная ГЗТ (туберкулиновые пробы - реакции Пирке и Манту ), реакцию на подкожное введение туберкулина сенсибилизированным животным (феномен Коха). Одни из первых антитела при инфекционном заболевании были также обнаружены при туберкулезе. Разумеется, чем глубже понимание механизмов противотуберкулезного иммунитета и их генетического контроля, тем шире может быть использование иммунологических методов и препаратов, воздействующих на иммунитет, для решения практических проблем фтизиатрии.

Самой важной и сложной практической проблемой в настоящее время считают выявление туберкулеза в процессе массового скрининга населения. Однако, несмотря на многочисленные сообщения об "успехах" (на ограниченном материале), нет подходящего для этих целей иммунологического метода (воспроизводимого в "любых руках") и препарата.

Иммунологические методы, в частности серологические исследования (определение антигенов, антител) и туберкулинопровокационные пробы, весьма широко используются в клинической практике. В табл. 13-4 перечислены задачи применения иммунологических исследований во фтизиатрии и методы, используемые для решения этих задач.

На первом месте среди иммунологических исследований, применяемых при дифференциальной диагностике, находятся серологические методы - определение антигенов и антител в разных средах организма ( табл. 13-5 ).

Специфичность определения антител к микобактериям туберкулеза зависит от используемых при иммунном анализе антигенов. Предложено значительное количество антигенов, самый первый из которых - туберкулин ППД :

- ППД и другие комплексные препараты из культуральной жидкости;

- тритоновый экстракт и другие комплексные препараты клеточных стенок;

- фенольный и другие гликолипиды ;

- белки (чаще всего рекомбинантные); 81 КДА , 65 КДА , 38 КДА , 34 КДА , 30 КДА , 19 КДА , 18 КДА , 16 КДА , 15 КДА , 12 КДА белки и др.

В результате многолетних исследований российских и зарубежных ученых были выявлены основные закономерности антителообразования и эффективности серологической диагностики туберкулеза: чем более комплексный антиген, тем выше чувствительность и ниже специфичность тестов. Специфичность в разных странах различается в зависимости от инфицированности населения М. tuberculosis и нетуберкулезными микобактериями, от проведения вакцинации БЦЖ и др. У детей информативность серодиагностики ниже, чем у взрослых. При первичном туберкулезе (чаще дети) более информативно определение IgM , при вторичном - IgG . У ВИЧ -ннфицированных информативность серодиагностики при определении антител снижается. Эффективность определения антител зависит от ряда "клинических моментов": активности процесса (наличия или отсутствия "выделения" микобактерий, наличия полостей распада, степени инфильтрации), распространенности процесса, длительности его течения.

Чувствительность метода иммуноферментного анализа (ИФА) составляет около 70%. Недостаточная эффективность исследования связана с его низкой специфичностью. Ранее рассматривали возможности применения серологического скрининга в группах высокого риска, в частности среди лиц с посттуберкулезными изменениями в легких.

Для повышения специфичности ИФА продолжают поиски более специфичных антигенов, в том числе получаемых генно-инженерным путем: ESAT-6 и др. Применение строго специфичных антигенов ( 38 кДа , ESAT) повышает специфичность, но значительно уменьшает чувствительность анализа. Наряду с ИФА (экспериментальные лабораторные тест-системы. например Pathozyme ELISA kit) предложены также наборы иммунохроматографические с латеральной фильтрацией (Mycodot), а также другие подобные тесты (дот-анализ на мембране) с визуальной оценкой результата исследования. При проведении этих тестов анализ проходит в течение 10-30 мин; они не требуют специального оборудования, требуют визуальной оценки результатов, что связано с известной субъективностью. Указанные методы имеют примерно те же характеристики чувствительности и специфичности (70% и 90-93% соответственно), что и традиционный ИФА.

Применение методов иммунного анализа имеет определенное значение в качестве дополнительного, учитываемого в комплексе используемых методов, при дифференциальной диагностике туберкулеза, особенно при диагностике его внелегочных форм. Наибольшую эффективность метод ИФА имеет в диагностике туберкулезного менингита при исследовании спинномозговой жидкости. В этом случае чувствительность анализа составляет 80-85%, а специфичность 97-98%. Имеются сведения об эффективности определения антител к микобактериям туберкулеза в слезной жидкости при диагностике туберкулезного увеита .

С момента открытия в 1882 году Робертом Кохом возбудителя туберкулеза началась эпоха поиска путей диагностики этой инфекции. Особенностью туберкулеза является то, что заболевание может существовать в разных ипостасях: от инфицирования и латентной инфекции до активных и остро прогрессирующих форм. При наличии бактериовыделения выявить туберкулез легко, но это свидетельствует о поздней диагностике. Такие пациенты опасны для окружающих. Один больной хронической формой за один год заражает до 10-20 человек. Чаще инфицируются дети, особенно без вакцинации БЦЖ. Для выявления скрытой инфекции в 1907 году немецкий ученый фон Пирке предложил проводить пробу с разными разведениями туберкулина, а француз Манту рекомендовал использовать две туберкулиновые единицы (ТЕ) для раннего выявления туберкулеза. В 1932 году произведен очищенный туберкулин, позволивший исключить реакции на другие компоненты раствора.

С 1965 года проба Манту с 2 (ТЕ) PPD (англ. purified protein derivative), т.е. ППД-Л – белковый раствор для внутрикожного введения, с модификацией отечественного ученого Линниковой внедрен в СССР. Туберкулин не содержит возбудителя, являясь белковым раствором, который не может вызвать инфекционного процесса, а только диагностировать специфическую аллергическую реакцию замедленного типа, которая проявляется не ранее чем через 72 часа. В основном в препарате отсутствуют балластные примеси, однако он может содержать их в незначительно-минимальных количествах, что может влиять на результат реакции в первые, вторые сутки от момента введения. С помощью реакции Манту с 2 ТЕ выявляют момент первого попадания возбудителя туберкулеза в организм ребенка (вираж туберкулиновых проб или гиперергическую реакцию).

В 60-х годах прошлого века начали использовать вакцинацию в качестве профилактики распространенных, остропрогрессирующих форм туберкулеза, нередко приводящих к летальным исходам. Введение вакцины БЦЖ или БЦЖ-м снизило диагностическую ценность туберкулиновых проб из-за развития поствакцинного иммунитета. С одной стороны это затрудняет интерпретацию результатов туберкулиновых проб. С другой стороны рядом ученых доказано, что туберкулиновая проба косвенно является функциональной характеристикой иммунной системы. Правильная интерпретация результатов туберкулиновой чувствительности позволяет оценить состояние клеточного иммунитета. То есть помимо обследования для раннего выявления туберкулеза, туберкулиновые пробы могут сказать о состоянии иммунореактивности организма, что особенно важно у часто болеющих детей. Большое заблуждение, когда родители считают, что врач ставит диагноз туберкулеза только по математической разнице между результатами за прошлый и нынешний год. Следует признаться, что врачу приходится одновременно учитывать более десяти разных параметров, характеризующих состояние человеческого организма.

За сто лет использования туберкулинового теста изменились условия жизни: отмечен рост аллергических заболеваний в популяции, увеличение числа детей, реагирующих на введение 2 ТЕ развитием аллергических реакций немедленного типа, которые дают ложное представление о туберкулиновой чувствительности и, соответственно, туберкулезной инфекции. Из-за этого туберкулиновая проба имела много нареканий со стороны родителей детей. К сожалению, отказаться от нее на современном этапе невозможно по причине необходимости проведения вакцинации детям в возрасте 6-7 лет, имеющих отрицательные реакции на туберкулин. Полный отказ от вакцинации в России невозможен из-за высокого риска инфицирования, который превышает порог, допускающий не проводить прививки БЦЖ, в 10 раз!

В 2010 году в России зарегистрирован тест QuantiFeron-ТВ, а в 2014 году – T-SPOT-TB. При этом в лабораторных условиях определяется уровень γ-интерферона или Т-лимфоцитов, продуцирующих γ-интерферон в ответ на стимуляцию белками ESAT-6, CFP-10, ТВ.В7,7. Оба импортных теста не являются обязательными и проводятся только на коммерческой основе в частных лабораториях. Показаниями для проведения тестов QuntiFeron-ТВ и T-SPOT-TB вне организма человека являются наличие у пациента ВИЧ-инфекции, возраст детей до четырёх лет, атопический дерматит, планирование трансплантации органов и тканей, анти-ФНО-терапия и наличие почечной недостаточности.

Согласно Приказа МЗРФ №951 от 29.12.2014г. "Об утверждении методических рекомендаций по совершенствованию диагностики и лечения туберкулеза органов дыхания":

V. Иммунодиагностика туберкулеза органов дыхания

1. Иммунодиагностика (специфические диагностические тесты с применением антигенов микобактерий туберкулеза) проводится с целью выявления сенсибилизации организма (инфицирования) к микобактериям туберкулеза. Иммунодиагностика подразделяется на массовую и индивидуальную.

Проведение массовой иммунодиагностики в условиях медицинских организаций общей лечебной сети обеспечивает скрининг детского населения на туберкулез.

Для проведения иммунодиагностики применяются:

• аллерген туберкулезный очищенный жидкий в стандартном разведении (очищенный туберкулин Линниковой — ППД-Л), биологическая активность которого измеряется в туберкулиновых единицах (ТЕ);
• аллерген туберкулезный рекомбинантный в стандартном разведении (белок СFР10-ЕSАТ6 0,2 мкг.).

• Пробу Манту с 2 ТЕ ППД-Л проводят один раз в год всем детям с 12 месячного возраста до 7 лет включительно (при отсутствии вакцинации БЦЖ (БЦЖ-М) - с 6-месячного возраста 2 раза в год).
• Пробу с аллергеном туберкулезным рекомбинантным в стандартном разведении (белок СFР10-ЕSАТ6 0,2 мкг.) проводят один раз в год всем детям с 8 лет до 17 лет включительно.
• Детям с 12 месячного возраста до 7 лет включительно по показаниям (инфицирование МБТ) проводится проба с аллергеном туберкулезным рекомбинантным в стандартном разведении (белок СFР10-ЕSАТ6 0,2 мкг.) наряду с пробой Манту с 2 ТЕ ППД-Л. Допускается одновременная постановка пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л и пробы с аллергеном туберкулезным рекомбинантным в стандартном разведении (белок СFР 10- ЕSАТ6 0,2 мкг.) на разных руках.
• Проба с аллергеном туберкулезным рекомбинантным в стандартном разведении (белок СFР10-ЕSАТ6 0,2 мкг.) не может быть использована для отбора лиц для вакцинации и ревакцинации БЦЖ (БЦЖ-М), однако ее результаты необходимо учитывать при принятии решения о проведении иммунизации против туберкулеза.
• Техника проведения пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л и пробы с аллергеном туберкулезным рекомбинантным в стандартном разведении (белок СFР10-ЕSАТ6 0,2 мкг.) идентична и проводится в соответствии с инструкцией по применению препарата.
• Внутрикожные иммунологические пробы проводит медицинская сестра, прошедшая инструктаж в противотуберкулезном учреждении и имеющая справку-допуск для постановки внутрикожных проб.
• Проведение проб с туберкулином и аллергеном туберкулезным рекомбинантным в стандартном разведении (белок СFР10-ЕSАТ6 0,2 мкг.) необходимо планировать до проведения профилактических прививок, предусмотренных Национальным календарем профилактических прививок. При проведении профилактических прививок до постановки иммунодиагностических проб, последние проводят не ранее, чем через месяц после вакцинации.

2. Учет и интерпретация проб с туберкулином и аллергеном туберкулезным рекомбинантным.

Результаты пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л и пробы с аллергеном туберкулезным рекомбинантным в стандартном разведении (белок СFР10-ЕSАТ6 0,2 мкг.) учитывают через 72 часа.

Результаты проб фиксируют в учетной форме № 063/у, в медицинской карте ребенка (форма № 026/у), в истории развития ребенка (форма № 112/у) и прививочном сертификате. При этом отмечают: предприятие-изготовитель препарата, номер серии, срок годности; дату проведения пробы; результат пробы - инфильтрат (папула) или гиперемии (при отсутствии инфильтрата) в мм.

2.1. Реакция на пробу Манту с 2ТЕ ППД-Л может быть:

• отрицательной - при наличии только уколочной реакции (0-1 мм);
• сомнительной — при наличии инфильтрата (папулы) 2-4 мм или гиперемии любого размера без инфильтрата;
• положительной - при наличии инфильтрата (папулы) 5 мм и более.

2.2. Реакция на пробу с аллергеном туберкулезным рекомбинантным в стандартном разведении (белок СFР10-ЕSАТ6 0,2 мкг.) может быть:

3. Обследование детей и подростков в группах риска по заболеванию туберкулезом.

Дети и подростки из групп высокого риска по заболеванию туберкулезом, не подлежащие диспансерному учету у фтизиатра:

• больные сахарным диабетом, язвенной болезнью;
• с хроническими неспецифическими заболеваниями бронхолегочной системы и почек;
• больные ВИЧ-инфекцией;
• длительно получающие иммуносупрессивную терапию (цитостатики, стероидные гормоны, активные иммунобиологические препараты и др.).

Дети из вышеперечисленных групп риска нуждаются в проведении иммунодиагностики 2 раза в год в условиях медицинских организаций.

Туберкулинодиагностика - внутрикожная проба Манту с 2 ТЕ

Туберкулиновая проба Манту, в просторечье “пуговка” - это специфический диагностический тест (не путать с прививкой!), применяемый при массовом обследовании населения на туберкулез.

Для проведения туберкулиновых проб используют туберкулин, который по своему составу является сложным соединением. Он не содержит живых или убитых микобактерий туберкулеза, а только продукты их жизнедеятельности, элементы микробной клетки и часть среды, на которой росли микобактерии туберкулеза.

На введение туберкулина возникает ответная аллергическая реакция (положительная туберкулиновая проба) у привитых вакциной БЦЖ против туберкулеза (поствакцинальная аллергия) и у инфицированных микобактериями туберкулеза (инфекционная аллергия). В обоих случаях в организме обследуемого находятся туберкулезные палочки. Только в первом случае они внесены с вакциной BCG и поддерживают иммунитет к туберкулезу, а в другом попали в организм из окружающей среды и являются вирулентными, т.е. в определенных условиях могут вызвать заболевание.

Учитывая такую низкую специфичность (то есть проба положительная и у здоровых, и у больных людей), сама по себе положительная реакция Манту не является 100% доказательством инфицирования туберкулезом.

Чаще всего врачу приходится решать, что стоит за положительной реакцией - вакцинация или инфицирование. В случае неверной интерпретации он может либо необоснованно назначить профилактическую противотуберкулезную терапию, либо недооценить положительную реакцию, принять ее за проявления поствакцинальной аллергии – и опоздать с выявлением и лечением имеющегося туберкулеза.

В настоящее время разработаны более эффективные тесты, которые могут определять наличие в организме именно микобактерий туберкулеза, способных вызвать болезнь.

Внутрикожный диагностический тест с аллергеном туберкулезным ре­комбинантным – ДИАСКИНТЕСТ®

Диаскинтест® (Аллерген туберкулезный рекомбинантный в стандартном разведении) - инновационный внутрикожный иммунологический диагностический тест, который представляет собой рекомбинантный белок, содержащий два связанных между собой антигена — ESAT6 и CFP10, характерных для патогенных штаммов микобактерий туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis) 1 . Данные антигены отсутствуют в вакцинном штамме Mycobacterium bovis BCG и у большинства нетуберкулезных микобактерий, поэтому Диаскинтест® вызывает иммунную реакцию только на микобактерии туберкулеза и не дает ложной реакции, связанной с вакцинацией БЦЖ.

То есть Диаскинтест выявляет состояния, когда человек действительно нуждается в более тщательном дообследовании и проведении профилактической терапии для предупреждения развития заболевания, не зависимо от результатов вакцинации БЦЖ.

Диаскинтест® обладает практически 100% чувствительностью и специфичностью 2 , сводя к минимуму вероятность развития ложноположительных реакций 3 , и позволяет диагностировать и латентную (скрытую) инфекцию, и активный туберкулезный процесс, в том числе на ранних этапах развития.

Техника постановки Диаскинтеста и учета результатов идентичны пробе Манту с туберкулином 4 . Постановка теста не требует наличия специально оснащенной лаборатории и исключает необходимость внутривенных манипуляций, что очень важно при обследовании детей, особенно младшего возраста!

С 2017 года применение Диаскинтеста в скрининге туберкулеза у детей старше 7 лет и подростков регламентировано Приказом Минздрава России №124н от 21 марта 2017 года 5 .

Диагностические лабораторные тесты: T-SPOT.TB

T-SPOT.TB является in vitro иммунологическим диагностическим тестом, направленным на определение специфического гамма-интерферона в крови пациента, который вырабатывается, если в организме человека есть антигены ESAT-6 и CFP-10, которые характеры только для Mycobacterium tuberculosis. В тесте определяется число Т-клеток, отвечающих на стимуляцию антигенами ESAT-6 и CFP-10. Эти антигены не выявляются во всех штаммах БЦЖ и у представителей семейства нетуберкулезных микобактерий. Чувствительность и специфичность Т-SPOT.TB, так же как и Диаскинтеста, по данным исследователей превышает 90,0% 6 .

Лабораторный тест позволяет диагностировать и латентную (скрытую) инфекцию, и активный туберкулезный процесс.

Туберкулез – хроническое инфекционное заболевание, вызываемое микобактерией туберкулеза. В основном с воздушно-капельным механизмом передачи. Абсолютной восприимчивости или устойчивости к этому возбудителю у человека нет. Заболеть может каждый, особенно уязвимы дети. Поэтому меры профилактики и раннего выявления заболевания чрезвычайно важны.

В последние годы в Краснодарском крае отмечается устойчивая тенденция к снижению заболеваемости туберкулезом, вследствие улучшения ранней диагностики, адекватного лечения, постоянной работы фтизиатров в очагах туберкулеза. Но угроза болезни, особенно для детей, сохраняется. При попадании в организм микобактерия может вызвать заболевание туберкулезом или сохраняться в нем в виде латентного (скрытого) носительства, которое в любой момент может обернуться болезнью. И поэтому трудно переоценить важность ежегодной иммунодиагностики, которая позволяет или выявить заболевание на ранней стадии и соответственно вылечить ребенка с минимальными последствиями.

С целью выявления противопоказаний врач (медицинская сестра) перед постановкой туберкулиновых проб проводит изучение медицинской документации, а также опрос и осмотр подвергаемых пробе лиц.

Туберкулин вводится внутрикожно, в внутреннюю поверхность предплечья, и результат пробы оценивается через 72 часа. При постановке пробы Манту реакцию считают:

- отрицательной при полном отсутствии инфильтрата (папулы) или гиперемии или при наличии уколочной реакции (0-1 мм);

- сомнительной при инфильтрате размером 2-4 мм или только гиперемии любого размера без инфильтрата;

- положительной при наличии инфильтрата диаметром 5 мм и более. Результат пробы оценивает медицинская сестра, прошедшая инструктаж в противотуберкулезном учреждении и имеющая справку-допуск для постановки внутрикожных проб.

Детям с 8 до 17 лет включительно иммунодиагностика проводится внутрикожной пробой с препаратом Диаскинтест®, который был разработан в России. Препарат безвреден, специфичен, редко вызывает аллергические реакции. Если проба Манту выявляет наличие или отсутствие в организмк ребенка микобактерий туберкулеза, то положительная проба с Диаскинтест® указывает на их активность и нередко выявляет заболевание туберкулезом. Техника проведения пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л и пробы с аллергеном туберкулезным рекомбинантным в стандартном разведении (Диаскинтест®) идентична.

Реакция на пробу с аллергеном туберкулезным рекомбинантным в стандартном разведении (Диаскинтест®) может быть:

- отрицательной - при полном отсутствии инфильтрата и гиперемии или при наличии уколочной реакции до 2 мм или "синяка" до 1-3 мм в диаметре;

- сомнительной - при наличии гиперемии без инфильтрата;

- положительной - при наличии инфильтрата (папулы) любого размера.

Имеются временные противопоказания для постановки пробы Манту и пробы Диаскинтест® - кожные заболевания, острые и хронические инфекционные и соматические заболевания (в том числе эпилепсия) в период обострения; аллергические состояния, бронхиальная астма, идиосинкразии с выраженными кожными проявлениями в период обострения, карантин по детским инфекциям в детских коллективах, индивидуальная непереносимость туберкулина и аллергена туберкулезного рекомбинантного. После оценки результата иммунологической пробы специально обученный в противотуберкулезном диспансере медработник решает вопрос о необходимости консультации ребенка в противотуберкулезном диспансере.

Направлению в противотуберкулезный диспансер для обследования на туберкулез подлежат дети:

- с впервые положительной пробу Манту, не связанной с вакцинацией БЦЖ

- с усиливающейся чувствительностью к туберкулину (увеличение инфильтрата на 6 мм и более по сравнению с предыдущим годом);

- с гиперергической чувствительностью к туберкулину (инфильтрат 17 мм и более, везикуло - некротическая реакция или лимфангоит)

- с сомнительными или положительными реакциями на аллерген туберкулезный рекомбинантный.

При обращении в противотуберкулезный диспансер врач-фтизиатр проводит ребенку дополнительное обследование - общие анализы крови и мочи, лучевые методы исследования, при сомнительной и положительной пробе Диаскинтест® – компьютерную томографию органов грудной клетки, а также при подозрении на внелегочный туберкулез – консультации специалистов (отоларинголог, окулист, хирург), УЗИ органов брюшной полости, посевы мочи на микобактерии туберкулеза. По результатам обследования врач-фтизиатр выносит заключение о причинах измененной реакции на туберкулин, Диаскинтест®, исключить или подтвердить заболевание туберкулезом, выявить детей, которые находятся в группе риска по развитию заболевания и своевременно назначить лечение. Отказ от ежегодной иммунодиагностики подвергает ребенка риску заболеть туберкулезом в тяжелой форме и заразить болезнью детей, находящихся рядом в детском коллективе.

Заместитель главного врача по медицинской помощи в амбулаторных условиях

Иммунологические методы исследования у больных туберкулезом

Оценка состояния основных систем иммунитета, определение их клеточных структур, а также степени развития специфических иммунологических реакций могут помогать в решении ряда задач в клинике туберкулеза: активность процесса, характер течения заболевания, дифференциальная диагностика. Уточнение иммунологического статуса больного важно перед оперативным вмешательством, а также при определении показаний к назначению иммуномодуляторов.

Иммунологические методы применяют для диагностики лекарственной непереносимости, возникающей в процессе химиотерапии. Для оценки иммунного статуса больных используют набор иммунологических методов: тесты оценки состояния Т- и В-лимфоцитов и их субпопуляций (особенно регуляторных) с количественной характеристикой и определением функциональной активности иммунокомпетентных клеток, определение сенсибилизированных к соответствующим антигенам Т- и В-лимфоцитов или их продуктов (медиаторов и антител).

Ценную информацию могут дать исследования, направленные на обнаружение антигенов микобактерий или других микроорганизмов в таком наиболее доступном материале, как кровь [Авербах М. М. и др., 1984]. Важное значение имеет определение факторов неспецифической реактивности, к которым относятся, например, различные компоненты системы комплемента. Широко используются также реакции для определения функции фагоцитов (полинуклеаров и макрофагов, особенно альвеолярных) при легочных заболеваниях, а также различных сывороточных белков, гормонов и др.

Тесты количественной и функциональной оценки Т-лимфоцитов и их субпопуляций. Розеткобразование с бараньими эритроцитами. Установлено, что розетки с эритроцитами барана образуют Т-лимфоциты [Чередеев А. Н., 1976; Jondal М. et al., 1972]. Для постановки данного теста выделяют лейкоцитарную массу путем отстаивания гепаринизированной или дефибринированной крови (спонтанное отстаивание или с добавлением желатина), затем лейкоциты осаждают центрифугированием либо лимфоциты выделяют из цельной крови центрифугированием в градиенте фиколл/гепак (уротраст, изопак, верографин). После этого лимфоциты соединяют с эритроцитами барана и через определенный срок инкубации готовят мазки, которые фиксируют глутаровым альдегидом и окрашивают азурэозином (или просматривают в камере Горяева нативные препараты).

В препаратах определяют процент лимфоцитов, образовавших розетки с эритроцитами (не менее 3 эритроцитов, прикрепившихся к одному лимфоциту). Рекомендуется также пересчет количества розеткообразующих клеток в абсолютных показателях (так как число лимфоцитов в крови при различной патологии, естественно, имеет большие колебания). В норме в крови обнаруживается 50-70% розеткообразующих Т-клеток.

Для определения и подсчета Т-лимфоцитов используют моноклональные антитела (ОКТ или других серий) против маркеров Т-лимфоцитов. Проба состоит из этапов добавления моноклональных антител к взвеси лимфоцитов, антисыворотки против иммуноглобулинов, включающей, например, радиоактивную или флюоресцирующую метку, с последующей ее регистрацией.

Реакция стимуляции Т-лимфоцитов митогенами. Показано, что ряд митогенов, в первую очередь таких, как фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (кон-А), вызывают бласттрансформацию и митозы Т-лимфоцитов [Ling М., 1975]. Для постановки теста с ФГА лейкоциты или лимфоциты выделяют описанным выше способом и затем культивируют в присутствии митогена в течение 72 ч. По окончании культивирования готовят мазки, которые окрашивают азурэозином или другим методом и определяют процент властных клеток (молодых клеточных форм) и/или митозы. В норме в культурах с ФГА обнаруживается 60-95% властных клеток.

Другим способом оценки активации лимфоцитов под действием митогенов является определение включения 3Н-тимидина (или других меченых предшественников нуклеиновых кислот или аминокислот) в ДНК. 3Н-тимин добавляют в культуры лимфоцитов за 2-12 ч до конца культивирования. После инкубации клеточную массу отмывают, лизируют NaOH, тиамином или растворителем NCS (для выхода включенной радиоактивности в жидкость), помещают в сцинтилляционную жидкость и определяют число импульсов в опыте (культура с ФГА) и контроле (без ФГА) в жидкостном сцинтилляционном счетчике (например, отечественный счетчик СБС).

Определение субпопуляций Т-лимфоцитов производят различными способами. Существуют способы определения по степени связывания этих клеток с эритроцитами барана (активное, авидное, стабильное, аффинное розеткообразование, гигантские розетки и т. д.), по чувствительности к теофиллину и др. Наиболее признанным и распространенным методом является определение количества Т-хелперов (индукторов и Т-супрессоров) цитотоксических лимфоцитов по наличию на их поверхности рецепторов для Fc-фрагментов IgM и IgG (Тр и Ту-лимфоциты) [Петров Р. В. и др., 1980; Moretta A. et al., 1977].

Для постановки данного теста используют эритроциты быка, покрытые кроличьими антителами класса IgM (для определения Т-хелперов) и IgG (для определения Т-супрессоров). Реакция состоит из нескольких этапов. Вначале выделяют лимфоциты на градиенте фиколл/верографин, от макрофагоподобных примесей освобождаются при инкубации клеток на пластиковых чашках Петри. Неприлипшие лимфоциты смешивают с эритроцитами барана, обработанными нейраминидазой. После инкубации вновь отделяют на градиенте Т-лимфоциты, образовавшие розетки с эритроцитами (в осадке при центрифугировании), от В-лимфоцитов (в интерфазе).

Этот этап можно повторить для лучшей очистки. Розетки разделяют хлоридом аммония или дистиллированной водой, и освобожденные Т-лимфоциты используют в реакции розеткообразования с эритроцитами быка с IgGантителами для определения Ту-лимфоцитов (супрессоров). После 12-часовой инкубации в термостате в культуральной среде, содержащей 15-20% телячьей эмбриональной сыворотки и некоторые добавки, для восстановления IgM-рецепторов Т-клетки используют в реакции розеткообразования с эритроцитами быка, покрытыми IgM-антителами для определения Т-лимфоцитов (хелперов).

Для функциональной оценки субпопуляций Т-хелперов и Т-супрессоров можно разделить эти клетки (после постановки реакций розеткообразования) центрифугированием в том же градиенте фиколя/верографин как это описано выше (см. выделение чистой взвеси Т-лимфоцитов). Получены моноклональные антитела (например, ОКТ4 и ОКТ8 или других серий) для определения Т-хелперов или Т-супрессоров.

Определение супрессорной активности лимфоцитов (мононуклеаров) [по Петрову Р. В. и др., 1980]. Супрессивная активность мононуклеаров может быть определена при активации кон-А, используемого в относительно высокой концентрации или в так называемом спонтанном варианте. В первом случае испытывается действие на реакцию стимуляции тест-лимфоцитов в культуре с ФГА. Лимфоциты выделяют из крови больного (в градиенте фиколл/верографин), инкубируют в течение 24 ч в культуральной среде в присутствии кон-А, затем их рост останавливают митомицином С.

Во втором случае применяют свежевыделенные лимфоциты больного, обработанные митомицином С и предварительно неинкубированные. Тест-лимфоцитами могут служить аутолимфоциты, свежевыделенные из крови больного, либо лимфоциты донора. В разных количествах их смешивают с лимфоцитами, супрессивное действие которых используется, и определяют их активность в стимуляции бласттрансформации или синтеза ДНК в стандартной реакции с ФГА.

По данным Р. В. Петрова и соавт. (1980), у здоровых людей примерно в 13% случаев может быть обнаружена не супрессия, а активация пролиферации тест-лимфоцитов в указанных условиях. Mizarski и соавт. (1981) указывают, что активация чаще происходит при использовании низких концентраций кон-А (5 мкг/мл), при повышении дозы (до 20 мкг/мл) активация может проявляться только при уменьшении (до 24 ч) времени инкубации. Czernicki и соавт. (1981) при обработке мононуклеаров 40 мкг/мл кон-А ни в одном случае не обнаружили активацию. Для оценки специфического клеточного противотуберкулезного иммунитета чаще используют реакции стимуляции лимфоцитов туберкулином (ППД) и торможения миграции лейкоцитов с тем же антигеном.

Реакция стимуляции лимфоцитов с ППД служит для определения степени сенсибилизации к микобактериальным антигенам (реакция обусловлена взаимодействием Т-клеток с ППД). Методика постановки реакции при морфологическом учете бласттрансформации или при оценке степени синтеза ДНК не отличается от учета реакции с ФГА (срок культивирования 96 ч, доза ППД варьирует от 10 до 200 мкг). У здоровых туберкулинотрицательных людей показатель реакции обычно не превышает 1% (при морфологическом учете).

Реакция торможения миграции с ППД предназначена для тех же целей, что реакция бласттрансформации. Лейкоциты получают, центрифугируя плазму, выделенную из крови одним из описанных выше методов (см. постановку реакции бласттрансформации с ФГА). Осадок лейкоцитов набирают в стеклянные капилляры диаметром 1 мм, центрифугируют в них и помещают в культуральные камеры, содержащие питательную среду (контроль) и ППД (опыт). Результат реакции оценивают через 24 ч по соотношению площадей, занимаемых мигрирующими клетками в опыте и контроле. ППД применяют в концентрации 100-200 мкг/мл. У здоровых людей индекс реакции обычно варьирует от 0,8 до 1,2 (в зависимости от дозы антигена и наличия сенсибилизации клеток). Применяют также иные варианты метода, например миграцию лейкоцитов в агарозе [Стрельцов В. П., Владимирский М. А., 1977].

Тесты оценки количества и реактивности В-клеток. Комплементарные розетки. Установлено, что в присутствии комплекса эритроциты — антисыворотка и комплемент розетки с эритроцитами (например, человека) образуют В-лимфоциты [Mendes М. et al., 1973]. Для постановки данного теста лимфоциты выделяют теми же способами, которые описаны выше. Затем тест-эритроциты человека (лучше с кровью группы 0) инкубируют с антиэритроцитарной сывороткой (получаемой от кроликов, иммунизированных эритроцитами человека). Следующий этап — инкубация эритроцитов, нагруженных антиэритроцитарными антителами, с комплементом (источник комплемента — донорская сыворотка крови человека). После этого готовую систему эритроциты — антитела к ним и комплемент соединяют с испытуемыми лимфоцитами, фиксируют их глутаровым альдегидом, делают мазки. Последний этап — окраска и подсчет розеткообразующих лимфоцитов — осуществляют тем же способом, что и при определении Т-розеток. В норме в периферической крови обнаруживают 10-20% комплементарных розеток.

Существуют и другие способы определения и подсчета В-лимфоцитов, основанные на выявлении поверхностных маркеров этих клеток, например по наличию иммуноглобулиновых рецепторов с использованием системы эритроциты + антитела в методе розеткообразования. В-лимфоциты также могут образовывать розетки с эритроцитами мышей, в норме обнаруживается примерно 15-20% таких В-клеток. В последние годы появилась возможность определять количество В-клеток с помощью моноклональных антител, полученных против их маркеров, аналогично определению других популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток.

Определение иммуноглобулинов сыворотки крови методом иммунодиффузии по Mancini и соавт. (1965). Содержание иммуноглобулина в периферической крови отражает функцию В-клеток, поскольку данные белки являются продуктами клеток этой популяции. Для постановки теста исследуемые сыворотки помещают в лунки в агаровом геле, содержащем антииммуноглобулиновые сыворотки (анти-IgG, IgM, IgA). Результат реакции оценивают, измеряя диаметр колец преципитации, после чего вычерчивают график зависимости квадратов радиусов колец преципитации от концентрации исследуемого иммуноглобулина в стандартной сыворотке. Вычислив квадрат радиуса кольца преципитации исследуемой сыворотки и антисыворотки и отложив это значение на графике, можно узнать количество иммуноглобулина в каждой исследуемой сыворотке. Необходимо помнить, что нормальное количество иммуноглобулинов различных классов у здоровых людей варьирует в зависимости от возраста.

Реакция стимуляции В-лимфоцитов липополисахаридом (ЛПС). Известно, что существует ряд митогенов, которые вызывают трансформацию В-клетки (например, ЛПС Е. coli, S. marcesscens, декстрансульфат). Для постановки этого теста лейкоциты и лимфоциты получают описанным выше способом, затем их инкубируют с ЛПС в течение 72-96 ч и готовят мазки, в которых определяют число бластных клеток. Можно также учитывать активность В-лимфоцитов по степени включения 3Н-тимидина, как это описано для постановки РБТ с ФГА. Специфический гуморальный иммунитет можно оценить по количеству антител к антигенам микобактерий, выявляемых в сыворотке крови больных с помощью различных сывороточных тестов.

Реакция агрегатгемагглютинации. Данная реакция является высокочувствительным вариантом реакции пассивной (непрямой) гемагглютинации. Эритроциты обрабатывают глутаровым альдегидом, затем нагружают туберкулином (ППД). В модификации реакции гемагглютинации Миддлбрука — Дюбо туберкулином нагружают нативные, а в модификации Бойдена — обработанные таннином эритроциты. Затем эритроциты соединяют с сывороткой, в которой выявляют противотуберкулиновые антитела. Диагностическим титром, по данным разных авторов, считается 1:8-1:16.

Реакция потребления комплемента (РПК) является модификацией реакции связывания комплемента. В отличие от последней в ней используют комплемент, имеющийся в сыворотке, в связи с чем сыворотки не подвергаются температурной инактивации. Это выгодно отличает данную реакцию от ее прототипа, поскольку температурная обработка нередко снижает титр антител. РПК проводят в два этапа. Первый — взаимодействие антител, имеющихся в сыворотке крови больного, и антигена (например, ППД) и присоединения к комплексу антиген — антитело комплемента, содержащегося в исследуемой сыворотке.

Определение иммунных розеткообразующих лимфоцитов. Эта методика служит для количественного определения В-лимфоцитов, специфически сенсибилизированных к антигенам микобактерий. Лимфоциты выделяют обычным способом. Эритроциты человека (лучше с кровью группы 0) обрабатывают таннином и ППД. Как и в описанных выше других модификациях теста розеткообразования, эритроциты соединяют с лимфоцитами и определяют число розеток в окрашенных препаратах [Вахидова Г. А., 1977]. У здоровых людей обнаруживается 1-3% таких розеток.

Туберкулинпровокационные тесты. Информативность различных иммунологических методов в значительной степени повышается, если постановку тестов на специфический гуморальный (например, РАГА) и/или клеточный (например, РБТ и РТМ) иммунитет сочетать с подкожным введением ППД (провокация). Иммунологические реакции ставят до и через 48 ч после подкожного введения ППД (в среднем 20 ТЕ детям и 50-100 ТЕ взрослым) [Гергерт В. Я., Борзенко А. С., 1973; Гергерт В. Я., 1984].

А. Е. Рабухин и соавт. (1980), С. М. Лобанова (1982) успешно применили иммуноглобулино-туберкулиновую пробу. Авторы определяли количество иммуноглобулинов классов G, А и М до подкожной провокации ППД, через 48 ч после нее и повторно через 7 дней. Также определяют число иммунных розеткообразующих лимфоцитов в сочетании с подкожной провокацией ППД. Интерпретация результатов иммунологического исследования при туберкулезе приносит наибольшую пользу, если она осуществляется в сопоставлении с клинической характеристикой.

При активном туберкулезе показатели специфических иммунологических тестов обычно бывают положительными. В различные фазы течения активного туберкулеза эти показатели могут значительно варьировать. Так, по результатам, полученным при использовании реакций бласттрансформации и торможения миграции с ППД, первая реакция наиболее выражена при благоприятном течении процесса с быстрым рассасыванием специфических поражений (показатели более 10% властных клеток), а вторая — при прогрессирования процесса (индекс ниже 0,4-0,5) и наоборот. Наиболее высокие титры противотуберкулезных антител (1:256-1:1024) встречаются при выраженной активности процесса и начавшейся положительной динамике.

В эти же сроки можно отметить и самый высокий процент (5-10) обнаружения иммунных розеткообразующих лимфоцитов. По данным В. Я, Гергерта (1984), при вспышке заболевания уровень бластообразования в ответ на ФГА и число Т-розеткообразующих лимфоцитов оказываются сниженными (соответственно 45-60% и 35-50%). В активной фазе туберкулеза несколько повышены (15-25%) содержание В-розеткообразующих лимфоцитов и уровень иммуноглобулинов некоторых классов (чаще IgA и IgG).

Выявление скрытой активности. При минимальной активности туберкулезного процесса показатели иммунитета в основном нормализуются и приближаются по своим значениям к значениям, характерным для лиц с неактивными изменениями или для здоровых людей. В указанный период патологического процесса обычно не отмечается нарушений общих механизмов клеточного и гуморального иммунитета по количественным и функциональным характеристикам, показатели специфических тестов могут быть незначительно более выраженными (РБТ и уровень противотуберкулезных антител) по сравнению с таковыми при неактивном процессе или отрицательными (РТМ).

С помощью так называемых туберкулинпровокационных иммунологических тестов минимальную активность можно установить быстро и в достаточно высоком проценте случаев (75-90, по данным разных авторов). Обычно для этого применяют специфические клеточные иммунологические реакции в сочетании с подкожным введением ППД [Гергерт В. Я., Борзенко А. С., 1973; Рудой Н. М. и др., 1979; Гергерт В. Я., 1984]. Через 48 ч после такой провокации изменение показателей РБТ с ППД в сторону снижения не менее чем на 20% от первоначального уровня и уменьшение индекса РТМ с ППД не менее чем на 0,11 и ниже 0,8 указывают на наличие такой активности.

Иммуноглобулино-туберкулинпровокационный тест применялся [Лобанова С. М., 1982] для оценки активности туберкулеза легких, при этом учитывались изменения уровня иммуноглобулинов, особенно через 2 сут и неделю после провокации. Постепенное нарастание количества этих белков свидетельствует об отсутствии активности патологического процесса, а резкое повышение (через 48 ч) с последующим снижением (через 7 дней) — о ее наличии.

При успешной химиотерапии нарушения характеристик различных систем иммунокомпетентных клеток, как правило, быстро ликвидируются, а показатели специфических иммунологических тестов претерпевают описанные выше изменения, соответствующие благоприятному течению туберкулеза. Наблюдение в динамике позволяет контролировать эффективность лечения. Быстрое и эффективное восстановление показателей иммунитета совпадает по срокам (а иногда и предшествует) с быстро наступающей положительной динамикой. Сохранение нарушений иммунитета, как правило, наблюдается при торпидном, затяжном течении туберкулеза и неэффективной химиотерапии. Так, если в процессе лечения не восстанавливаются до нормы количество и функциональная активность Т-лимфоцитов, у таких больных возможны обострения. Стойкое сохранение подобных дефектов после окончания основного курса лечения должно настораживать клинициста в отношении появления рецидивов.

Иммунологическое исследование, безусловно, необходимо для определения показаний к назначению различных иммуномодуляторов (левамизол, диуцифон, тималин, Т-активин и др.) в комплексном лечении туберкулеза легких, а также в процессе этого лечения с целью контроля эффективности подобной терапии [Хоменко А. Г. и др., 1984; КнорингБ. Е. и др., 1984; Гергерт В. Я. и др., 1986].

Читайте также:

• Беременность после туберкулеза легких какие симптомы возобновились
• Туберкулез глаз реферат список литературы
• Анализ крови при туберкулезном лимфадените
• Вакцина туберкулезная сухая это
• Жидкое мыло против туберкулеза

Пн	Вт	Ср	Чт	Пт	Сб	Вс