658 мутация в гене pa вируса гриппа
Японские ученые обнаружили, что под действием недавно появившегося противовирусного препарата балоксавира вирус гриппа приобретает новую мутацию. Она делает его устойчивым к лекарству, но не влияет на способность размножаться и инфекционность. Это свойство балоксавира едва ли приведет к его исчезновению с рынка, но, возможно, его перестанут использовать так широко (он популярен в японских семьях). Исследование опубликовано в журнале Nature Microbiology.
Препарат Ксофлюза (балоксавира марбоксил) был официально одобрен для применения в Японии в конце февраля 2018 года. Это первое в своем роде противовирусное средство: балоксавир блокирует работу полимеразы — фермента, который копирует генетическую информацию вируса гриппа, и эффективен против штаммов H1N1 и H3N2. В сезоне 2018–2019 года на долю балоксавира пришлось около 40 процентов продаж противовирусных средств в Японии, и вскоре он должен быть одобрен еще в 20 странах.
Еще в ходе клинических испытаний этого препарата появились сведения о том, что у некоторых пациентов развивается устойчивость. У 10 процентов взрослых людей и 23,4 процентов детей, которые участвовали в третьей фазе испытаний, обнаружили вирусные частицы с мутацией в одном и том же участке гена полимеразы. В то же время появились данные о том, что мутантные штаммы хуже размножаются, поэтому развитие устойчивости не помешало одобрить препарат для клиники.
Масаки Имаи (Masaki Imai) и его коллеги из Токийского Университета подвели итоги первого сезона применения балоксавира — зимы 2018–2019 года. Для начала они изучили, насколько искомая мутация в позиции PA-I38 распространена среди исходных представителей вирусов гриппа. Ученые собрали образцы вируса у 253 пациентов, но мутацию обнаружили только у двоих.
Один из этих случаев особенно заинтересовал исследователей. Это была трехлетняя девочка, которая, судя по всему, подхватила инфекцию от старшего брата. Брат заболел раньше и успел получить дозу балоксавира, который поначалу смягчил симптомы его болезни, но потом вирус начал размножаться снова. И у брата, и у сестры врачи обнаружили одну и ту же мутантную разновидность вируса — что говорит о том, что мутация не помешала вирусу размножиться и заразить нового хозяина.
Всего исследователи проанализировали 38 образцов вирусов у людей, которые прошли лечение балоксавиром. Из них 22 были заражены штаммом H1N1 и 16 — H3N2, и среди них у 5 и 4 соответственно нашлась мутация в той же области генома. Из этих 9 человек все, кроме одного, были детьми — что, вероятно, указывает на то, что вирус более склонен мутировать в детском организме или легче выживает в нем после мутации.
Тогда ученые решили проверить, как изменяются свойства вируса после мутации. Сначала они заразили мутантными вирусами культуру клеток собачьей почки. Все типы мутации, которые могут возникнуть в позиции PA-I38, позволили вирусам размножиться в клетках, хотя несколько слабее, чем исходным штаммам (p = 0,0001–0,0065).
Затем исследователи заразили теми же вирусами сирийских хомячков. Все типы мутантных вирусов вызвали инфекцию — что можно было отследить по тому, как животные теряли вес. В некоторых случаях мутантные вирусы действовали на хомячков слабее, чем контрольные, но одна разновидность оказалась неотличима от контроля. Это означает, что свою способность вызывать заболевание и размножаться в клетках хозяина вирусы сохраняют и после мутации.
Наконец, авторы работы проверили способность вирусов передаваться между животными. Они заразили мутантными штаммами несколько хорьков и поселили их в клетки со здоровыми хорьками. Все здоровые животные оказались успешно заражены.
Таким образом, ученые подтвердили, что под действием балоксавира количество устойчивых штаммов вируса в популяции растет, а сами эти штаммы не становятся безопаснее для людей. Это не означает, что балоксавир представляет серьезную угрозу — частота возникновения мутаций все же не очень велика, и на вирус могут потом подействовать другие препараты. Однако это ограничивает возможности для его применения, например, в семьях, где вероятность распространения мутантных форм довольно высока.
Георгий Александрович Базыкин — кандидат биологических наук, заведующий сектором молекулярной эволюции в Институте проблем передачи информации им. А. А. Харкевича РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории эволюционной геномики факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М. В. Ломоносова. Занимается изучением различных вопросов биологической эволюции с использованием методов геномики и биоинформатики.
Юрий Эдуардович Стефанов — кандидат биологических наук, научный сотрудник Института молекулярной биологии РАН им. В. А. Энгельгарта и научный консультант студии научного дизайна Visual Science. Область научных интересов — эволюция мобильных генетических элементов, трехмерное компьютерное моделирование вирусных частиц.
В общественном сознании закрепилось довольно легкомысленное отношение к гриппу. Действительно, зачастую его симптомы не тяжелее простудных, да и беспокоит он нас не дольше недели, причем проходит обычно без всякого лечения. Однако история взаимодействий человека и вируса гриппа требует более серьезного подхода к этому патогену. Достаточно вспомнить, что одни из самых страшных пандемий прошлого века были вызваны этим вирусом * . Да и обычный сезонный грипп далеко не безвреден: по оценкам Всемирной организации здравоохранения, ежегодно от него и связанных с ним осложнений умирают сотни тысяч человек (в первую очередь, пожилые люди, младенцы и страдающие хроническими заболеваниями), а в годы тяжелых пандемий — миллионы. По числу унесенных жизней среди инфекционных заболеваний грипп уступает, пожалуй, только ВИЧ. Основная проблема профилактики и лечения гриппа связана с тем, что вирус очень быстро меняется, и каждый год мы имеем дело с его новыми формами, поведение которых далеко не всегда можно предсказать. Очередным шагом на пути к пониманию изменчивости вируса гриппа стал компьютерный анализ последовательностей аминокислот в белках вируса и нуклеотидов в его геноме.
Первая в мире полная достоверная модель вируса гриппа A/H1N1 с атомным разрешением, созданная в рамках проекта Viral Park компании Visual Science при участии Национального центра биотехнологии в Мадриде. Цель проекта — построение научно достоверных 3D-моделей распространенных вирусов человека с максимальной детализацией. Специалисты Visual Science собирают воедино данные огромного количества работ по молекулярной биологии, вирусологии и кристаллографии вирусов, мнения экспертов ведущих научных центров мира и результаты молекулярного моделирования, полученные научным отделом компании. Модель в значительной степени построена на основе данных, опубликованных исследовательскими коллективами под руководством: Хуана Ортина (Испанский национальный центр биотехнологий, Мадрид, Испания), Такеши Нода (Университет Токио, Япония), Роба Ригро (Отдел взаимодействий вируса и клетки, Гренобль, Франция) и Питера Розенталя (Национальный институт медицинских исследований, Лондон, Великобритания). Точное строение генома вируса гриппа удалось смоделировать благодаря сотрудничеству с Хайме Мартин-Бенито (Испанский национальный центр биотехнологий, Мадрид, Испания), группа которого добилась уникальных результатов в описании упаковки вирусного генетического материала. Создатели модели: Иван Константинов (руководитель проекта), Юрий Стефанов (научный консультант), Анастасия Бакулина (ведущий молекулярный моделлер), Дмитрий Щербинин (молекулярный моделлер), Александр Ковалевский (3D-моделлер)
Сегментированный геном
Общая длина генома вируса гриппа составляет приблизительно 13 500 нуклеотидов [2]. Три самых крупных (примерно по 2300 нуклеотидов) его сегмента (PA, PB1 и PB2) кодируют вирусную полимеразу — белок, копирующий РНК и состоящий из трех крупных субъединиц. Четвертый по длине (около 1750 нуклеотидов) сегмент (HA) отвечает за синтез гемагглютинина. Этот белок заякорен в липидной оболочке вируса и отвечает за его проникновение в клетку, связываясь с рецептором на поверхности клеточной мембраны [3]. В зависимости от того, какой именно вариант гемагглютинина несет вирус, связывание может быть более или менее крепким. После этого клетка поглощает вирус, помещая его в мембранный пузырек внутри цитоплазмы. Большинство макромолекулярных комплексов, поглощаемых таким образом, перевариваются клеткой. Однако вирус избегает этой участи: его мембрана сливается с мембраной пузырька, в результате чего ее содержимое оказывается в цитоплазме. В этом процессе гемагглютинин также играет важную роль. Затем геном вируса проникает в ядро, где с него может начать считываться информация.
Сегмент размером около 1550 нуклеотидов (NP) кодирует нуклеопротеин — белок, необходимый вирусу для упаковки РНК. Множество копий такого белка распределяется по каждому из геномных сегментов, связываясь с молекулой нуклеиновой кислоты. В результате фрагменты генома образуют нуклеопротеидные тяжи, сложенные пополам и закрученные в спираль, к каждому из которых прикрепляется своя копия полимеразного комплекса [4].
Сегмент M1/M2 длиной 1000 нуклеотидов, в соответствии со своим названием, кодирует сразу два белка — М1 и М2. Из молекул первого из них образован слой (матрикс), подстилающий вирусную липидную оболочку. Обычно М1 играет ключевую роль в формировании вирусных частиц, поскольку он взаимодействует одновременно с поверхностными белками вируса и внутренними компонентами вирусной частицы. Задача матриксного белка — собрать все составляющие воедино [6]. Белок М2 выполняет роль ионного канала. Он расположен в липидной оболочке вируса и способствует его распаковке в цитоплазме клетки [7].
Последний, самый короткий (из 865 нуклеотидов) сегмент РНК вируса гриппа отвечает за синтез двух белков, которые не попадают в зрелую вирусную частицу. Эти белки называются NS1 и NEP. Первый необходим вирусу, в частности, для того, чтобы блокировать считывание информации с клеточных молекул РНК [8]. Благодаря ему клетке приходится синтезировать преимущественно вирусные белки, оставляя свои собственные нужды. Второй белок, NEP, обеспечивает транспорт новообразованных геномных комплексов вируса из ядра к клеточной мембране, где происходит сборка вирионов [9].
Новые штаммы и поиск реассортаций
Классификация штаммов вируса гриппа основана прежде всего на том, какие именно варианты гемагглютинина и нейраминидазы входят в его состав. Широко известные комбинации букв H и N в сочетании с порядковыми номерами (например, H3N2) как раз и обозначают подтип вируса: гемагглютинин 3, нейраминидаза 2. Таких подтипов десятки, однако человека заражают лишь немногие — обычно те, у которых не слишком большие номера N и H. Наиболее давние хозяева вируса гриппа — птицы, от которых новые штаммы время от времени передаются домашнему скоту и, прямо или опосредованно, людям [10]. Чем более долгий период коэволюции провели вместе патоген и хозяин, тем менее болезненным становится их совместное существование. Птичьи штаммы вируса зачастую оказываются очень опасными после передачи новым хозяевам [11].
Известно, что именно реассортации сегментов РНК привели к возникновению штаммов, которые вызвали пандемии азиатского и гонконгского гриппа в 1957 и 1968 гг., унесшие около 2,5 млн жизней [12]. Возможно, что и испанский грипп начала прошлого века, число жертв которого шло на десятки миллионов, тоже появился в результате такой эволюционной схемы [13].
Подобное исследование можно провести с использованием геномов вируса гриппа, опубликованных в свободном доступе. Избрав в качестве объекта штаммы H3N2, можно составить выборку из 1376 сегментированных геномов, а затем сравнить между собой филогенетические деревья для этих вирусов, построенные в отдельности по каждому из геномных сегментов [15].
В результате такого сравнения оказалось, что число реассортаций примерно сопоставимо для разных сегментов: в ходе эволюции гриппа в популяции человека каждая пара сегментов в недавнем прошлом реассортировала около 50 раз.
Последствия реассортаций
После того как ветви, в которых произошли реассортации, были обнаружены, стало возможным оценить их влияние на накопление в сегментах вирусного генома точечных замен. Для этого можно сравнить время, прошедшее между каждой такой заменой и ближайшей предшествующей ей реассортацией, с тем, которое бы ожидалось из компьютерной модели, если бы реассортации не влияли на замены. Проведенный анализ показал, что по крайней мере в пяти из восьми сегментов генома мутации ускоренно накапливаются после реассортации. Наиболее ярко эффект проявился для нейраминидазы и белка PB1. Ускорение аминокислотных замен после реассортаций вирусных геномов указывает на то, что в такие периоды эволюции вируса гриппа прежде всего происходит адаптация белков к новому генетическому окружению. Из-за того, что вирусные белки взаимодействуют между собой, молекулы из разошедшихся штаммов вынуждены какое-то время изменяться, приспосабливаясь друг к другу.
Интересно, что у нейраминидаз наблюдалось 30 замен, расстояние от которых до ветви, несущей реассортацию, меньше того эволюционного расстояния, на котором мы бы ожидали встретить одну случайную синонимичную замену в гене данного белка. Такой результат свидетельствует о том, что все эти 30 мутаций произошли и закрепились необычайно быстро, и что необходимость быстрой адаптации возникла именно благодаря тому, что соответствующий сегмент генома попал в новое генетическое окружение.
Реассортация — это резкое эволюционное изменение, которое поначалу может снижать общую приспособленность вируса к условиям окружающей среды и к организму-хозяину. Однако иногда оказывается, что из-за такой перетасовки белков из разных штаммов новая форма патогена оказывается более приспособленной, чем штаммы-предшественники, получая возможность эффективнее распространиться [18]. Похоже, что за коррекцию первичного вредного эффекта от реассортации как раз и отвечают быстро закрепляющиеся адаптивные мутации.
Предсказания, полученные только статистическими методами, — путем анализа последовательностей белков и кодирующих их генов, — конечно, не могут иметь стопроцентную точность. Действительно ли взаимодействуют две определенные аминокислоты, можно проверить экспериментально. Однако каждый белок вируса состоит из сотен аминокислот, так что возможны десятки тысяч разных взаимодействий. Постановка такого числа экспериментов практически неосуществимы. Биоинформатический анализ позволяет расставлять приоритеты: выбирать и анализировать только те аминокислоты, которые участвуют во взаимодействиях, экономя время и силы экспериментаторов. Кроме того, такой подход позволяет понять, насколько взаимодействия, приводящие к вредности реассортаций, распространены на уровне всего генома.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 13-04-02098) и Министерства образования и науки Российской Федерации (проект 11.G34.31.0008).
Литература
1. Steinhauer D. A., Domingo E., Holland J. J. Lack of evidence for proofreading mechanisms associated with an RNA virus polymerase // Gene. 1992. V. 22. № 2. P. 281–288.
2. Teng Q., Hu T., Li X. et al. Complete genome sequence of an H3N2 avian influenza virus isolated from a live poultry market in Eastern China // J. Virol. 2012. V. 86. № 21. P. 11944. DOI: 10.1128/JVI.02082-12.
3. Carr C. M., Kim P. S. A spring-loaded mechanism for the conformational change of influenza hemagglutinin // Cell. 1993. V. 73. № 4. P. 823–832.
4. Arranz R., Coloma R., Chichуn F. J. et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins // Science. 2012. V. 338. № 6114. P. 1634–1637. DOI: 10.1126/science.1228172.
5. Kamali A., Holodniy M. Influenza treatment and prophylaxis with neuraminidase inhibitors: a review // Infection and Drug Resistance. 2013. № 6. P. 187–198. DOI: 10.2147/IDR.S36601.
6. Nayak D. P., Hui E. K., Barman S. Assembly and budding of influenza virus // Virus Res. 2004. V. 106. № 2. P. 147–165.
7. Lear J. D. Proton conduction through the M2 protein of the influenza A virus; a quantitative, mechanistic analysis of experimental data // FEBS Lett. 2003. V. 552. № 1. P. 17–22.
8. Hale B. G., Randall R. E., Ortнn J. et al. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses // J. Gen. Virol. 2008. V. 89. № 10. P. 2359–2376. DOI: 10.1099/vir.0.2008/004606-0.
9. Robb N. C, Smith M., Vreede F. T. et al. NS2/NEP protein regulates transcription and replication of the influenza virus RNA genome // J. Gen. Virol. 2009. V. 90. № 6. P. 1398–1407. DOI: 10.1099/vir.0.009639-0.
10. El Zowalaty M. E., Bustin S. A., Husseiny M. I. et al. Avian influenza: virology, diagnosis and surveillance // Future Microbiol. 2013. V. 8. № 9. P. 1209–1227. DOI: 10.2217/fmb.13.81.
11. Kaplan B. S., Webby R. J. The avian and mammalian host range of highly pathogenic avian H5N1 influenza // Virus Res. 2013. V. 178. № 1. P. 3–11. DOI: 10.1016/j.virusres.2013.09.004.
12. Kilbourne E. D. Influenza pandemics of the 20th century // Emerg. Infect. Dis. 2006. V. 12. № 1. P. 9–14.
13. Suzuki Y. A phylogenetic approach to detecting reassortments in viruses with segmented genomes // Gene. 2010. V. 464. № 1–2. P. 11–16. DOI: 10.1016/j.gene.2010.05.002.
14. Nagarajan N., Kingsford C. GiRaF: robust, computational identification of influenza reassortments via graph mining // Nucleic Acids Research. 2011. V. 39. № 6. e34. DOI: 10.1093/nar/gkq1232.
15. Neverov A. D., Lezhnina K. V., Kondrashov A. S., Bazykin G. A. Intrasubtype Reassortments Cause Adaptive Amino Acid Replacements in H3N2 Influenza Genes // PLoS Genet. 2014. V. 10. № 1. e1004037. DOI: 10.1371/journal.pgen.1004037
16. Wolf Y. I., Viboud C., Holmes E. C. et al. Long intervals of stasis punctuated by bursts of positive selection in the seasonal evolution of influenza A virus // Biol. Direct. 2006. V. 1. P. 34.
17. Kryazhimskiy S., Dushoff J., Bazykin G. A. et al. Prevalence of epistasis in the evolution of influenza A surface proteins // PLoS Genet. 2011. V. 7. № 2. e1001301. DOI: 10.1371/journal.pgen.1001301.
18. Li K. S., Guan Y., Wang J. et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia // Nature. 2004. V. 430. № 6996. P. 209–213.
19. Ferguson N. M., Fraser C., Donnelly C. A. et al. Public health. Public health risk from the avian H5N1 influenza epidemic // Science. 2004. V. 304. № 5673. P. 968–969.
20. Yong E. Influenza: Five questions on H5N1 // Nature. 2012. V. 486. № 7404. P. 456–458. DOI: 10.1038/486456a.
21. Herfst S., Schrauwen E. J., Linster M. et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets // Science. 2012. V. 336. № 6088. P. 1534–1541. DOI: 10.1126/science.1213362.
22. Imai M., Watanabe T., Hatta M. et al. Experimental adaptation of an influenza H5 HA confers respiratory droplet transmission to a reassortant H5 HA/H1N1 virus in ferrets // Nature. 2012. V. 486. № 7403. P. 420–428. DOI: 10.1038/nature10831.
23. Russell C. A., Fonville J. M., Brown A. E. et al. The potential for respiratory droplet-transmissible A/H5N1 influenza virus to evolve in a mammalian host // Science. 2012. V. 336. № 6088. P. 1541–1547. DOI: 10.1126/science.1222526.
— Несмотря на многочисленные опровержения учёных и представителей властей, в сети бытует мнение, что новый коронавирус мог быть создан искусственно.
— Эта распространенная гипотеза появилась ещё после возникновения предыдущих коронавирусов SARS-CoV и MERS-CoV. Уже тогда целый ряд исследователей начали поиск и оценку всевозможных коронавирусов в природе. Однако и тогда, и сейчас версии искусственного создания коронавирусов учёные признали маловероятными.
— Как вирусы преодолевают межвидовой барьер? Ещё вчера они поражали определённые виды животных, а сегодня способны инфицировать человека.
— Обычно вирус оказывается способным поражать нового хозяина только после определённых изменений в генах. Далее он должен размножаться внутри клетки, а это не всегда возможно. Для этого тоже нужны определённые условия. Например, если вирус поражает птиц, у которых температура тела выше, чем у человека, то, чтобы адаптироваться к температуре нового носителя, человека, ему нужна соответствующая мутация. Так, некоторые вирусы гриппа птиц выбрали подобный способ и смогли инфицировать человека.
— А что заставляет вирус изменяться? Почему он вдруг решает сменить один вид носителя на другой? Какие факторы на это влияют? И как часто вообще это происходит в природе?
— Любой вирус имеет геном. Он изменяется постоянно. Даже без влияния внешних факторов мутации происходят редко, но с постоянной скоростью. Внешние факторы могут повлиять на скорость и характер мутаций.
Вирусы не принимают решения о смене носителя. Просто их так много, и они так быстро размножаются и изменяются, что появляется много разных версий одного вируса. И какая-то из них в результате случайной мутации может преодолеть межвидовой барьер и поразить другого хозяина. Дальше вирус очень быстро размножается и уже эволюционирует в другом хозяине. Такой процесс постоянно происходит в природе.
Человек сталкивается с громадным числом вирусов животных, растений, грибов, бактерий. Обычно после такой встречи ничего не происходит, поскольку для преодоления вирусами межвидового барьера требуется сочетание множества факторов. На эволюцию вирусов, их мутации и преодоление барьера между видами влияют температура, влажность, иммунитет животного.
— Изменение климата тоже влияет на мутации вирусов?
— Сам климат как таковой на вирус никак не влияет, а вот на его хозяев, на миграции, образ жизни и питание может повлиять существенно. Есть интересная гипотеза, что с оттаиванием льдов и вечной мерзлоты оттаивают и древние вирусы.
— Можно ли повлиять на все эти факторы, чтобы предотвратить появление опасных возбудителей заболеваний или это человеку не подвластно?
— Не думаю, что можно как-то повлиять на эти факторы. Но можно снизить риски. К примеру, правильно применять препараты и проходить вакцинацию, чтобы избежать распространения устойчивых штаммов вирусов и бактерий.
— Способен ли коронавирус переходить от одних животных к другим?
— Теоретически способен. Такие механизмы сейчас изучаются, однако вряд ли это как-то значимо повлияет на эпидемиологию среди людей.
— В начале XXI века уже три коронавируса вызывали вспышки тяжёлых заболеваний у людей: SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2. А в прошлом веке сообщалось только про один такой вирус.
— Я предполагаю, их было много. В XX веке был хорошо изучен один известный постоянный коронавирус — респираторный человеческий вирус HCoV, Human Coronavirus. Это обычный вирус в структуре сезонного ОРВИ. Например, наши десятилетние исследования сезонных респираторных эпидемий выявили его в среднем у 2% пациентов с ОРВИ.
Могу предположить, что небольшие вспышки различных коронавирусов от животных могли происходить и ранее, но диагностика и методы исследований были не на таком уровне, как сегодня.
Не надо забывать, что коронавирусы окружают нас постоянно, они часто поражают домашних животных. Например, коронавирус кур, вызывающий у них инфекционный бронхит, приводит к большим потерям в сельском хозяйстве, но, к счастью, неопасен для людей.
— Какие вирусы, переходящие от животных к людям, могут представлять для человечества опасность в будущем?
— Наибольшую опасность представляют респираторные вирусы животных, которые вызывают острые воспалительные заболевания органов дыхания. Меньшую опасность представляют такие угрозы, как бешенство и клещевой энцефалит. Для заражения ими необходим укус животного или насекомого-переносчика, к тому же от подобных заболеваний разработаны вакцины.
Сейчас более актуальными становятся инфекции, переносимые насекомыми, которые вслед за изменением климата и потеплением проникают всё севернее и могут вызывать бактериальные и вирусные инфекции у человека. Например, вирус лихорадки Западного Нила, различные виды малярии, которые проникают в наши широты с распространением комаров.
— Может ли новый коронавирус мутировать и стать ещё опаснее для человека?
— Это маловероятно. Стратегия вируса заставляет его снижать вирулентность со временем, это показано для большинства актуальных вирусов. В целом высокая летальность — это эволюционный тупик для вируса.
— И он станет сезонным относительно безвредным явлением?
— Уже можно сказать, как этот SARS-CoV-2 поведёт себя в ближайшее время?
— Рискну предположить, что в начале лета распространение утихнет. Но в умеренной форме повторится в октябре — ноябре.
Владельцы патента RU 2563351:
Изобретение относится к области микробиологии. Вакцинный штамм вируса гриппа, Ortomyxoviridae, род Influenza, А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского под №2738. Представленный вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) характеризуется сочетанием таких полезных признаков как антигенная специфичность эпидемического вируса А/Ануи/1/2013 (H7N9), структура генома, оптимальная для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительность и холодоадаптированность, безвредност для хорьков, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации, а также иммуногенность. 5 табл.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении. Создан вакцинный штамм вируса гриппа (Ortomyxoviridae, род Influenza) подтипа A(H7N9) - А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) для профилактики потенциально-пандемического гриппа подтипа A(H7N9) среди взрослых и детей в случае его распространения в человеческой популяции.
В начале 2013 г. впервые были зарегистрированы случаи заражения людей новым вирусом гриппа птиц подтипа A(H7N9), и по данным на ноябрь 2013 г. подтверждено инфицирование 139 людей, включая 45 смертельных случаев. Опасность данных вирусов заключается в том, что они вызывают тяжелые респираторные заболевания у млекопитающих, и при этом являются низкопатогенными для птиц, что способствует их персистенции в популяции птиц. Кроме того, вирусы A(H7N9) характеризуются наличием в геноме множественных маркеров адаптации к клеткам млекопитающих, что создает предпосылки для возникновения новой пандемии A(H7N9). Для того чтобы избежать разрушительных последствий новой пандемии, необходимо иметь в наличии вакцинные штаммы A(H7N9) для своевременной вакцинации наиболее уязвимых групп населения.
Применяемые в настоящее время для профилактики сезонного гриппа А вакцины подтипов A(H1N1) и A(H3N2) не могут вызывать выраженную защитную реакцию в случае возникновения пандемической ситуации, вызванной широким распространением вирусов подтипа A(H7N9), к которым у населения нет иммунитета.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины новой антигенной разновидности на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), используя в качестве источника поверхностных антигенов вирус гриппа птиц А/Ануи/1/2013 (H7N9). Штамм А/Ануи/1/2013 (H7N9), выделенный от человека во время вспышки гриппа H7N9 в Китае в 2013 году, был получен из коллекции Центра по контролю и профилактике заболеваний США (CDC ID №2013759189).
Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - температурочувствительный, холодоадаптированный штамм вируса гриппа, используемый для получения живых гриппозных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1986. - С.66-83]. Применяемые в настоящее время вакцинные штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации современных эпидемических вирусов с холодоадаптированными донорами аттенуации, в результате чего образуются реассортанты с вакцинной формулой генома 6:2 - 6 генов, кодирующих внутренние белки вириона (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS), наследуются от безвредного донора аттенуации, а два поверхностных антигена (гемагглютинин и нейраминидаза) наследуются от антигенно актуального эпидемического штамма. Известен вакцинный штамм А/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1) [Патент №2183672, опубл. 20.06.02], а также вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) [Патент №2319744, опубл. 19.04.06] на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).
Прототипом полученного вакцинного штамма подтипа A(H7N9) является вакцинный штамм подтипа A(H7N3) - А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) для профилактики гриппа в случае наступления пандемии, вызванной вирусами гриппа подтипа A(H7N3) [Desheva J, Rudenko L, Rekstin A, Swayne D, Cox N, Klimov A. Development of candidate H7N3 live attenuated cold-adapted influenza vaccine. In: Proceedings of the International Conference on Options for the Control of Influenza VI, Toronto, Ontario, Canada, June 17-23, 2007 (Ed. Jacqueline M Katz). (2007)]. Однако вирус гриппа подтипа A(H7N9) значительно отличается от вакцинного штамма А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) по антигенным свойствам, в результате чего иммунный ответ на вакцинацию вирусом А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) будет неэффективным в отношении нового вируса A(H7N9). Кроме того, один из важных антигенов вируса - гликозилированный белок нейраминидаза (NA) - существенно различается у вирусов H7N3 и H7N9: гомология по их аминокислотному составу не превышает 50% [Gamblin SJ, Skehel JJ. Influenza hemagglutinin and neuraminidase membrane glycoproteins. The Journal of biological chemistry 285(37), 28403-28409 (2010)]. Такие различия в последовательностях N3 и N9 нейраминидаз говорят о низкой вероятности выработки кросс-реактивных антинейраминидазных антител против NA подтипа N9 после вакцинации штаммом А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3).
Реассортантный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) был получен методом генетической реассортации потенциально-пандемического вируса гриппа А/Ануи/1/2013 (H7N9) с холодоадаптированным температурочувствительным донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) с последующей селекцией при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации, по методу, описанному ранее [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977. - №4, - С.387-395.]. Методом частичного секвенирования участков генов установлено, что вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, M, NS), от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), а поверхностные белки гемагглютинин и нейраминидазу от эпидемического вируса А/Ануи/1/2013 (H7N9).
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕНОВ
Поверхностные антигены вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) гемагглютинин и нейраминидаза - являются идентичными родительскому вирусу А/Ануи/1/2013 (H7N9) по результатам их прямого нуклеотидного секвенирования.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВНУТРЕННИХ ГЕНОВ И НЕСТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ
Показано, что все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации [Klimov A.I., Сох N.J., Yotov W.V. et al. Sequence changes in the live attenuated, cold-adapted variants of influenza A/Leningrad/134/57 (H2N2) virus. Virology. 1992:86:795-797], присутствуют в генах внутренних и неструктурных белков реассортантного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) (табл.1). Дальнейшее полногеномное секвенирование вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) не выявило дополнительных мутаций во внутренних генах вируса.
| Таблица 1. | |||||||||
| Наличие аттенуирующих мутаций во внутренних генах реассортантного вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) | |||||||||
| Ген | Нукл. | Л-дт 1 | Л/17 2 | 17/Ан 3 | Белок | ак | Л-дт | Л/17 | 17/Ан |
| РВ2 | 1459 | G | Т | Т | РВ2 | 478 | Val | Leu | Leu |
| РВ1 | 819 | G | Т | Т | РВ1 | 265 | Lys | Asn | Asn |
| 1795 | G | А | А | 591 | Val | Ile | Ile | ||
| РА | 107 | Т | С | С | РА | 28 | Leu | Pro | Pro |
| 1045 | G | Т | Т | 341 | Val | Leu | Leu | ||
| М | 68 | А | G | G | М1 | 15 | Ile | Val | Val |
| 457 | Т | G | G | 144 | Phe | Leu | Leu | ||
| NS | 798 | G | А | А | NS2 | 100 | Met | Ile | Ile |
| 1 вирус дикого типа, предшественник донора аттенуации: А/Ленинград/134/57 (H2N2); | |||||||||
| 2 донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); | |||||||||
| 3 реассортантный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9). |
АНТИГЕННАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВАКЦИННОГО ШТАММА
| Таблица 2. | |||||
| Антигенная специфичность эпидемического вируса А/Ануи/1/2013 (H7N9) и вакцинного реассортанта А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) по данным РТГА с крысиной сывороткой | |||||
| Антиген | Титр крысиной сыворотки в РТГА | ||||
| К вирусу А/Ануи/1/2013 (H7N9) | Нормальная | ||||
| А/Ануи/1/2013 (H7N9) | 1:320 | 1 , ca 2 | |||
| А/Ануи/1/2013 (H7N9) | 9.0±0.6 | 9.0±0.5 | 8.2±0.4 | 3.5±0.8 | non-ts, non-са |
| А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) | 10.2±0.3 | 2.2±0.5 | 1.7±0.4 | 7.6±0.7 | ts, ca |
| 1 ts, temperature sensitive (температурочувствительный); | |||||
| 2 ca, cold-adapted (холодоадаптированный). |
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32-34°С в течение 48 часов - 10,2 lg ЭИД50/мл.
Гемагглютинирующая активность - 1:512.
Вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 40°С составляет 8,5 lg ЭИД50/мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 26°С равна 2,6 lg ЭИД50/мл).
Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).
Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.
Пример получения вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) представлен в прилагаемом паспорте.
Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского 04.07.2013 года под №2738.
| 1 | Название штамма: | А/17/Ануи/2013/61 |
| 2 | ИЭМ идентификационный №: | 613/1 |
| 3 | Серия: | №1 |
| 4 | Тип/подтип: | H7N9 |
| 5 | Метод подготовки: | Классическая реассортация в куриных эмбрионах |
| 6 | Родительские вирусы | |
| 6.1 Эпидемический вирус: | А/Ануи/1/2013 (H7N9); CDC ID# 2013759189 | |
| 6.2 Донор аттенуации: | А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) | |
| 7 | Число пассажей в процессе реассортации: | Е6/Е1 (скрещивание, два селективных пассажа и три клонирования предельными разведениями + накопление) |
| 8 | Состав генома: | Гены РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS - от донора аттенуации; гены НА и NA - от эпидемического вируса (формула генома 6:2) |
| 9 | Характеристика штамма до лиофилизации | |
| 9.1 Оптимальные условия репродукции: 32°С, 48 часов | ||
| 9.2 Гемагглютинирующая активность: 1:512 с 1.0% куриными эритроцитами | ||
| 9.3 Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 10.2 lg ЭИД50/мл | ||
| 9.4 ts маркер (температурочувствительность репродукции): 1.7 log10 ЭИД50/мл при 40°С (титр при 40°С, ts фенотип) | ||
| 9.5 са маркер (холодоустойчивость репродукции): 7.8 log10 ЭИД50/мл при 26°С (титр при 26°С, са фенотип) | ||
| 10 | Характеристика штамма после лиофилизации | |
| 10.1 Дата лиофилизации: 20.06.2013 | ||
| 10.2 Объем материала в ампуле: 0.5 мл | ||
| 10.3 Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 9.1 lg ЭИД50/МЛ | ||
| 10.4 Гемагглютинирующая активность: 1:256 с 1.0% куриными эритроцитами | ||
| 11 | Антигенная специфичность | |
| 11.1 Гемагглютинин: идентичен вирусу А/Ануи/1/2013 (H7N9) поданным секвенирования и РТГА | ||
| 11.2 Нейраминидаза: идентична вирусу А/Ануи/1/2013 (H7N9) по данным секвенирования | ||
| 12 | Токсикологические исследования in vivo (острая токсичность): | Не токсичен после внутрибрюшинного заражения мышей |
| 13 | Контроль стерильности: | Стерилен (04.07.2013) |
Пример. ПРОВЕРКА БЕЗВРЕДНОСТИ И ИММУНОГЕННОСТИ ВАКЦИННОГО ШТАММА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ХОРЬКАХ
Известно, что наиболее пригодной моделью животных для изучения гриппозных вакцин являются хорьки (Mustela putoris furo). Гриппозная инфекция у этих животных и у человека сходна по симптоматике, течению инфекции, распространению вируса в организме и индукции гуморального иммунного ответа [Langlois I. Viral diseases of ferrets. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2005; 8 (1):139-160.]. Поэтому исследование безвредности и степени аттенуации вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) проводили на этих животных.
Хорьков заражали вакцинным штаммом А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) или родительскими вирусами интраназально 0,5 мл аллантоисной жидкости, содержащей 10 7 50%-ных эмбриональных инфицирующих доз вируса (ЭИД50). Репликацию вируса определяли путем титрования носовых смывов и мазков из зева хорьков каждые 2 сутки после заражения. Для титрования вируса использовали культуру клеток MDCK, а титры вируса выражали в 50%-ных тканевых цитопатических дозах (ТЦИД50). Также концентрацию вируса определяли в гомогенатах тканей зараженных животных (носовые ходы, трахея, легкие, мозг) на 4 сутки после введения вируса. Вакцинный реассортант А/17/Ануи/2013/61 (H7N9), как и донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), являлся аттенуированным для хорьков, поскольку размножался только в тканях верхних дыхательных путей, но не в легких или мозге. Вирус дикого типа А/Ануи/1/2013 (H7N9) реплицировался до высоких титров в легких и тканях мозга, что говорит о его вирулентности (табл.4).
Иммуногенность вакцинного штамма оценивали путем определения титров сывороточных антигемагглютинирующих антител через 2 недели после иммунизации. Вакцинный реассортант А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) был иммуногенным для хорьков: среднегеометрический титр антител в реакции торможения гемагглютинации с гомологичным антигеном достигал значения 127 (табл.5).
Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Ануи/1/2013 (H7N9), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, безвредностью для хорьков, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации, а также иммуногенностью.
| Таблица 4. | ||||
| Репродукция вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) и родительских вирусов в различных органах хорьков | ||||
| Биоматериал | День после заражения | Титр вируса, lg ТЦИД50/мл | ||
| А/Ануи/1/2013 (H7N9) | А/Ленинград/ 134/17/57 (H2N2) | А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) | ||
| Носовые смывы | 2 | 3,9±0,3 | 1,8±0,8 | 1,7±0,2 |
| 4 | 2,6±0,9 | 1,6±0,2 | - | |
| 6 | 1,6±0,3 | 1,6±0,4 | - | |
| 8 | -* | 2,1±0,0 | - | |
| 10 | - | - | - | |
| Мазок из зева | 2 | 4,0±0,3 | 2,9±0,4 | 4,3±0,8 |
| 4 | 5,0±0,1 | 2,2±0,1 | - | |
| 6 | 4,2±0,5 | 3,7±0,9 | - | |
| 8 | 2,1±0,1 | 2,9±0,1 | - | |
| 10 | 2,1±0,0 | 3,0±0,4 | - | |
| Носовые ходы | 4 | 7,3±0,1 | 3,9±0,3 | 3,2±1,2 |
| Трахея | 4 | 5,6±0,3 | - | * |
| Легкие | 4 | 5,2±0,8 | - | - |
| Мозг | 4 | 4,4±0,8 | - | - |
| * вирус не обнаружен | ||||
| Таблица 5. | ||||
| Иммуногенность вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) и родительских вирусов в эксперименте на хорьках | ||||
| Штамм | Среднегеометрические титры антител с антигеном | |||
| А/Ануи/1/2013 (H7N9) | А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) | |||
| А/Ануи/1/2013 (H7N9) | 403 | 5 | ||
| А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) | 5 | 32 | ||
| А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) | 127 | 5 |
Характеристики полученного вакцинного штамма соответствуют требованиям Фармакопейной статьи ФСП 42-0417-4097-03 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения у взрослых и детей, поэтому заявляемый штамм обладает, помимо новизны и изобретательского уровня, техническим результатом, т.е. пригоден для производства живой гриппозной вакцины.
Вакцинный штамм вируса гриппа, Ortomyxoviridae, род Influenza, А/17/Ануи/2013/61 (H7N9), депонированный в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского 04.07.2013 года под №2738, для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.
Читайте также: