Определение лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза

Определение спектра и степени чувствительности микобактерий к противотуберкулезным препаратам имеет важное клиническое значение, а также для эпидемио-логической оценки распространения туберкулеза с лекарственной устойчивостью. Кроме того, мониторинг лекарственной устойчивости позволяет оценивать эффективность противотуберкулезной программы в целом, являясь интегральным показателем работы всех составляющих противотуберкулезных мероприятий.

Кратность и сроки определения лекарственной чувствительности:

- до начала лечения однократно для определения стратегии и тактики лечения;

- при изоляции от больного культур из различного материала (мокрота, БАЛ, моча, экссудаты, ликвор и др.) исследуются все выделенные штаммы;

- в конце интенсивной фазы лечения при отсутствии клинико- рентгенологической динамики;

- при необходимости изменения схемы лечения в случае отсутствия негативации мокроты, повторного выделения культуры после негативации мокроты, резкого увеличения количества КУМ в мазке после первоначального снижения.

Хорошо известно, что из материала от больного туберкулезом выделяют неоднородные по лекарственной чувствительности штаммы микобактерий туберкулеза. Чувствительность штаммов к противотуберкулезным препаратам может отличаться по спектру препаратов, степени, частоте и скорости появления устойчивости. Степень лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза определяют в соответствии с установленными критериями, которые ориентированы на клиническую значимость устойчивости и зависят от противотуберкулезной активности препарата, его фармакокинетики, концентрации в очаге поражения, величины максимальной терапевтической дозы и прочее.

Определение лекарственной чувствительности микобактерий в настоящее время проводят микробиологическими методами:

- абсолютных концентраций (метод разведений на плотной или жидкой питательных средах),

Обычно устойчивость проявляется в виде визуально наблюдаемого роста колоний микобактерий туберкулеза, однако существуют методики, индуцирующие рост в ранних стадиях деления клеток микобактерий в виде цветных реакций. Эти методы сокращают время проведения теста с 3-4 до 2 нед.

В качестве унифицированного в России получил распространение рекомендованный Комитетом по химиотерапии ВОЗ метод абсолютных концентраций, который с методической точки зрения является самым простым, однако требует высокой стандартизации и точности выполнения лабораторных процедур. Тест на лекарственную чувствительность состоит из набора пробирок с питательной средой, модифицированной противотуберкулезными препаратами. Набор состоит из 2-3 пробирок с разными концентрациями каждого из используемых препаратов, одной контрольной пробирки со средой без препарата и одной пробирки, содержащей 1000 мкг/мл салициловокислого натрия или 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты для выявления роста нетуберкулезных микобактерий.

Для приготовления набора сред с препаратами используют модифицированную среду Левенштейна-Йенсена (без крахмала), которую разливают в колбы. В каждую из колб добавляют определенный объем соответствующего разведения противотуберкулезного препарата. Содержимое колб тщательно перемешивают, разливают в пробирки и свертывают в наклонном положении в течение 40 мин при температуре 85*С. Свертывание среды рекомендуют производить в электросвертывателе с автоматической регулировкой температуры. Среда с противотуберкулезными препаратами 1-го ряда может храниться в холодильнике при 2-4*С в течение 1 мес, с препаратами 2-го ряда - не более 2 нед. Хранение сред с препаратами при комнатной температуре недопустимо. При приготовлении растворов противотуберкулезных препаратов учитывают их активность, рассчитывая концентрацию с поправкой на молекулярную массу неспецифической части препарата, чистоту и т.д. Для определения лекарственной чувствительности используют только химически чистые субстанции.

Принцип метода состоит в определении концентрации противотуберкулезного препарата, подавляющей рост значительной части популяции микобактерий. При правильном выполнении этот метод имеет хорошую достоверность.

Перед постановкой теста необходимо убедиться, что выделенная культура микобактерий туберкулеза не имеет посторонней микрофлоры. Из культуры микобактерий в 0,9% растворе натрия хлорида готовят гомогенную взвесь, содержащую 500 млн микробных тел в 1 мл (оптический стандарт мутности 5 единиц). Полученную взвесь разводят 0,9% раствором натрия хлорида (1:10) и вносят по 0,2 мл взвеси в каждую пробирку набора питательных сред. Засеянные пробирки помещают в термостат при 37*С и выдерживают в горизонтальном положении в течение 2-3 сут, чтобы скошенная поверхность питательной среды была равномерно инокулирована взвесью микобактерий туберкулеза. Затем пробирки переводят в вертикальное положение и инкубируют в течение 3-4 нед. Учет результатов проводят через 3-4 нед.

Поскольку сроки выделения возбудителя из клинического материала на питательных средах составляют не менее 1-1,5 мес, результаты определения лекарственной чувствительности указанным методом можно получить не ранее чем через 2-2,5 мес после посева материала. В этом заключается один из основных недостатков метода.

Интерпретируют результаты определения лекарственной чувствительности микобактерий на основе определенных критериев. На плотных средах культура считается чувствительной к той концентрации препарата, которая содержится в среде, если число колоний микобактерий, выросших на данной пробирке с препаратом, не превышает 20 при обильном росте на контрольной пробирке без препаратов. Только при наличии более 20 колоний культура расценивается как устойчивая к данной концентрации. На практике при получении результатов роста в опытных пробирках, близких к 20 КОЕ, необходимо известить клиническое подразделение, что чувствительность или устойчивость в этом случае носит пограничный характер, так как иногда это может объяснить нечеткую динамику клинических показателей.

При лабораторной диагностике туберкулеза недостаточно дать ответ, констатирующий, обнаружены или нет тем или иным методом микобактерий туберкулеза. Для клиники туберкулеза, детального представления о характере микобактериальной популяции и определения прогноза заболевания необходимо изучение различных свойств культур, выделенных от больного: лекарственной чувствительности, ферментативной активности, вирулентности, видовой принадлежности. В некоторых случаях необходимо дифференцировать выделенные культуры и установить характер атипичных культур. Все это обусловливает то разнообразие исследований, которые необходимо проводить при лабораторной диагностике туберкулеза.

Определение лекарственной чувствительности выделенных штаммов микобактерий является необходимым и весьма важным этапом микробиологических исследований. Развитие лекарственной устойчивости обусловлено многими факторами: селекцией устойчивых вариантов в микобактериальной популяции, вегетирующей в организме больного; индукцией противотуберкулезными препаратами или антибиотиками, применяемыми в процессе химиотерапии; передачей эписомного R-фактора чувствительным особям (нехромосомная устойчивость) и др. Следует отметить, что снижение чувствительности микобактерий туберкулеза отмечается ко всем противотуберкулезным препаратам, однако оно может отличаться по степени, характеру, частоте и скорости появления. Известно, что из патологического материала от больных туберкулезом выделяются неоднородные по лекарственной чувствительности микобактерий: устойчивые к одному лекарственному препарату, или моноустойчивые, варианты с истинной двойной или полиустойчивостью, а также смесь вариантов, устойчивых к различным препаратам.

Определение спектра и степени чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам имеет важное значение для тактики химиотерапии больных, контроля за эффективностью лечения и определения прогноза заболевания. Степень лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза определяется в соответствии с установленными критериями, которые зависят как от противотуберкулезной активности лекарственного препарата, так и его концентрации в очаге поражения, величины максимальной терапевтической дозы, фармакокинетики препарата и др.

Определение лекарственной чувствительности в настоящее время проводится бактериологическими методами — методом разведений на плотной питательной среде и методом разведений (или абсолютных концентраций) на жидких питательных средах. Имеется много модификаций обоих методов. В качестве унифицированного в России применяют рекомендованный Комитетом по химиотерапии ВОЗ метод определения лекарственной чувствительности микобактерий на плотной среде Левенштейна — Йенсена (без крахмала), в которую перед свертыванием добавляют различные концентрации препаратов. Минимальный набор состоит из 2—3 пробирок с разными концентрациями каждого из используемых в данной клинике препаратов, одной контрольной пробирки со средой без препарата.

Этот метод достаточно точен. Он позволяет применять патологический материал, содержащий любое количество микобактерий, поскольку для определения лекарственной чувствительности используются микобактерий, предварительно выделенные из патологического материала. Поскольку сроки выделения возбудителя на питательных средах составляют не менее 1—1,5 мес, результаты определения лекарственной чувствительности указанным методом можно получить не ранее чем через 2—2,5 мес после забора материала. В этом заключается один из основных недостатков метода. Описанный метод определения лекарственной чувствительности микобактерий после выделения их чистой культуры получил название непрямого метода.

При массивном бактериовыделении (не менее 1—5 микобактерий в каждом поле зрения) применяют прямое определение лекарственной чувствительности при выделении возбудителя непосредственно из патологического материала. Для этого используют метод глубинного посева и метод культивирования на стеклах в жидких питательных средах. Эти методы более трудоемки, требуют дополнительного приготовления мазков, окраски и микроскопирования последних и, кроме того, менее точны, так как невозможно дозировать засев микобактерий. Однако результаты можно получить в более короткие сроки (через 12 дней). Практикуется также прямое определение лекарственной устойчивости на плотных средах, в этом случае результаты можно получить через 3 нед.

Лекарственно-чувствительные штаммы дают рост на средах с препаратами в пределах определенной концентрации, различной для каждого препарата. Штаммы, которые растут при соответственно более высоком содержании этих препаратов в питательной среде, относят к лекарственно-устойчивым. Устойчивость определяют по наличию макроскопически видимого роста на плотных и микроскопического роста — на жидких средах.

Устойчивость данного штамма в целом выражается той максимальной концентрацией препарата (количество микрограмм в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение микобактерий (по числу макроколоний при посеве на плотные среды и микроколоний при посеве на жидкие среды). Лекарственно устойчивые микроорганизмы способны размножаться при таком содержании препарата в среде, которое оказывает на чувствительные особи бактериостатическое или бактерицидное воздействие. При определении лекарственной устойчивости микобактерий на плотных средах культура считается чувствительной к той концентрации препарата, которая содержится в среде, если число колоний микобактерий, выросших на одной пробирке с препаратом, не превышает 20. Только при наличии более 20 колоний культура расценивается как устойчивая.

Для различных препаратов установлена определенная предельная концентрация, при которой еще наблюдается размножение чувствительных к этому препарату микобактерий. Границей, или критерием устойчивости, называют те первые концентрации препарата в питательной среде, выраженные в микрограммах на 1 мл, при которых начинают размножаться устойчивые особи. Для плотной среды Левенштейна—Йенсена установлены следующие концентрации (мкг/мл):

• стрептомицин — 5;
• изониазид — 1;
• этионамид — 30;
• протионамид — 30;
• циклосерин — 50;
• канамицин — 30;
• флоримицин (виомицин) — 30;
• тиоацетазон (тибон) — 2;
• этамбутол — 2;
• рифампицин — 20.

Наряду с анализом лекарственной чувствительности все выделенные при посеве медленно растущие штаммы микобактерий подлежат первичной идентификации для определения их видовой принадлежности (М. tuberculosis, М. bovis, М. africanum, М. microti), так как принадлежность возбудителя к тому или иному виду существенно влияет на тактику химиотерапии, прогноз заболевания и др. Одним из основных лабораторных тестов, позволяющих дифференцировать М. tuberculosis и М. bovis и микобактерии всех других видов, служит ниациновый тест. Он основан на уникальной способности микобактерии человеческого типа синтезировать ниацин (никотиновую кислоту) в значительно больших количествах, чем микобактерии бычьего типа и нетуберкулезные микобактерии.

Биологическая проба. При отрицательных результатах бактериоскопии и посева материала, исследуемого на микобактерии туберкулеза, если все же подозревается туберкулез, ставят опыты на животных (так называемая биологическая проба). Это наиболее чувствительный метод выявления возбудителя туберкулеза. Самым чувствительным к туберкулезной инфекции лабораторным животным является морская свинка. Считается, что заражение морской свинки позволяет диагностировать туберкулез даже при наличии в материале, использованном для заражения, 1—5 микробных клеток.

Биологический метод широко применяется в диагностике туберкулеза со времени открытия возбудителя этой инфекции. Он не потерял своей ценности и в настоящее время. Более того, сейчас этот метод с успехом применяется для выявления не только типичных неизмененных, но и разнообразных биологически измененных форм возбудителя, в частности L-трансформированных и фильтрующихся форм. Кроме того, этот метод является основным при определении видовой принадлежности микобактерии, их вирулентности, изучении патогенности атипичных культур. Он широко используется для воспроизведения туберкулеза отдельных органов, исследования аллергических реакций, иммунитета и эффективности химиотерапии при туберкулезе. В последние годы метод применяется при проведении биологических пассажей в процессе изучения биологически измененных форм возбудителя в целях получения биологической реверсии.

При любом методе заражения морских свинок микобактериями туберкулеза у животных развивается генерализованный туберкулезный процесс, заканчивающийся гибелью. Однако следует иметь в виду, что возбудители туберкулеза, устойчивые к препаратам изоникотиновой кислоты, вследствие снижения или потери вирулентности могут не вызывать заболевание у морских свинок и дать отрицательные результаты биологической пробы при одновременном наличии роста на питательных средах при посеве. Это обстоятельство диктует необходимость дифференцированного подхода к результатам биологической пробы и одновременного использования метода посева при проведении заражения животного в диагностических целях.

Для повышения частоты обнаружения микобактерий туберкулеза в патологическом материале многие авторы используют, помимо подкожного, интратестикулярное заражение. При этом в патологическом материале удается чаще выявлять изониазидоустойчивые слабовирулентные микобактерий. Кроме того, для повышения чувствительности биологического метода рекомендуется искусственно снижать естественную резистентность морских свинок ежедневным введением больших доз кортизона (12,5 мг), что позволяет повысить результативность биологической пробы на 15—29% (по данным разных исследователей). Наконец, результативность биологической пробы можно повысить, применяя метод последовательных биологических пассажей. Для этого заражение каждой последующей морской свинки производится гомогенатом органов от предыдущего животного, использованного в биологической пробе. По мере увеличения числа пассажей нарастает выраженность специфических изменений в органах.

Следует подчеркнуть, что особую ценность биологическая проба представляет для диагностического исследования олигобациллярного материала.

Перед заражением морским свинкам с массой 200—250 г ставят реакцию Манту, вводя 0,02 мл альттуберкулина Коха внутрикожно в наружную поверхность бедра, освобожденную от волосяного покрова; контроль — введение такого же количества бульона в другую лапку. При отрицательной реакции через 48 ч свинку можно брать в опыт. Для заражения в диагностических целях можно использовать различный патологический материал: мокроту, мочу, промывные воды, отделяемое ран и др. Исследуемый материал обычно обрабатывают 3% раствором серной кислоты так же, как и для посева. Затем осадок 2 или (лучше) 3 раза отмывают стерильным изотоническим раствором NaCl и центрифугируют. Такое отмывание является обязательной процедурой, поскольку при попадании кислоты животному под кожу может развиться некроз. К отмытому осадку добавляют изотонический раствор NaCl и вводят эту смесь под кожу правой паховой области. За свинками проводят систематическое наблюдение, проверяя появление местного инфильтрата в месте введения материала, изъязвление этого инфильтрата, состояние регионарных лимфатических узлов и места введения материала; повторно ставят реакцию Манту. То же повторяют через 6 нед и далее. При положительных туберкулиновых пробах и наличии местных изменений свинок забивают через 1—1,5 мес, при отсутствии признаков развивающегося туберкулеза — через 3 мес.

Туберкулиновые пробы при наличии туберкулезного процесса становятся положительными через 2 нед — 1 мес после заражения.

На вскрытии свинок, погибших от туберкулеза, наблюдается картина генерализованного туберкулеза. Если при заражении в материале были слабовирулентные микобактерии туберкулеза, то развитие процесса может ограничиться увеличением лимфатических узлов и единичными очажками в органах. Во время вскрытия делают мазки-отпечатки из органов для бактериоскопических исследований. Кроме того, кусочки лимфатических узлов, селезенки, печени и легких вырезают стерильным инструментом, помещают в стерильную ступку, гомогенизируют и засевают на плотные питательные среды. Посевы производят обязательно при отсутствии в органах макроскопически видимых изменений туберкулезного характера. Кроме того, в сомнительных случаях проводят гистологическое исследование тканей.

Для оценки распространенности и характера туберкулезного поражения у морских свинок предложено несколько схем учета макроскопических изменений в органах. Наибольшее распространение в нашей стране получили схемы, разработанные М.В. Триус и Ю.К. Вейсфейлером. По этим схемам специфические изменения в органах и лимфатических узлах оцениваются в зависимости от степени их выраженности плюсами, которые затем переводятся в цифровые показатели.

Микробиологическая диагностика b-трансформированных и фильтрующихся вариантов микобактерии. Все изложенное выше касается разнообразных методов выявления и идентификации классических бактериальных форм возбудителя туберкулеза, не учитывая многообразные формы, возникшие в результате морфологической, тинкториальной и биологической изменчивости микобактерии.

В настоящее время традиционные методы выделения микобактерии туберкулеза все меньше удовлетворяют нужды клиники, так как информативность микробиологических исследований явно недостаточна. Применяемые методы малоэффективны и не позволяют составить представление об истинном состоянии микобактериальной популяции, вегетирующей в организме больного. Это объясняется, с одной стороны, недостаточной чувствительностью ряда методов, а с другой (в значительно большей степени), тем, что большинство таких методов не позволяет выявить возбудитель, находящийся в b-трансформированном состоянии.

b-трансформация

b-трансформация — закономерный этап жизненного цикла микобактерии.
b-формы — это варианты бактерий с дефектом клеточной стенки. Им придают особое значение в патологии человека и животных в связи с их способностью длительно существовать в макроорганизме и реверсировать в исходный вид с восстановлением свойственной ему вирулентности. Возможность попеременного или одновременного существования возбудителя в бактериальной и b-форме не только значительно затрудняет диагностику, но и влияет на развитие эпидемического процесса, создавая ложное впечатление об абациллировании источников и стерилизации очагов инфекции.

Таким образом, результаты бактериологических исследований, рассчитанных на выделение только бактериальных форм возбудителя, не могут служить основанием для исключения туберкулезной инфекции и должны дополняться данными, полученными специальными методами, которые направлены на выявление b-форм микобактерий. Последние, как известно, являются закономерно существующей формой возбудителя при разных клинических проявлениях туберкулезного процесса, а также основной формой персистирования микобактерий.

Установлено, что b-трансформация микобактерий закономерна и при использовании специальных методов исследования она может быть выявлена. Из-за биологических особенностей b-форм, для которых характерны резко измененная морфология бактериальных клеток и сниженный метаболизм, выделение их требует специальных методов культивирования и идентификации. b-формы могут обнаруживаться в виде гигантских зернистых тел, скоплений различных по размеру, гомогенности и оптической плотности шаров, гранул, сферопластоподобных образований, светопреломляющих тел и др, b-фюрмы и близкие к ним варианты возбудителя туберкулеза характеризуются повышенной хрупкостью и требуют применения особых методов выделения и условий культивирования: щадящих методов обработки материала, элективных питательных сред, наличия нативных белков и осмотических стабилизаторов.

b-формы выделяются преимущественно у больных, недавно прекративших выделять бактериальные формы. У данного контингента больных с сохранившимися полостями деструкции и воспалительными изменениями в легочной ткани выделение b-форм продолжается еще в течение 3—4 мес и более после прекращения выделения бактериальных форм. Таким образом, целенаправленные поиски b-форм микобактерий показаны у больных, не выделявших или прекративших выделять бактериальные формы, но имеющих явные клинические признаки активного туберкулезного процесса. К таким признакам относится наличие участков деструкции легочной ткани, каверн с неравномерно широкими стенками и с эволютивными воспалительными изменениями в окружающей легочной ткани.

Поиски b-форм микобактерий туберкулеза должны проводиться повторно, многократно, так как выделение их носит периодический характер. В настоящее время разработаны и применяются разнообразные методы микробиологической диагностики b-трансформированных вариантов: бактериоскопические, культуральные, биологические, серологические, иммунофлюоресцентные, гистологические. Разработаны методические основы культурального выделения b-форм, сконструированы элективные питательные среды, предложены методы обработки материала, подобраны адекватные детергенты и осмотические стабилизаторы, разработана схема посева и контролей. Предложены методы окраски b-форм в чистой культуре и патологическом материале; разработаны стандартные и ускоренные методы реверсии и др. Все это позволяет выделять b-формы из разнообразного патологического материала и устанавливать их видовую специфичность.

Исследованиями последних лет (А.Г. Хоменко, В. И. Голышевская) установлено, что при многих клинических проявлениях туберкулеза (особенно на фоне длительной комбинированной химиотерапии) в организме больных и экспериментальных животных обнаруживаются и ультрамелкие формы возбудителя, проходящие через бактериальные фильтры. Частота обнаружения этих микроорганизмов варьирует в зависимости от формы процесса и особенно от лекарственного режима.

Для выделения ультрамелких форм разработаны культуральный и биологический методы. Основной принцип этих методов заключается в том, что исследованию подвергается материал, последовательно профильтрованный через мембранные фильтры с размером пор 0,65; 0,45 и 0,22 мкм. При этом исследуемый субстрат полностью очищается от бактериальных форм возбудителя, осколков микобактерий и других вариантов изменчивости, в материале остаются только фильтрующиеся формы. Полученный фильтрат засевают на специальные питательные среды или вводят морской свинке. Результаты оценивают по данным бактериоскопии мазков, приготовленных из культивированного фильтрата или в результате реверсии возбудителя в бактериальную форму.

Владельцы патента RU 2244927:

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для определения лекарственной чувствителности микобактерий туберкулеза. Сущность способа состоит в том, что диагностический материал предварительно заливают раствором хлоргексидинбиглюконикума, гомогенизируют, оставляют на 10-12 часов при комнатной температуре, центрифугируют, осадок заливают жидкой средой Школьниковой, инкубируют при 37°С в течение 3 суток, сливают надосадочную часть среды Школьниковой, заливают свежей средой Школьниковой, осадок перемешивают, засевают на плотные яичные среды и чувствительность штамма определяют через 3 недели по наличию роста только в контрольной пробирке. Техническим результатом является повышение точности способа и сокращение сроков определения.

Данное изобретение относится к области медицины, разделу “бактериология”, а именно к лабораторным методам диагностики туберкулеза.

Известные в практических лабораториях методы определения чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам длительны и предполагают (с учетом выхода культур) срок 49-60 дней. Методы определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам с применением современных технологий используются в силу своей дороговизны далеко не во всех лабораториях. Кроме того, в арсенале фтизиобактериологов имеется метод прямого определения лекарственной чувствительности. Этот метод предполагает наличие микобактерий в исследуемом материале, подтвержденный методом прямой бактериоскопии. Но и он не всегда позволяет получить положительный результат.

Таким образом, поиск достаточно быстрого, с гарантированным результатом данных лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам в условиях практических лабораторий сохраняет свою актуальность и имеет предпосылки для его усовершенствования.

Прямым способом определение лекарственной чувствительности осуществляется как на жидких, так и на плотных питательных средах (Т.Н.Ященко, И.С. Мечева Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе М., Медицина. - 1973. - С.60-71.)

1. Определение лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам на жидких питательных средах.

Из мокроты приготавливают и обрабатывают мазки. Количество мазков определяется количеством противотуберкулезных препаратов и тех концентраций, к которым предполагается изучить устойчивость микобактерий. Обработанные мазки опускают стерильным пинцетом в бактериологические пробирки, в которые предварительно разлиты среды с различным содержанием противотуберкулезных препаратов и контрольную со средой без препарата. Через 10-14 дней пробирки со стеклами стерилизуют. После стерилизации мазки вынимают из пробирок, высушивают, фиксируют над пламенем, окрашивают по Циль-Нильсену и микроскопируют (Т.Н.Ященко, И.С. Мечева. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе. М., Медицина. - 1973. - С.60-71.)

2. Определение лекарственной чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам на плотных питательных средах.

Диагностический материал (мокрота), при наличии бактериоскопическим методом по Циль-Нильсену 1-5 палочек микобактерий, обрабатывают также как для обычного посева.

Обработка материала с использованием для посева осадка (Т.Н.Ященко, И.С.Мечева Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе М., Медицина. - 1973. - С.37). Для обработки берут равное по отношению к материалу количество 10% раствора трехзамещенного фосфорно-кислого натрия, хорошо перемешивают и помещают в термостат на 20-24 часа, после чего смесь центрифугируют и осадок засевают на 3-4 пробирки яичной среды.

При прямом методе определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза на плотных средах патологический материал обрабатывают вышеуказанным способом и засевают на плотные питательные среды, содержащие различные концентрации противотуберкулезных препаратов. Чтение результатов определения чувствительности через 21 день инкубации (Т.Н.Ященко, И.С. Мечева. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе. М., Медицина. - 1973. - С.70-71.)

Первичное культивирование микобактерий туберкулеза из диагностического материала затруднено тем, что при посеве бактериоскопически положительного диагностического материала не всегда удается получить результат, т.е. данный прототип недостаточно информативен. И как следствие клиницисты получают отрицательный результат прямого определения и вынуждены ждать выхода культуры для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза непрямым методом, т.е. сроки получения результатов удлиняются.

С целью повышения информативности исследования предложен способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза путем посева люминесцентно-положительного диагностического материала на плотную питательную среду отличающийся тем, что перед посевом на плотную яичную среду, с антибактериальными препаратами осадка с диагностического материала последний заливают жидкой средой Школьниковой. После подращивания микобактерий туберкулеза в течение 3-х суток производится замена надосадочной жидкости на свежую среду Школьниковой в количестве 3 мл.

Материал (мокрота) подвергается первичной обработке с целью подавления сопутствующей микрофлоры, что предупреждает загрязнение посевов. Обработка проводится по Балану В.Ф. хлоргексидинбиглюконикумом.

Диагностический материал заливается равным объемом (1:1) 0,05% раствора хлоргексидинбиглюконикумом. Тщательно гомогенизируют. Оставляют на 10-12 часов при комнатной температуре. На следующий день материал центрифугируют при 1500-2000 об\мин в течение 10 мин. Сливают надосадочную жидкость, оставив осадок. Последний заливают 2,0 мл жидкой среды Школьниковой. Инкубируют в термостате при Т 37°С в течение 3 суток. По истечении этого срока, надосадочную часть среды Школьниковой сливают, не центрифугируя. Заливают 3,0 мл свежей среды Школьниковой. Осадок перемешивают и засевают по 0,2 мл на плотные яичные среды с содержанием противотуберкулезных препаратов. Срок выдачи результатов через 3 недели (21 день).

Пропись полусинтетической среды Школьниковой (Т.Н.Ященко, И.С. Мечева Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе М., Медицина. - 1973. - С.153):

Калия одноосновного фосфорно-кислого - 1,5 г

Натрия двуосновного фосфорно-кислого - 2,5 г

Магнезии серно-кислой - 05 г

Натрия лимонно-кислого (среднего) - 1,5 г

Железа лимонно-кислогоаммиачного - 0,005 г

Л-аспарагина - 1 г

Воды дистиллированной 1 л

Таблица 1
Сравнение сроков выхода и интенсивности роста культур микобактерий туберкулеза пересеянных с жидкой среды Школьниковой на яичные среды
Сроки пересева с жидкой среды на плотную	Сроки выхода культур на яичной среде (дни, сред. арифм.)	Интенсивность роста на яичной среде
Через 3 дня	15,5	+++
Через 5 дней	15,5	++
Через 7 дней	17,5	+
(Интенсивность роста МВТ оценивалась в крестах: ++ до 20 колоний; +++ больше 20 колоний)

При наличии роста микобактерий только в контрольных пробирках штамм считается чувствительным. При наличии роста более 20 колоний микобактерий в пробирках с той или иной концентрацией препарата культура расценивается, как устойчивая.

Таблица 2
Сравнение сроков выхода и интенсивности роста культур микобактерий туберкулеза без замены и с заменой на свежую жидкую среду при пересеве на яичные среды
Сроки выхода культур на яичной среде (дни, сред. арифм.)	Интенсивность роста на яичной среде
Без замены на свежую жидкую среду Школьниковой	15,5	+
С заменой на свежую жидкую среду Школьниковой	12,5	+++

Доказано, что наиболее оптимальный срок инкубирования осадка с нативного материала является 3-х дневный. В табл. 1 приводятся сравнительные данные по срокам выхода культур микобактерий туберкулеза и интенсивности роста микобактерий в зависимости от сроков пересева осадка диагностического материала с жидкой среды на яичную. Из приведенных данных следует, что наиболее оптимальный срок пересева с жидкой среды на яичную через 3 и 5 дней роста. Но при сроке “через 3 дня” на яичной среде отмечается более интенсивный рост культур микобактерий.

Таблица 3
Рост микобактерий туберкулеза при определении лекарственной чувствительности предложенным и сравниваемым методами
Группы Больных	Рост микобактерий туберкулеза А.ч., %	Роста микобактерий туберкулеза нет А.ч., %
Контрольная	18	6
N=24	75,0%	25,0%
Опытная	22	-
N=25	100,0%

После 3-х дневной инкубации осадка обязательным является замена среды Школьниковой на свежую среду. Проведенными экспериментами доказано, что если произвести пересев осадка диагностического материала без замены жидкой среды на свежую сроки выхода культур микобактерий удлиняются до 15,5 дней и интенсивность роста на яичной среде оценивается до 1 креста. Если среда в которой производили инкубирование в течение 3-х дней сливается и заменяется на свежую, то отмечается укорочение сроков выхода культур в среднем до 12,5 дней и что самое важное интенсивность роста микобактерий оценивается в 3 креста, что является основным при оценке роста микобактерий на яичной среде при определении лекарственной чувствительности (табл.2). Данная манипуляция способствует удалению токсических продуктов метаболизма микобактерий, образовавшихся во время лаг-фазы размножения микроба.

Предложенный способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам испытана на 49 больных различными формами туберкулеза, с установленным люминесцентно-положительным мазком мокроты (24 - контрольная группа, 25 - опытная). В контрольной группе больных лекарственная чувствительность определялась на плотных средах, в опытной предложенным методом. Результаты исследований приведены в таблице 3.

У больных с люминесцентно-положительным мазком мокроты использование предлагаемого способа определения лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам с предварительным подращиванием микобактерий в жидкой питательной среде позволило получить результат в 100% случаев. Предлагаемый нами способ определения лекарственной чувствительности прост в выполнении, доступен для любой микробиологической лаборатории.

Способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза путем посева диагностического материала на плотную яичную питательную среду с антибактериальными препаратами, отличающийся тем, что предварительно диагностический материал заливают равным объемом 0,05%-ного раствора хлоргексидинбиглюконикума, гомогенизируют, оставляют на 10-12 ч при комнатной температуре, центрифугируют 10 мин при 1500-2000 об/мин, осадок заливают 2,0 мл жидкой среды Школьниковой, инкубируют при 37°С в течение 3 суток, сливают надосадочную часть среды Школьниковой, заливают 3,0 мл свежей среды Школьниковой, осадок перемешивают, засевают по 0,2 мл на плотные яичные среды и чувствительность штамма определяют через 3 недели по наличию роста только в контрольной пробирке.