Материал для микробиологического исследования туберкулеза

Сбор диагностического материала. Эффективность лабораторных исследований в значительной степени зависит от качества диагностического материала. Соблюдение правил сбора, хранения и транспортировки диагностического материала и точное выполнение алгоритма обследования больных непосредственно влияет на результат и обеспечивает биологическую безопасность.

Для исследования на туберкулез используют разнообразный материал. В связи с тем что туберкулез легких - самая распространенная форма туберкулезного поражения, основным материалом для исследования считают мокроту и другие виды отделяемого трахеобронхиального дерева: отделяемое верхних дыхательных путей, полученное после аэрозоль-ингаляций: промывные воды бронхов; бронхоальвеолярные смывы; материал, получаемый при бронхоскопии, транстрахеальной и внутрилегочной биопсии: аспират из бронхов, ларингеальные мазки, экссудаты, мазки из ран и др.

Эффективность исследований возрастает, если проводят контролируемый сбор материала от больного. Для этого выделяют специально оборудованную комнату или закупают специальные кабины ( рис. 13-1 ). Сбор материала - опасная процедура, поэтому собирать материал для исследования нужно, соблюдая правила инфекционной безопасности.

Материал для исследования на микобактерии туберкулеза собирают в стерильные флаконы с плотно завинчивающимися крышками, чтобы предотвратить заражение окружающей среды и предохранить собранный материал от загрязнения.

Флаконы для сбора диагностического материала должны отвечать следующим требованиям:

- должны быть изготовлены из ударостойкого материала;

- не должны легко расплавляться при автоклавировании;

- быть достаточного объема (40-50 мл):

- иметь широкое отверстие для сбора мокроты (диаметр не менее 30 мм);

- быть удобными в обращении, прозрачными или полупрозрачными, чтобы можно было оценить количество и качество собранной пробы, не открывая крышку.

Для получения оптимальных результатов исследования необходимо соблюдать следующие условия:

- сбор материала проводить до начала химиотерапии;

- материал для исследования необходимо собирать до утреннего приема пиши и лекарственных препаратов;

- для исследования желательно собрать не менее 3 проб утренней мокроты. Собирают мокроту в течение 3 дней подряд;

- собранный материал необходимо как можно быстрее доставить в лабораторию:

- в случае, когда доставить материал в лабораторию немедленно невозможно, его сохраняют в холодильнике при температуре воздуха 4*С не более 48 ч;

- при перевозке материала необходимо особенно тщательно следить за целостностью флаконов.

Правильно собранная мокрота имеет слизистый или слизисто-гнойный характер. Оптимальный объем исследуемой порции мокроты составляет 3-5 мл.

Мокроту собирают под надзором медицинского работника. Лицам, ответственным за сбор мокроты, необходимо следить за выполнением определенных правил:

- нужно объяснить больному цели исследования и необходимость откашливать не слюну или носоглоточную слизь, а содержимое глубоких отделов дыхательных путей. Этого можно добиться в результате продуктивного кашля , возникающего после нескольких (2-3) глубоких вдохов. Нужно также предупредить больного, что он должен предварительно прополоскать рот кипяченой водой, для удаления основной части вегетирующей в ротовой полости микрофлоры и остатков пищи, затрудняющих исследование мокроты;

- участвующий в сборе мокроты медицинский работник, помимо халата и шапочки, должен надеть маску, резиновые перчатки и резиновый фартук;

- стоя позади больного, ему рекомендуют держать флакон как можно ближе к губам и сразу же отделять в него мокроту по мере ее откашливания, при этом необходимо предусмотреть, чтобы поток воздуха был направлен в сторону от медработника:

- по завершении сбора мокроты медицинский работник должен тщательно закрыть флакон крышкой и оценить количество и качество собранной мокроты. Затем флакон маркируют и помещают в специальный бокс для транспортировки в лабораторию.

Если больной не выделяет мокроту, то накануне вечером и рано утром в день сбора материала нужно дать ему отхаркивающее средство: экстракт корней алтея лекарственного ( мукалтин ), бромгексин , амброксол и др. - или применить раздражающую ингаляцию, используя оборудование, установленное в комнате для сбора мокроты. Собранный таким образом материал не подлежит консервации и должен быть исследован в день сбора. Во избежание его "выбраковки" в лаборатории в направлении следует сделать специальную отметку.

Если в данном учреждении не проводят микробиологические исследования, собранный диагностический материал должен быть централизованно доставлен в лабораторию при условии обязательного сохранения материала в промежутках между доставками в холодильнике или с применением консервантов. Доставляют материал в лабораторию в транспортировочных ящиках, которые легко можно продезинфицировать. Каждая проба должна быть снабжена соответствующей этикеткой, а вся партия - заполненным сопроводительным бланком.

Туберкулез является одним из самых распространенных в мире заболеваний человека и животных и продолжает оставаться основной причиной смерти среди всех инфекционных заболеваний. Возбудители туберкулеза попадают в организм человека еще в детстве и, в последующем, эта встреча всегда заканчивается нанесением ущерба его целостности.

Диагностика туберкулеза основана на обнаружении возбудителей в биологическом материале и специфических изменений в пораженных органах больного. Своевременное выявление туберкулеза позволяет излечить больного в кратчайшие сроки с минимальным ущербом для его здоровья и обеспечивает прекращение инфицирования возбудителями окружающих.

При первой встрече с больным врач выявляет жалобы больного, опрашивает его с целью получения сведений о развитии заболевания и жизни, осматривает больного, использует физикальные методы обследования.

Правильно собранный анамнез — залог постановки диагноза в кратчайшие сроки и начала адекватного лечения.

Выявление и диагностика туберкулеза с применением бактериологических методов

При подозрении на туберкулез органов дыхания для анализа берется мокрота и материал, собранный при бронхологическом исследовании.

Анализ мокроты проводится при обращении больного к врачу с жалобами, подозрительными на туберкулез. Собирается не менее 3-х порций мокроты.

Материалом для микробиологического исследования являются промывные воды желудка у детей с туберкулезом легких и бронхов, так как дети младшего возраста мокроту не откашливают, а проглатывают.

Рис. 1. На фото комната для сбора мокроты.

При локализации процесса в любом другом органе материалом для проведения анализа на туберкулез могут быть самые разнообразные жидкие среды организма: спинномозговая жидкость, жидкость из плевральной полости, полости сустава, жидкость из брюшной полости, кровь и отделяемое из ран и свищей.

Материалом для проведения анализа на туберкулез могут быть кусочки ткани пораженного органа, полученных при биопсии и в ходе оперативного вмешательства, при пункциях лимфоузлов и соскобах, пунктат костного мозга.

Рис. 2. На фото слева — плевральная пункция, справа — пункция спинного мозга.

При подозрении на туберкулез мочевыделительной и половой систем для микробиологического исследования берется моча, собранная утром (после ночного сна). Наилучший вариант – это собранная средняя порция утренней мочи. Для сбора анализа используется стерильная посуда. Перед сбором мочи проводится тщательный туалет наружных половых органов.

Рис. 3. На анализ собирается средняя порция утренней мочи.

При подозрении на туберкулез женских половых органов для проведения микробиологического исследования берется менструальная кровь, собранная при помощи колпачка Кафки.

Анализ на туберкулез методом прямой бактериоскопии является наиболее простым и быстрым способом обнаружения микобактерий в исследуемом материале. Выявить наличие возбудителя можно в течение 1-го часа. При использовании этого метода обнаружение микобактерий возможно только при условии их содержания не менее 10 тыс. микробных тел в 1 мл материала. Поэтому отрицательный результат еще не служит основанием для исключения диагноза туберкулеза. К тому же на результативность анализа влияет качество диагностического материала.

Рис. 4. Для выявления микобактерий туберкулеза в мокроте и другом биологическом материале используется методика выявления возбудителя в мазке — прямая бактериоскопия (слева) и люминесцентная микроскопия (справа).

Рис. 5. Для выявления микобактерий туберкулеза в мокроте и другом биологическом материале используется методика выявления возбудителя при посевах материала на питательные среды. На фото слева виден рост колоний микобактерий на яичной среде Лёвенштейна-Йенсена. На фото справа колонии микобактерий.

Диагностика туберкулеза с применением методики ПЦР является самым перспективным в современных условиях. Высокая чувствительность теста позволяет выявлять ДНК МБТ в различном биологическом материале, что особо важно при диагностике внелегочных форм туберкулеза. Микобактерии выявляются, если в исследуемом материале их несколько десятков. Данный метод диагностики не заменяет культуральный метод.

Применение автоматизированных систем культивирования микобактерий MGIT-BACTEC-960 и MB/Bact значительно сокращает время выявления роста микобактерий, которое составляет в среднем 11 — 19 дней. Однако высокая стоимость сложного оборудования и требование наличия квалифицированного персонала исключает в настоящее время в РФ широкую реализацию этого метода диагностики.

Чувствительность методов диагностики туберкулеза:

• ПЦР — 75 %,
• BACTEC — 55,8%,
• культуральный метод — 48,9%,
• микроскопия — 34%.

Среднее время обнаружения МБТ разными методами диагностики туберкулеза:

• методом посева — 24 дня,
• ВАСТЕС — до 14 дней,
• ПЦР — 1 день.

Рис. 6. На фото слева автоматизированная система BACTEC MGIT с использованием жидкой питательной среды для выделения туберкулезных палочек. На фото справа рост микобактерий на жидкой среде (бульонная культура). Стрелками указаны колонии возбудителей.

Диагностика туберкулеза с применением других методик

Методы лучевой диагностики туберкулеза значительно обогатили знания врачей общей практики и фтизиатров в отношении выявления, проявлений и течения разнообразных форм заболевания. Они включают в себя методы флюорографии, рентгенографии, различные виды томографий.

Рис. 8. На фото рентгеновские аппараты мобильные (палатные) цифровые.

Рис. 9. На фото компьютерные томографы.

Бронхологические методы диагностики туберкулеза

Применение бронхоскопии позволяет производить осмотр трахеи и бронхов с забором диагностического материала под наркозом (РБС) и без наркоза (ФБС), а так же проводить лечебные процедуры.

Рис. 10. На фото бронхоскоп (слева). Проведение бронхоскопии — справа.

Рис. 11. На фото слева язвенный туберкулез правого главного бронха, который развился вследствие прорыва в бронх казеозных масс из пораженных внутригрудных лимфатических узлов (свищевое отверстие указано стрелкой). Справа — легочное кровотечение.

Исследование функции внешнего дыхания при диагностике туберкулеза

Спирометрия является неотъемлемой частью комплексного клинического исследования. С ее помощью производится диагностика нарушений вентиляционной функции легких, выявляется тип и тяжесть нарушений, оценка эффективности проводимой терапии.

Рис. 12. На фото проведение исследования функции внешнего дыхания.

Игловые методы исследования при диагностике туберкулеза

Пункция плевральной полости и трансторакальная игловая аспирационная биопсия широко применяется во фтизиатрии. Изучение полученного патологического материала помогает установить или уточнить диагноз.

Рис. 13. На фото прокол грудной клетки с целью получения клеточного материала из легочной ткани.

Открытые диагностические операции как метод диагностики туберкулеза

Открытые диагностические операции проводятся в случае, когда другие методы диагностики туберкулеза оказались малоинформативными. Чаще всего проводится биопсия лимфатических узлов. Реже — диагностическая торакотомия (вскрытие грудной полости) с биопсией ткани легкого и плевры.

Рис. 14. На фото открытая биопсия лимфоузлов (слева) и торакотомия (слева).

Эндохирургические операции при диагностике туберкулеза

Открытые эндохирургические операции проводятся в случае, когда другие методы диагностики туберкулеза оказались малоинформативными. Используются проколы или небольшие разрезы грудной клетки с последующим вводом оптических приборов. Исследование плевральной полости (плевроскопия) и средостения (медиастиноскопия) с забором диагностического материала широко применяются во фтизиатрии.

Рис. 15. На фото слева торакоскопия с последующей биопсией лимфоузла средостения. Справа — трансбронхиальная биопсия легких.

Своевременное выявление больных туберкулезом — основная мера профилактики заболевания

Своевременное выявление туберкулеза позволит излечить больного в кратчайшие сроки с минимальным ущербом для здоровья больного. Несвоевременное выявление заболевания, когда поражены обширные участки органа с наличием очагов деструкции и массивным бацилловыделением, излечить тяжело, а подчас и невозможно. Такие больные являются особо опасными для окружающего их населения.

Задачи по выявлению больных туберкулезом возложены на врачей общей лечебной сети. Выявлять заболевание предписано при профилактических осмотрах, у больных, обратившихся за медицинской помощью в поликлинику и у больных, находящихся на стационарном лечении по поводу других заболеваний. Врачи общей лечебной сети обязаны знать симптомы туберкулеза, правильно опрашивать и осматривать больных, обследовать с применением лучевых методов диагностики, микробиологических и бронхологических.

Массовые флюорографические осмотры взрослого и подросткового населения используются в РФ для раннего, своевременного выявления туберкулеза. Туберкулинодиагностика — основной метод выявления инфицированных микобактериями лиц с повышенным риском заболевания и больных туберкулезом детей. Для проведения туберкулинодиагностики применяется реакция Манту (проба Манту). Она является единственным методом раннего выявления заболевания у детей.

Своевременное выявление заболевания и адекватное лечение приводит к тому, что больные быстро становятся незаразными и окончательно излечиваются в установленные сроки.

Рис. 16. Реакция Манту (проба Манту) является единственным методом раннего выявления туберкулеза у детей.

Рис. 17. Для выявления заболевания в массовом порядке используются передвижные (справа) и стационарные (слева) флюорографические установки.

Своевременное выявление и диагностика туберкулеза, адекватное интенсивное лечение поможет снизить число инфицированных туберкулезом и предупредить появление новых случаев заболевания.

Туберкулез - общее инфекционное заболевание с преимущественной локализацией процесса в легких. При туберкулезе также поражаются лимфатические узлы, серозные оболочки, пищеварительный тракт, урогенитальная система, кожа, кости и суставы (туберкулез внелегочной локализации).

Материал для исследования: мокрота, слизь с задней стенки глотки, промывные воды бронхов и желудка, моча, спинномозговая жидкость, плевральный экссудат, гной из абсцессов и др.

Больной собирает мокроту в чистую баночку или карманную плевательницу. Лучшие результаты дают исследования мокроты, выделенной больным в течение полусуток. На баночку наклеивают бумажку с фамилией и инициалами больного, заполняют специальный сопроводительный бланк (фамилия и инициалы больного, диагноз, группа диспансерного учета, цель исследования) и направляют в лабораторию.

В микробиологической диагностике туберкулеза используют бактериоскопический, бактериологический и биологический методы, а также комплекс иммунологических исследований.

Бактериоскопический метод

Туберкулезные микобактерииокрашиваются в красный цвет, все остальные элементы мокроты и другие бактерии — в синий. Туберкулезные микобактерии имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке.

При окраске по Цилю—Нильсену в красный цвет окрашиваются также кислотоустойчивые сапрофиты. Они находятся в почве, воде, молоке, масле, сметане, коже здоровых людей, желудке и т.д. При окраске по Цилю—Нильсену их трудно отличить от МБТ. Кислотоустойчивые сапрофитные бактерии окрашиваются в вишневокрасный цвет, но теряют свою окраску при длительном обесцвечивании солянокислым спиртовым раствором (от 3 ч до суток) или 0,01% раствором гипохлорита калия (КС10). Кислотоустойчивые сапрофиты в отличие от МБТ толстые, грубые, короткие, незернистые, иногда со вздутиями на концах, заостренные или веретенообразные, располагаются чаще кучками. Необходимо помнить, что аэробный микроорганизм Нокардиа (Nocardia asteroides), имеющий нежные, палочковидные, разветвляющиеся волокна диаметром 1 мкм, попадает в легкие при вдыхании воздуха и также затрудняет бактериоскопическую диагностику.

Кислотоустойчивая сапрофитная флора отличается от МБТ культуральными и биохимическими свойствами.

Положительное заключение выдают при обнаружении микобактерии туберкулеза в препарате после просмотра не менее 100 полей зрения: обязательно указывают число микробов в поле зрения. Отрицательный результат микроскопии необязательно должен свидетельствовать об отсутствии микобактерии в исследуемом материале.

Метод люминесцентной микроскопии

Препараты мокроты и промывных вод бронхов можно исследовать люминисцентным методом.

Принцип. Туберкулезные микобактерии, окрашенные ауромином-родамином, люминесцируют под влиянием ультрафиолетовых лучей в виде светящихся золотистых палочек (метод менее трудоемкий и более быстрый, чем предыдущие).

Мазки-препараты приготовляют из осадка, полученного методом накопления, фиксируют проведением через пламя. Мазки окрашивают в течение 15 мин смесью растворов флюорохромных красителей: на 1000 мл дистиллированной воды 1,0 ауромина 00 и 0,1 родамина С. После окраски мазок обесцвечивают 3% раствором соляно-кислого спирта в течение 30 сек, промывают водой. Если фон мазка сильно флюоресцирует, следует применить в качестве гасителя 0,25% водный раствор метиленового синего, промыть мазок водой, подсушить и микроскопировать в люминесцентном микроскопе. Микобактерии светятся золотисто-желтым светом на темно-зеленом фоне. Положительный ответ выдается, если в препарате обнаружено не меньше 4—5 палочек. При наличии 1—2 палочек в препарате анализ следует повторить.

Окраска ауромином-родамином, кроме того, выявляет нежизнеспособные МБТ. При окраске по Цилю—Нильсену они не выявляются, поэтому для оценки прогноза все аурамин-родамин позитивные пробы должны быть окрашены также и по Цилю—Нильсену.

Окрашивание ауромином-родамином имеет следующие преимущества перед окраской по Цилю—Нильсену:

1. кислотоустойчивые бациллы имеют большее сродство к ауромин-родаминовой окраске;

2. весь мазок может быть просмотрен при небольшом увеличении;

3. на темном фоне во флюоресцентном микроскопе МБТ выделяются более четко, и это позволяет быстрее и точнее просмотреть весь мазок.

При люминесценции кислотоустойчивые сапрофиты имеют бледно-желтый или зелено-желтый оттенок свечения, отличающийся от золотисто-оранжевого свечения МБТ.Исследуемую мокроту переносят в чашку Петри, с помощью препаровальных игл или пинцета выбирают гнойные комочки и переносят их на середину предметного стекла, накрывают комочек другим предметным стеклом и растирают материал между стеклами. Спинномозговую жидкость отстаивают в холодильнике и готовят мазки из нежной пленки фибрина. Мочу центрифугируют и делают мазки из осадка. Препараты обесцвечивают не только кислотой, но и спиртом для дифференциации от M.smegmatis, которые могут находиться в моче здоровых лиц.

Гомогенизация. Собрать в банку суточное количество мокроты и добавить равный объем 1% NaOH, закрыть стерильной резиновой пробкой и встряхивать в шюттель-аппарате до полного разжижения мокроты. Обычно для этого требуется 10-15 мин. Гомогенизированную мокроту переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3000 оборотов в минуту в течение 10-15 мин. Жидкость сливают в раствор хлорамина, осадок нейтрализуют 1-2 каплями 10% раствора НСl, из осадка приготовляют мазки, окрашивают по Цилю-Нильсену и микроскопируют.

Флотация. Мокроту переливают в колбу, прибавляют равный объем 1% раствора NaOH, закрывают резиновой пробкой и встряхивают в шюттель-аппарате до полного разжижения. Колбу помещают в водяную баню 55°С и нагревают в течение 30 мин. а затем добавляют 1-2 капли ксилола или бензина, встряхивают 10 мин, доливают дистиллированную воду до горлышка колбы и оставляют при комнатной температуре на 25-30 мин.

Углеводород всплывает на поверхность и увлекает адсорбированные микобактерии. Образуется тонкий слой углеводорода и возбудителей туберкулеза в горлышке колбы в виде сливкообразного кольца.

На хорошо нагретую водяную баню кладут обычное стекло 20х20 см и на нем раскладывают предметные стекла для мазков. Проволочной петлей в форме улитки берут материал флотационного кольца и наносят на предметные стекла, по мере подсыхания материала добавляют новую порцию взвеси. Наслоение материала по принципу толстой капли на одно и то же место делают 3-4 раза, каждую каплю подсушивают, прежде чем наносят следующую.

Готовые, хорошо высушенные препараты промывают эфиром (огнеопасно!), подсушивают, фиксируют, окрашивают и бактериоскопируют.

Исследование промывных вод бронхов или желудка выполняют после нейтрализации материала 1-2 мл 0.5% раствора NaOH.

Флотация повышает на 10% обнаружение микобактерии туберкулеза в патологическом материале.

Бактериоскопическим методом удается обнаружить возбудителя туберкулеза при содержании в 1 мл патологического материала более тысячи микобактерии.

Бактериологический метод

Все материалы для исследования бактериологическим методом, как правило, содержат постоянную микрофлору, что практически делает невозможным выделить микобактерии в чистой культуре без предварительной обработки материалов. Исключением из этого правила является стерильно взятая спинномозговая жидкость.

С целью уничтожения сопутствующей микрофлоры и гомогенизации мокроты, гноя и других материалов применяют 10% раствор серной кислоты или 10% раствор трехзамещенного фосфорнокислого натрия 1:1.

Жидкие материалы центрифугируют 30-40 мин, осадок обрабатывают серной кислотой в течение 20-30 мин, устанавливают рН среды в пределах 7,2-7,6 и высевают на среду Левенштейна - Йенсена и среду Финн-2. Засеянные среды инкубируют в термостате при температуре 37°С 3-4 недели. Пробирки со средами, в которые исследуемый материал вносили петлей и втирали в поверхность среды, размещают вертикально; в тех случаях, когда посевы делают пастеровской пипеткой, пробирки помещают в термостат в полугоризоптальном положении на 2-3 сут, а затем вертикально. Все пробки заливают расплавленным парафином или закрывают целлофановым колпачком и уплотняют резиновым кольцом.

Посевы просматривают раз в неделю. Все пробирки, в которых обнаружен рост посторонней микробной флоры, удаляют. Рост микобактерий туберкулеза обычно обнаруживается на 3-й неделе, но иногда через 2,5-3 мес.

Микобактерии туберкулеза формируют колонии на плотных питательных средах с характерными признаками. Они как правило, сухие, морщинистые, грубые (напоминают бородавки), обычно в R-форме. S-форма колоний с пигментацией желтого или оранжевого цвета при влажном росте свойственна другим микобактериям.

При учете результатов следует фиксировать обильность и сроки появления роста микобактерий. Эти показатели, определяемые в динамике, имеют эпидемиологическое и прогностическое значение.

Культуры микобактерий туберкулеза, выращенные на питательных средах, микроскопируют. В мазках, окрашенных по Цилю - Нильсену, образуются скопления кислотоустойчивых типичных микобактерий.

В молодых культурах, выделенных из организма больных, леченных антибактериальными препаратами, обнаруживают микроорганизмы с измененной формой (короткие палочки, неправильной формы шары).

В некоторых случаях исследуемый материал высевают на 3-4 пробирки жидкой питательной среды с плазмой крови донора или сывороткой крупного рогатого скота.

Результаты посева учитывают через 10 дней. Берут одну пробирку и стерилизуют, из осадка готовят мазки, фиксируют, окрашивают и микроскопируют. Отрицательный результат выдают только после инкубирования посевов в термостате в течение месяца. Посторонние микроорганизмы в таких питательных средах растут, размножаются в первые дни культивирования и вызывают помутнение жидкости.

Микобактерии, выращенные на жидкой питательной среде, пересевают в пробирки с плотной средой. В таких случаях положительные результаты возрастают, но продолжительность исследования увеличивается.

Микобактерии могут размножаться и образовывать микроколонии на стекле. Для этой цели готовят полоски обычного стекла 10 см длиной и 0,9-1 см шириной, моют, обезжиривают, сушат и стерилизуют.

Мокроту больного выливают в чашку Петри, выбирают гнойные комочки, наносят их на полоску стекла и растирают другой такой же полоской так, чтобы получились два мазка, занимающие 2/3 длины стекла. Стекла кладут на стерильную бумагу и подсушивают. Сухие мазки погружают на 15-20 мин в пробирки с 2% раствором серной кислоты, а затем 2-3 раза промывают дистиллированной водой и помещают в жидкую синтетическую или кровяную среду, в которую добавляют 10 ЕД/мл пенициллина. Мазок должен быть полностью покрыт питательной средой. Инкубируют в термостате при 37-38°С. Результаты учитываются на 1-й. 15-й и 30-й день. Каждый раз один такой мазок вынимают из пробирки, высушивают, фиксируют, окрашивают по Цилю - Нильсену или аурамином и микроскопируют. Положительными будут посевы, в которых на стекле выявляются микроскопические колонии в виде "жгутиков", "кос" и "пауков".

Определение лекарственной устойчивости
микобактерий туберкулеза

Лекарственную устойчивость микобактерий туберкулеза определяют с помощью бактериологических методов перед началом лечения, затем спустя 3 мес и далее при продолжающемся выделении бактерий туберкулеза через каждые б мес. Это делают путем выращивания микобактерий на питательных средах с различным содержанием препарата, к которому определяют устойчивость, и на тех же средах без добавления его (контроль).

Определение лекарственной устойчивости может быть: а) прямое - посев соответственно обработанного патологического материала (мокрота, гной и т.д.) на среды, содержащие лекарственные препараты; б) непрямое - пересев предварительно выделенных чистых культур микобактерий туберкулеза на среды, содержащие лекарственные препараты.

Прямой способ более эффективен, но им можно пользоваться, если микобактерии обнаруживаются в материале бактериоскопически и содержатся в значительном количестве (1-5 палочек в поле зрения). Наиболее распространенными методами определения лекарственной устойчивости являются:

1) культивирование на плотных яичных средах;

2) микрокультивирование на стеклах;

3) глубинные посевы на полусинтетические среды;.

Результаты исследования учитывают по истечении определенного срока выращивания, достаточного для получения обильного роста в контрольных пробирках.

В остальных пробирках в зависимости от концентрации препарата и степени устойчивости к нему данного штамма микобактерии туберкулеза рост может быть различной интенсивности или к этому времени отсутствовать.

Лекарственно чувствительные штаммы дают рост в пределах определенных концентраций, различных для каждого препарата.

Штаммы, которые дают рост при соответственно более высоком содержании препаратов, относят к лекарственно устойчивым. Устойчивость определяют по макроросту на плотных и по микроросту на жидких средах. Устойчивость данного штамма в целом выражается той максимальной концентрацией антибактериального препарата (количество микрограммов в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается рост, приближающийся к росту в контроле.

В части случаев выявляется обильный типичный рост микобактерии в присутствии той или другой концентрации антибактериального препарата, а на среде, содержащей более высокие концентрации этого же препарата, рост может быть скудным в виде единичных макро- или микроколоний, что указывает на размножение только некоторых, более резистентных, особей данного штамма. В таких случаях отмечают как максимальную концентрацию препарата, при которой еще размножается основная устойчивая масса микробных особей, так и предельную - при скудном росте ("относительная устойчивость" см. таб.).

*Импакт фактор за 2018 г. по данным РИНЦ

Журнал входит в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК.

Читайте в новом номере

ЦНИИ туберкулеза РАМН, Москва

В настоящее время лабораторная диагностика занимает ведущее место в выявлении многих инфекционных заболеваний. Подтверждение диагноза туберкулеза основывается на результатах микробиологических анализов при выделении из биологического материала возбудителя – микобактерий туберкулеза. Современная микробиологическая диагностика туберкулеза состоит из нескольких основных групп анализов, направленных на выявление возбудителя, определение лекарственной чувствительности и типирование микобактерий.

Обнаружение возбудителя начинается с наиболее простых и быстрых бактериоскопических методов с использованием светового микроскопа с окраской по Циль–Нильсену и люминесцентного с окраской флюорохромами. Преимущество бактериоскопии – в быстроте получения результата. Однако возможности ее ограничены из–за низкой чувствительности. Этот метод является наиболее экономичным и рекомендован ВОЗ в качестве основного для выявления заразных больных (табл. 1).

При антибактериальной терапии обнаружение микобактерий туберкулеза имеет прогностическое значение. Поэтому бактериовыделение оценивается количественно. Золотым стандартом выявления микобактерий признаны культуральные исследования. Для посева патологического материала используют яичные среды: Левенштейна–Йенсена, среду Финна II, Мордовского и др. Количество микобактерий (или колоний в пробирке при культуральном методе исследования) в процессе химиотерапии является ориентировочным показателем ее эффективности или косвенным свидетельством развития устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам.

Для повышения процента выделения микобактерий посевы патологического материала проводят на несколько сред, в том числе и на жидкие в автоматизированных системах учета роста типа BACTEC, что позволяет удовлетворить все культуральные потребности возбудителя. Посевы инкубируют до двух с половиной месяцев. При отсутствии роста к этому времени посев считается отрицательным. Наиболее чувствительным способом обнаружения микобактерий туберкулеза считается метод биологической пробы – заражение диагностическим материалом высокочувствительных к туберкулезу морских свинок.

Развитие молекулярной биологии позволило значительно повысить эффективность обнаружения микобактерий. Базовым методом молекулярно–генетических исследований является полимеразная цепная реакция (ПЦР), направленная на выявление ДНК микобактерий в диагностическом материале. ПЦР дает экспоненциальное увеличение специфического участка ДНК возбудителя: 20 циклов ПЦР приводят к увеличению исходной ДНК в 1 миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле.

Роль молекулярной диагностики в клинической практике повышается, поскольку увеличивается число больных со скудным бактериовыделением. Однако при постановке диагноза результаты ПЦР являются дополнительными и должны сопоставляться с данными клинического обследования, рентгенографии, микроскопии мазка, посева и даже ответа на специфическое лечение.

Интереснейшая область исследования, которая открывается благодаря ПЦР–диагностике, – изучение латентной инфекции M. tuberculosis. По современной концепции туберкулезной инфекции, из 100 человек, контактирующих с M. tuberculosis, 90 могут быть инфицированы, но только у 10 развивается активная болезнь. У остальных 90% инфекция будет оставаться латентной из–за противотуберкулезного иммунитета. Положительные ответы ПЦР при отрицательных результатах посевов патологического материала отмечаются у 55% лиц, подвергавшихся бытовым контактам с M. tuberculosis, и у 80% лиц, у которых туберкулез протекал без рентгенографических проявлений. Проведение ПЦР–исследований у пациентов из групп риска выявляло больных с отрицательными результатами микроскопии и посевов, но с субклинической инфекцией M. tuberculosis [11]. Подобные результаты были получены и в наших исследованиях [6].

Определение лекарственной устойчивости микобактерий

Для определения лекарственной устойчивости микобактерий используется несколько групп методов (табл. 2). По приказу № 558 МЗ РФ от 1978 г. в бактериологических лабораториях России используется метод абсолютных концентраций. В лаборатории ЦНИИТ РАМН внедрен ускоренный метод по тестированию нитратредуктазной активности микобактерий с помощью реактива Грисса.

В крупных противотуберкулезных центрах используются методы определения лекарственной устойчивости в жидких средах с автоматизированной радиометрической и флюоресцентной системой учета роста микобактерий типа ВАСТЕК, позволяющие сокращать срок анализа до 14 дней.

В последнее время разрабатываются новые методы оценки лекарственной устойчивости на уровне генотипа [10]. Работа по изучению молекулярных механизмов резистентности показала наличие у микобактерий генов, связанных с устойчивостью к различным препаратам: к изониазиду – гены katG, inhA, kasA, к рифампицину – rpoB, к стрептомицину – rpsL и 16SрРНК, к этамбутолу – emb1, к фторхинолонам – gyrA и т.д. [7].

Широкомасштабные исследования по изучению спектра мутаций в геноме устойчивых микобактерий показали, что наиболее распространенными были мутации в 531, 526 и 516 кодонах rpoB гена, устойчивость к изониазиду характеризовалась мутациями в 315 кодоне katG гена. В целом спектр мутаций не отличался от выявленных исследователями в разных регионах мира [2].

Доступность данных по молекулярной основе лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам дала возможность разработки новых, основанных на ПЦР, методов, представленных в табл. 2. Наши работы, проведенные совместно с Институтом физико–химической медицины МЗ РФ и Институтом молекулярной биологии РАН, продемонстрировали перспективность использования молекулярно–генетических методов для быстрого определения лекарственной устойчивости [1, 3, 4].

Наибольшие надежды по совершенствованию методов для определения лекарственной устойчивости микобактерий связаны с развитием микрочиповой технологии, позволяющей определять устойчивость одновременно к нескольким противотуберкулезным препаратам микобактерий непосредственно из диагностического материала в течение 2 дней [9].

Комплекс методов имеется и для типирования микобактерий, когда используются традиционные культуральные и биохимические методы, биологические, а также молекулярно–генетические (табл. 3). На основе молекулярно–генетического типирования микобактерий интенсивно развивается область молекулярно–эпидемиологических исследований, в которой по генотипу микобактерии выявляются очаги и прослеживаются пути распространения туберкулезной инфекции [5, 8].

#Pt6982.gif В заключение необходимо подчеркнуть, что в настоящее время имеется научный потенциал для совершенствования бактериологических исследований, а благодаря успехам молекулярной биологии существует возможность значительного сокращения сроков выявления микобактерий, определения лекарственной устойчивости и контроля за эффективностью химиотерапии.

1. Альтшуллер М.Л. и др. Применение аллель–специфической амплификации и SSCP для выявления устойчивости к рифампицину клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis. // БЭБиМ, 1999; 128(11): 555–8.

2. Генерозов Э.В. и др. Молекулярная характеристика полирезистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis из России. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2000; 1: 11–7.

3. Генерозов Э.В.и др. Детекция и характеристика мутаций в rроВ гене резистентных к рифампицину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. // Проблемы туберкулеза, 1999; 2: 39–42.

4. В.М. Михайлович и др. Использование методов гибридизации и ПЦР на специализированном ТБ–микрочипе для обнаружения рифампицин–резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis // БЭБ и М, 2001, 1: 112–7.

5. Черноусова Л.Н.и др. Молекулярная эпидемиология туберкулеза в тюрьмах. // Актуальные проблемы пенитенциарной медицины. Мат–лы международной научно–практич. конференции, Минск, 2001: 48–50.

6. Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., Голышевская В.И. Роль ПЦР–анализа в комплексных бактериологических анализах во фтизиатрии. // Проблемы туберкулеза, 2001; 3: 58–60.