Золотым стандартом в выявлении микобактерий туберкулеза является метод

МЕТОДЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Бактериологическая лаборатория играет существенную роль в выявлении, диагностике туберкулеза, выборе рациональных схем химиотерапии и оценке их эффективности. Бактериологическая диагностика включает обработку клинического материала, микроскопическое исследование, выделение микроорганизма с применением культуральных методов, идентификацию микобактерий с использованием бактериологических и биохимических гестов, а также определение лекарственной чувствительности микобактерий.

Существует несколько групп методов, используемых для выявления МБТ в различном диагностическом материале: рутинные (микроскопия, культуральное исследование), биологические (биопроба, определение вирулентности штаммов МБТ). автоматические системы (MGIT, ВАСТЕС, МВ/ВасТ, ESP Culture System и др.), молекулярной енетические методики (PCR. I.CR, NASBA, Q-Bela и др.). Каждый из этих методов обладает определенной чувствительностью и специфичностью, что необходимо учитывать при клинической интер­претации полученных результатов.

Бактериоскопическое исследование мокроты с окраской мазка по Цилю-Нильсену для выявления кислото­устойчивых микобактерий (КУБ) является наиболее быстрым, доступным и экономически эффективным из существующих методов выявления больных туберкулезом. Оно может быть осуществлено в любой клинико- диагностической лаборатории (КДЛ) лечебно-профилактических учреждений всех уровней и ведомств. Бактериоскопия мокроты представляется чрезвычайно информативной для выяснения эпидемиологической опасности пациента для окружающих, которая коррелирует с числом микобактерий в образце. Бактериоскопическое исследование, проведенное должным образом, имеет положительную прогностическую ценность для легочного туберкулеза, более 90%. Разрешающая способность данного метода составляет 50-100 тыс. микобактерий в 1 миллилитре мокроты и существенно зависит от ряда факторов: правильности сбора мокроты, подготовленности лабораторного персонала и разрешающей способности используемых микроскопов. При микроскопии мазков, приготовленных из проб, взятых в течение трех последовательных дней, результативность метода повышается на 20-30%. Однако нет необходимости использовать более 4-5 проб мокроты.

Метод окраски по Цилю-Нильсену наиболее часто используется при бакгериоскопичсском выявлении микобактерий. Он заключается в следующем: мазки мокроты окрашивают фуксином при нагревании, затем обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают метиленовым синим. В результате микобактерий окрашиваются в малиновый цвет, а фон — в синий. Это специфическое окрашивание обусловлено способностью микобактерий удерживать краситель при обработке кислотой или спиртом.

В бактериологических лабораториях, выполняющих большое количество исследований (100 и более ежедневно), используется люминесцентная микроскопия. Данный метод основан на способности липидов микобактрий воспринимать люминесцентные красители (акридиновый оранжевый, аурамин, родамин и др.) и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. В зависимости от красителей, микобактерий туберкулеза дают четкое ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое - на темно-зеленом фоне. Метод люминесцентной микроскопии обладает большей чувствительностью, чем световая микроскопия, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала (микроскопия осадка), поскольку люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить измененные микобактерий, утратившие кислотоуетойчивость. в связи с чем они не выявляются при бактериоскопии по Цилю-Нильсену. Мазки для люминесцентной микроскопии готовят из осадка, полученного после обработки диагностического материапа детергентом с последующим отмыванием либо нейтрализацией. При положительном результате бактериоскопии мазков, окрашенных флуорохромами, должна быт ь проведена подтверждающая микроскопия мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену

Бактериоскопическое исследование необходимо проводить очень тщательно. Обычно образец исследуют в течение 15 минут (что соответствует просмотру 300 полей зрения), чтобы сделать заключение об отсутствии или наличии КУБ в препарате. При окрашивании флюорохромами для исследования одного мазка требуется меньше времени.

Основным диагностическим материалом для бактериоскопии на КУБ служит мокрота. Результаты бактериоскопического исследования на КУБ других биологических материалов (различных жидкостей, тканей, гноя, мочи и т.д.) имеют ограниченное значение для диагностики туберкулеза. Так. исследование 9

мазков из осадка центрифугированной мочи не всегда позволяет получить достоверные результаты, поскольку в моче могут присутствовать нетуберкулезные микобактерий. Поэтому выявление КУБ в моче не всегда свидетельствует о наличии специфического процесса. В мазках из осадка промывных вод желудка и других материалов могут обнаруживаться кислотоустойчивые са-профиты, которые легко спутать с МВТ.

Количество обнаруженных КУБ определяет степень тяжести заболевания и опасности больного для окружающих. Следовательно, исследование должно быть не только качественным, но и количественным. В современных эпидемиологических и экономических условиях бактериоскопическое исследование мокроты у обратившихся в ЛПУ за врачебной помощью лиц с клиническими симптомами, подозрительными на туберкулез, является приоритетным направлением в тактике раннего выявления данного заболевания. Возрастание роли этого метода связано также с возникновением в последние годы остропрогрессирующих форм заболевания, сопровождающихся выраженными клиническими проявлениями и обильным

Материал для бактериологического исследования собирают асептически. Перед проведением бактериологического исследования поступившие в лабораторию пробы обрабатывают растворами кислот или щелочей с последующим центрифугированием. Это необходимо дня разжижения и концентрации образца, а также для предотвращения контаминации, поскольку пробы мокроты вязкие по консистенции и содержат большое количество микрофлоры. Около 1 мл разжиженного и деконтаминированного клинического образца засевают в пробирки со средой и инкубируют при 37°С в течение 10 недель.

Для культивирования микобактерий используют плотные (яичные, агаровые) и жидкие питательные среды. Яичные среды содержа! цельные яйца или яичный желток, а также фосфолипидьг, белки и другие ингредиенты. С целью предотвращения контаминации к среде добавляют некоторые красители, например, малахитовый зеленый, а также антибиотики. Поэтому яичные среды (Левеншейна-Йенсена, Финна), на которЕлх культивируют микобактерий. имеют сине-зеленый цвет. Использование яичных сред позволяет получить видимый рост колоний М tuberculosis через 18-24 дня в виде сухого морщинистого налета кремового цвета. Однако качество ингредиентов, из которых готовится среда, иногда значительно варьирует, что может влиять на воспроизводимость результатов. По сравнению с яичными агаровые среды имеют ряд преимуществ: они готовятся из полусинтетических основ, что обеспечивает более стабильное качество и воспроизводимость результатов. Детекция роста МБТ на агаровых средах возможна через 10-14 дней. Однако агаровые среды дороже, требуют присутствия СОг в атмосфере и инкубируются в термостате не более 1 месяца.. Как правило для выделения микобактерий используется набор из двух разных питательных сред.

Автоматические системы. Разработка радиометрической системы ВАСТЕС 460 (Becton Dickinson) ознаменована собой качественный прорыв в быстрой детекции микобактерий и определении их лекарственной чувствительности

Автоматические системы, предназначенные для выявления микобактерий туберкулеза, позволяют проводить детекцию роста микобактерий в 2-3 раза быстрее, чем классические методы. Положительный результат анализа должен обязательно подтверждаться бактериоскопически. В практике бактериологических лабораторий исследование с использованием автоматических систем обязательно проводится параллельно с исследованием на плотных питательных средах

Идентификации микобактерий. Несмотря на то, что морфология колоний, наличие пигмента и ростовые характеристики дают некоторое

с С. Таким образом, две цепочки ДНК остаются в растворе в не связанном друг с другом состоянии до тех пор. пока температура не будет понижена. На следующем этапе, получившем название этапа отжига праймеров, который проходит при 40-60°С, с участками одноцепочечных молекул ДНК, фланкирующими последовательность-мишень, связываются праймеры. Это короткие участки РНК длиной около 20 нуклеотидов. Каждая из затравок связывается только с одной цепочкой ДНК. Следующий шаг ПЦР умножение последовательности-мишени с помощью полимеразы. Поскольку инкубационная система на этапе денатурации ншреваегся до 90-95°С, в ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза, выделенная из Thermus aquaticus. Этап достройки затравок проходит при 70-75°С. На этом заканчивается первый цикл амплификации. Далее все этапы повторяются 20-25 раз. В результате количество ДНК-мишени возрастает в геометрической профессии.

На практике из патологического материала, взятого от больных, при помощи специальных методов выделяют ДНК. К ней добавляют реакционный буфер, смесь нуклеозидтрифосфатов, праймеры, полимеразу и 1 12

проводят амплификацию в программируемом термостате (термоциклере). Результат учитывают с помощью электрофореза в агарозиом геле или с помощью иммобилизованных фрагментов ДНК. Присутствие в пробе последовательности-мишени свидетельствует о наличии МБТ в исследуемом образце. ПЦР позволяет выявлять 1-10 бактериальных клеток в 1 мл биологического материала. Специфичность реакции — 97-98%.

Исследованию методом ПЦР подлежат мокрота, бронхиальный секрет, плевральная и другие жидкости, моча, периферическая и менструальная кровь, соскобы эпителиальных клеток цервикального канала.

Следуег отметит ь, что с помощью ПЦР нельзя определить активность туберкулезного процесса, поэтому интерпретировать полученный результат необходимо с учетом клинико-рентгенологических данных. Метод ПЦР можно использовать как дополнительный диагностический метод при дифференциальной диагностике в комплексе с другими методами лабораторной диагностики туберкулеза и нельзя использовать в качестве скринингового метода для выявления больных туберкулезом из-за возможности ложноположительных резуль- iuiob. Кроме ю10. препятствием для широкого использования данного метода служит необходимость использования дорогостоящего оборудования и диагностических наборов.

ПЦР — не единственный амплификационный метод детекции микобактерий. Применение амплификационных методик для выявления различий в генетической структуре чувствительных и устойчивых штаммов —• еще один новый подход к определению лекарственной чувствительности микобактерий. Проводит ь данные исследования стало возможным благодаря определению нуклеотидных последовательностей генов, мутации в которых при водят к возникновению резистентности к противотуберкулезным препарат ам. При использовании амплификационных методов значительно сокращаются сроки исследования. Главным ограничением для их применения служит существование других механизмов резистентности. С помощью амплификационных методик не обнаруживается около 10% случаев устойчивости к рифампицину, 20% — к изониазиду и 40% — к стрептомицину. Поэтому молекулярные методы, никогда не смогут полностью заменить классические культуральные методы определения лекарственной устойчивости МБТ.

Исследования по эпидемиологии туберкулеза в течение длительного времени тормозились отсутствием точного и воспроизводимого метода субтитрования клинических изолятов для изучения распространения штаммов МБ'Г. Совершенствование молекулярно-генетических методов позволило разработать высокоспецифичные маркеры для типирования штаммов МБТ.

Штаммы МБГ невозможно различить с помощью рутинных биохимических тестов или серологических методов. Устойчивость к ПТП в некоторых случаях является воспроизводимым маркером, но этот маркер не является общепринятым. До недавнего времени единственным пригодным методом для типирования штаммов МВТ служил метод фаг оптирования. Однако он технически сложен и использовался в немногих лабораториях, поскольку не позволяет добиться необходимой специфичности, и с его помощью можно выделить лишь ограниченное число фаготипов.

Генотипирование позволяет использовать в качестве маркеров тонкие различия в хромосоме микобактерий, не вызывающие фенотип и ческих различий. Поскольку получаемая в результате исследования картина индивидуачьна для конкретного штамма (как отпечатки патьцев для человека), данный метод получил название геномной дактилоскопии (DNA fingerprint).

Для типирования чаще всего используют специфичную для М tuberculosis повторяющуюся мобильную последовательность ДНК, которая демонстрирует необходимый уровень полиморфизма. Число копий этой последовательности высоко у большинства изолятов М. tuberculosis (7-20), низко у большинства изолятов М. bovis от животных (1-4) и у различных штаммов А/, hovis BCG (1-2).

Метод генотипирования основан на использовании рсстрикционных эндонуклеаз. которые распознают специфические последовательности и нарезают ДНК на фрагменты разной длины. Содержание гуанина и цитозина в микобактериальной ДНК высоко (около 65%), поэтому целесообразным признано использование энзимов, распознающих фрагменты, богатые аденином и тимином, и разрезающих Д11К на небольшое число крупных фрагментов.

Использование метода в стандартном варианте осложняется необходимостью экстракции почти 1 мкг

ДНК из каждою изолята. Поэтому в настоящее время разработаны два варианта метода геномной дактилоскопии, основанные на использовании ПЦР. Они позволяют использовать очень маленькое количество ДНК и получать картину, сопоставимую по специфичности со стандартным методом. В таких вариантах исследование может быть выполнено на бактериях из нескольких колоний или старых нежизнеспособных культурах, а также клинических бактериоскопически положительных образцах.

Выделенные при вспышке заболевания изоляты МБТ с большой долей вероятности демонстрируют одинаковую генотипическую картину. Поэтому изоляты, связанные с конкретной вспышкой заболевания, можно легко идентифицировать. Однако пока не проведено масштабное исследование с целью определения предполагаемого числа возможных геногипических вариантов в конкретном географическом регионе.

Первым применением генотипирования изолятов МБТ было отслеживание вспышек туберкулеза. Так, с использованием этого метода была установлена причина вспышки туберкулеза, вызванной инъекциями контаминированных лекарственных препаратов. Эта работа продемонстрировала полезность геномной дактилоскопии для проведения эпидемиологических исследований и показала, что с использованием данного метода можно идентифицировать изоляты, связанные со вспышкой, среди большого количества изолятов. Доказана полезность геномной дактилоскопии в отслеживании распространения полирезистентных штаммов. В результате нескольких исследований было описано нозокомиальное распространение таких штаммов среди ВИЧ-инфицированных больных. В каждом из таких исследований были идентифицированы 1 или 2 штамма, связанные со вспышкой заболевания. Используемая для типирования последовательность ДНК не кодирует лекарственную чувствительность, поэтому резистентность к ПТП не влияет на картину фингерпринта. Однако в данном случае фингерпринт может служить маркером данного штамма и указывать на лекарственную резистентность новых изолятов с таким же фингерпринтом.

При эпидемиологических исследованиях вспышек полирезистентного туберкулеза лекарственная устойчивость указывает на возможность эпидемиологической связи между штаммами, геномная дактилоскопия обеспечивает окончательное доказательство. Метод даже более полезен для проведения исследования полирезистентных изолятов, поскольку это единственный метод доказательства родства штаммов. Широкомасштабное применение этого метода ко всем изолятам в данной географической зоне может выявить циркулирующие штаммы МБТ и идентифицировать ранее неизвестные источники распростра­нения туберкулезной инфекции. Однако в настоящее время еще не установлено, является ли такое применение метода практически осуществимым, поскольку лабораторное изучение изолятов МБТ легче, чем исследования, необходимые для отслеживания распространения штаммов с использованием геномной дактилоскопии. Метод можно также использовать для подтверждения кросс-контаминации культур и других ошибок, допускаемых при лабораторном исследовании.

… лабораторная диагностика занимает ведущее место в выявлении многих инфекционных заболеваний.

Диагностика туберкулеза основывается на данных клинических, гистологических, микробиологических исследований, оценке результатов туберкулиновых проб и тест-терапии. Из этих методов самым надежным является обнаружение микобактерий туберкулеза (МБТ), остальные же информативны только в комплексе. Современная микробиологическая диагностика туберкулеза состоит из нескольких основных групп анализов, направленных на:

• выявление (обнаружение) возбудителя;
• определение лекарственной устойчивости;
• типирование микобактерий туберкулеза.

ОБНАРУЖЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ

Бактериоскопические методы. Обнаружение возбудителя начинается с наиболее простых и быстрых бактериоскопических методов: световой микроскопии с окраской по Цилю–Нильсену и люминесцентной микроскопии с окраской флюорохромами. Преимущество бактериоскопии – в быстроте получения результата, однако возможности ее ограничены из-за низкой чувствительности. Этот метод является наиболее экономичным и рекомендован Всемирной организацией здравоохранения в качестве основного для выявления заразных больных.

Метод биологической пробы. Наиболее чувствительным способом обнаружения МБТ считается метод биологической пробы – заражение диагностическим материалом высокочувствительных к туберкулезу морских свинок.

Молекулярно-генетическая диагностика. Развитие молекулярной биологии позволило значительно повысить эффективность обнаружения микобактерий. Базовым методом молекулярно-генетических исследований является полимеразная цепная реакция (ПЦР), направленная на выявление ДНК микобактерий в диагностическом материале. ПЦР дает экспоненциальную амплификацию специфического участка ДНК возбудителя: 20 циклов ПЦР приводят к увеличению содержания исходной ДНК в 1 миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле. Роль молекулярной диагностики в клинической практике повышается, поскольку увеличивается число больных со скудным бактериовыделением. Однако при установлении диагноза результаты ПЦР являются дополнительными и должны сопоставляться с данными клинического обследования, рентгенографии, микроскопии мазка, посева и даже ответа на специфическое лечение.

Туберкулинодиагностика. Косвенные методы для определения наличия МБТ в организме больного базируются в основном на выявлении специфических антител. Исторически первым методом является туберкулинодиагностика – она заключается в выявлении иммунных реакций, развивающихся в коже при введении туберкулина. Из большого количества вариантов туберкулиновых проб в настоящее время широко используется внутрикожная проба Манту. Методы туберкулинодиагностики сохранили свое диагностическое значение только среди пациентов детского и подросткового возраста.

Вспомогательную роль в диагностике внелегочного туберкулеза играют пробы с подкожным введением туберкулина, когда ориентируются на характерную очаговую реакцию (туберкулез глаз, туберкулез женских половых органов). Более широкому применению туберкулиновых проб с диагностической целью у взрослых препятствует невозможность в большинстве случаев отличить состояние инфицированности и болезни.

Иммуноферментный анализ. Существуют методики для определения антител к МБТ в различных биологических субстратах с помощью иммуноферментного анализа. Главная проблема, возникающая при разработке специфической иммунодиагностики, заключается в получении препаратов антигенов и антител, позволяющих добиться оптимального соотношения чувствительности и специфичности тестов. Сейчас преобладает мнение о целесообразности использования этих методов только для скрининга туберкулеза и отбора пациентов для детального обследования.

Диагностики ex juvantibus (тест-терапия). В случаях, когда указанные методы не позволяют подтвердить активный туберкулез (легких), можно использовать метод диагностики ex juvantibus. Больным с клиническими симптомами и рентгенологическими изменениями, которые свидетельствуют об активном туберкулезе или сомнительной активности процесса, а также при гиперергической туберкулиновой пробе назначают химиотерапию противотуберкулезными препаратами. В таких случаях через 2 – 3 месяца необходимо повторное рентгенологическое исследование. При заболевании туберкулезной этиологии отмечается частичное или полное рассасывание воспалительных изменений (это так называемый отсроченный диагноз).

Тест CLINISPOT-TB. Новый лабораторный тест для диагностики туберкулеза CLINISPOT-TB заключается в определении количества Т-лимфоцитов, высвобождающих -интерферон при контакте со специфическими антигенами МБТ. Наличие эффекторных Т-лимфоцитов свидетельствует об инфицировании МБТ. CLINISPOT-TB обладает высокой чувствительностью, позволяя выявлять единичные Т-лимфоциты и таким образом диагностировать латентную инфекцию, а также инфекцию у лиц со сниженным иммунным ответом. Высокая специфичность теста достигается использованием антигенов, специфичных для патогенных штаммов MБТ, что приводит к отсутствию ложноположительных результатов у вакцинированных или инфицированных другими микобактериями лиц. В ходе клинических исследований было показано, что чувствительность теста CLINISPOT-TB при активном туберкулезе достигает 96% даже у пациентов с внелегочной локализацией процесса, в то время как чувствительность кожной пробы составляла 69%.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ

Метод абсолютных концентраций. По приказу Минздравсоцразвития России № 109 от 21 марта 2003 г. в бактериологических лабораториях используется метод абсолютных концентраций: посев выделенных культур микобактерий на плотную питательную среду с критическими концентрациями противотуберкулезных препаратов. В случае выявления устойчивости к препаратам первого ряда (рифампицину, изониазиду, пиразинамиду, стрептомицину и этамбутолу) проводят исследование на устойчивость к препаратам резервного ряда (фторхинолонам, амикацину,капреомицину, циклосерину, парааминосалициловой кислоте, этионамиду, протионамиду).

Посев на жидкие питательные среды в системе BACTEC MGIT 960. В крупных противотуберкулезных центрах используют методы определения лекарственной устойчивости МБТ при посеве на жидкие питательные среды в системе BACTEC MGIT 960. Эта система проводит автоматизированный учет роста микобактерий, позволяя сокращать срок анализа до 14 дней.

Разрабатываются и внедряются новые методы оценки лекарственной устойчивости по мутациям в геноме МБТ и на основе микрочиповой технологии. Работа по изучению молекулярных механизмов резистентности показала наличие у микобактерий генов, мутации в которых определяют развитие устойчивости к различным препаратам: к изониазиду – гены katG, inhA, ahpC/oxyR, kasA, furA и ndh, к рифампицину – rpoB, к стрептомицину – rpsL, к фторхинолонам – gyrA и т.д. Большие надежды в области определения лекарственной устойчивости микобактерий связаны с развитием микрочиповой технологии. Этот высокочувствительный метод позволяет определять устойчивость микобактерий одновременно к нескольким противотуберкулезным препаратам непосредственно в диагностическом материале в течение 2 дней.

ТИПИРОВАНИЕ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА

Комплекс методов имеется и для типирования микобактерий, в котором используются культуральные, биохимические, биологические, а также молекулярно-генетические методы. На основе молекулярно-генетического типирования микобактерий интенсивно развивается область молекулярно-эпидемиологических исследований, в которой по генотипу микобактерии выявляются очаги и прослеживаются пути распространения туберкулезной инфекции.

Начиная с открытия Коха, длительное время основным и наиболее распространенным методом выявления микобактерий туберкулеза являлась бактериоскопия.

В настоящее время метод бактериоскопии считается недостаточным для диагностики туберкулеза. В практической работе противотуберкулезных учреждений необходимо чаще применять посев исследуемого материала на питательную среду, т. е. бактериологический метод.

Кроме бактериоскопии и метода посева, необходимо в ряде случаев использовать и прививки лабораторным животным, т. е. биологический метод.

Микобактерии туберкулеза можно обнаружить в различном материале, полученном от больного. Таким материалом является прежде всего мокрота. С усовершенствованием лабораторных методов удается обнаружить микобактерии туберкулеза в мокроте при незначительных изменениях в легких, а в ряде случаев — и без видимых на рентгенограмме туберкулезных поражений в легких. При отсутствии мокроты или невозможности ее получения исследуют промывные воды желудка. Этот способ после работ Арман-Делилля [Armand-Delill, 1927] имеет широкое применение в практике противотуберкулезных учреждений. Предполагали, что микобактерии туберкулеза попадают с мокротой в желудок как у взрослых, так и особенно у детей, страдающих легочным туберкулезом. Исследования и клинические наблюдения, проведенные в СССР и за рубежом, показали, что микобактерии туберкулеза в промывных водах желудка можно обнаружить не только при легочном, но и при внелегочном туберкулезе (кожи, костей, глаз, лимфатических узлов). Эти наблюдения доказывают возможность поступления микобактерии туберкулеза в желудок лимфогематогенным путем независимо от локализации туберкулезного процесса.

При отсутствии мокроты можно исследовать, кроме промывных вод желудка, слизь из гортани, а также промывные воды бронхов. Для этого больному натощак после предварительной анестезии дыхательных путей 1 % раствором дикаина орошают гортань подогретым изотоническим раствором хлорида натрия (10—15 мл) с помощью гортанного шприца. При этом необходимо создать такое положение больного, которое способствовало бы попаданию раствора в бронхи пораженного легкого. Изотонический раствор хлорида натрия, раздражая слизистую оболочку бронха, вызывает усиленное отделение слизи. Выделяемые при откашливании больным промывные воды бронха собирают в стерильный сосуд и подвергают дальнейшему исследованию.

Можно исследовать микобактерии туберкулеза, выделенные в фекальных массах, но при обнаружении в них микобактерий туберкулеза трудно решить вопрос, из каких органов последние выделяются.

Исследовать можно также мочу, спинномозговую жидкость, другие биологические жидкости и патологический материал.

Бактериоскопические методы выявления микобактерий туберкулеза

Бактериоскопические методы выявления микобактерий включают: обычную бактериоскопию мазков, окрашенных по Цилю — Нильсену, флотацию и люминесцентную микроскопию.

Обычная бактериоскопия. В мазках, окрашенных по Цилю — Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены только при наличии не менее 50 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (предел чувствительности метода), причем тогда, когда микобактерии не изменены тинкториально или морфологически под влиянием антибактериальных препаратов (при лечении больного).

Для приготовления мазков мокроту выливают в чашку Петри и заостренными деревянными палочками из 5—6 участков выбирают гнойные комочки на два предметных стекла для приготовления мазков. Один препарат используют для исследования на эластические волокна. На другом стекле комочки мокроты растирают третьим стеклом и получают таким образом два препарата, один из которых окрашивают по Цилю — Нильсену, а второй, например, флюорохромными красками, если имеется возможность произвести люминесцентную микроскопию.

При окраске по Цилю — Нильсену на препарат наливают карболовый фуксин, подогревают до появления паров, обесцвечивают 6% раствором серной кислоты или 3% солянокислым алкоголем и докрашивают 0,25% раствором метиленового синего.

Окрашенные мазки микроскопируют с иммерсионной системой. При этом микобактерии туберкулеза выглядят красными на синем фоне. Типичные микобактерии имеют вид тонких, прямых или слегка изогнутых зернистых палочек.

Количество микобактерий туберкулеза, обнаруживаемых методом бактериоскопии в мокроте больного, зависит от многих причин и может колебаться в различных пределах. Учитывая возможные случайности и затруднения для определения количества микобактерий туберкулеза, мокроту больного рекомендуется исследовать повторно.

С введением в практику бактериостатических средств, препятствующих росту и размножению микобактерий туберкулеза в организме больного, определение количества их в мокроте в период лечения может быть относительным критерием эффективности антибактериальной терапии, учитывать который необходимо в комплексе с клиническими, рентгенологическими и другими лабораторными исследованиями. При отрицательных результатах бактериоскопии мокроты больных туберкулезом или лиц, подозрительных на туберкулез, рекомендуется производить повторные исследования мокроты 4—5 дней подряд или гомогенизировать мокроту при помощи химических веществ, т. е. превращать в однородную массу, и центрифугировать ее с целью концентрации микобактерий туберкулеза в небольшом объеме.

В мокроте могут быть различные форменные элементы: лейкоциты, эритроциты, эпителий, альвеолярные клетки, пылевые клетки, цилиндрический мерцательный эпителий, эластические волокна, известковые соли, кристаллы холестерина. Плоский эпителий может исходить из полости рта, глотки, гортани. У лиц, вдыхающих угольную пыль и дым, в мокроте обнаруживаются пылевые клетки. Цилиндрический эпителий может включаться в мокроту при прохождении последней через бронхи и трахею. Эритроциты, единичные и неизмененные, могут попадать в мокроту из поврежденных десен и носоглотки, но наличие эритроцитов в мокроте может быть и вследствие кровохарканья.

В мокроте могут быть, кроме описанных, эластические волокна Коплена — Джонса, или коралловидные. Они представляются толстыми, шероховатыми образованиями, заканчивающимися колбасообразно. Можно обнаружить и обызвествленные эластические волокна.

Наличие эластических волокон в мокроте указывает на разрушение легочной ткани. При свежем распаде пучки волокон сохраняют альвеолярное строение, при пролиферативных формах туберкулеза эластические волокна выделяются в виде пучков без сохранения альвеолярного строения. Волокна могут выделяться при всех формах туберкулеза; волокна Коппена — Джонса появляются преимущественно в случаях старого туберкулеза. Обызвествленные волокна можно видеть при распаде обызвествленных очагов во время обострения процесса.

Необходимо иметь в виду, что эластические волокна также можно обнаружить и при ряде нетуберкулезных заболеваний легких, например при абсцессе легких.

В мокроте больных туберкулезом можно обнаруживать известковые соли (карбонаты и сульфаты), имеющие под микроскопом вид темных зерен разной величины. Попадают они в мокроту чаще всего из старых, распадающихся обезвествленных очагов. Известковые соли от прибавления разведенной азотной кислоты растворяются.

Кристаллы холестерина в мокроте имеют вид нежных пластинок разной величины, большей частью с обломанными краями. Эти кристаллы обнаруживаются при наличии в легких старых каверн.

Метод флотации. Этот метод применяется в случаях скудного содержания микобактерий туберкулеза в исследуемом материале и при отрицательном результате бактериоскопии. По сравнению с обычной бактериоскопией микобактерии туберкулеза обнаруживаются методом флотации в патологическом материале примерно на 10—15% чаще. Для исследования методом флотации мокроту в количестве 12—15 мл помещают в колбу емкостью 250 мл, добавляют примерно равное количество 0,5% раствора едкого натра или кали и для лучшей гомогенизации встряхивают в течение 5—10 мин, затем до половины емкости колбы наливают дистиллированную воду с добавлением 0,5 мл ксилола или бензина. Все содержимое встряхивают 5—10 мин, после чего доливают дистиллированную воду до окончательного объема — 250 мл. Спустя 30—60 мин капельки бензина (ксилола) всплывают на поверхность, увлекая за собой микобактерии туберкулеза, концентрируя их в небольшом объеме образовавшегося на поверхности кольца. Полученное флотационное кольцо пипеткой переносят на два предметных стекла. Один препарат окрашивают по Цилю — Нильсену.

При флотации промывных вод, гноя, экссудата, спинномозговой жидкости и другого материала, не требующих гомогенизации, к ним добавляют меньшее количество раствора щелочи (от 1—2 капель до 1—2 мл в зависимости от количества материала). В дальнейшем поступают так же, как при флотации мокроты.

Люминесцентная микроскопия. Метод люминесцентной микроскопии основан на способности микобактерий туберкулеза, окрашенных флюорохромами, светиться под воздействием сине-фиолетовых лучей.

Этот метод позволяет дополнительно выявлять микобактерии туберкулеза на 17% чаще по сравнению с обычной бактериоскопией и на 8% чаще по сравнению с методом флотации. При люминесцентной микроскопии исследование производится при малом увеличении, что расширяет поле зрения и способствует обнаружению микобактерий туберкулеза, содержащихся в исследуемом материале в небольшом количестве.

Для люминесцентного исследования пользуются либо специальным микроскопом (МЛ-1 и МЛ-2), либо обычным микроскопом типа МБИ-1 с добавочным осветителем. Ко всем комплектам осветительной аппаратуры прилагаются наборы необходимых светофильтров.

Люминесцентным методом исследуют различный патологический материал. Фиксированные над пламенем препараты

окрашивают при легком подогревании в течение 15 мин специальной смесью: аурамин 00—0,5 г, радомин С — 0,05 г на 1000 мл дистиллированной воды. Затем мазок промывают водой и в течение полминуты обесцвечивают 3% солянокислым спиртом, снова промывают водой и докрашивают для гашения фона 0,25% раствором метиленового синего. При люминесцентной микроскопии микобактерии флюоресцируют золотисто-желтым цветом на темном нефлюоресцирующем фоне. Этот метод в настоящее время находит широкое применение.

Бактериологические методы

Больной туберкулезом в процессе антибактериального лечения может выделять микобактерии туберкулеза, измененные морфологически и в небольшом количестве, что не позволяет обнаружить их бактериоскопическими методами (обычная бактериоскопия, метод флотации, люминесцентная микроскопия). Поэтому в комплекс исследований, направленных на обнаружение микобактерий туберкулеза, в настоящее время обязательно включается посев патологического материала. Выделение культур микобактерий туберкулеза позволяет определить жизнеспособность возбудителя, его лекарственную чувствительность, ферментативную активность и вирулентность.

Для бактериологического исследования может быть использован любой патологический материал.

Поскольку обычно в посевном материале содержится и неспецифическая микрофлора, требуется его так обработать, чтобы уничтожить сопутствующую микрофлору и сохранить при этом жизнеспособность микобактерий туберкулеза.

В последние годы в связи с широким применением противотуберкулезных препаратов в 19—20% случаев наблюдается диссоциация между обнаружением микобактерий туберкулеза при бактериоскопическом исследовании и ростом их при посеве патологического материала. Это явление заключается в том, что видимые под микроскопом, они не растут на питательных средах. Такая диссоциация обусловлена воздействием на микобактерии туберкулеза лекарственных препаратов.

Биологическая проба. Наиболее чувствительным методом обнаружения микобактерий туберкулеза является заражение морских свинок. Однако не всегда удается получить развитие генерализованного туберкулеза в тех случаях, когда в патологическом материале содержатся микобактерии туберкулеза, устойчивые к препаратам гидразида изоникотиновой кислоты. В таких случаях микобактерии оказываются невирулентными для этих животных, и тогда при положительном результате посева патологического материала имеет место отрицательный исход заражения.

При развитии туберкулезного процесса после подкожного заражения в области введения материала к концу месяца прощупываются увеличенные лимфатические узлы. Аллергические реакции определяются при внутрикожном введении 0,1 мл ATK 1 : 10. При положительной биологической пробе у морских свинок развивается генерализованный туберкулез.