Аттенуированных штаммов вируса что это

Первая живая аттенуированная вакцина против кори получена из исходного вирулентного штамма Эдмонстон, выделенного в 1954 г. и прошедшего 7 пассажей в культуре клеток почки человека и 6 пассажей в культуре клеток Vero. После 24 пассажей в культуре клеток почки и 28 пассажей в культуре клеток амниона человека получен штамм Эдмонстон-Эндерс. В дальнейшем его аттенуировали следующим образом:

6 пассажей на куриных эмбрионах (в амниотическую полость); 13 пассажей в культуре клеток куриных эмбрионов; 6 пассажей на куриных эмбрионах (в амниотическую полость); 3 пассажа в культуре клеток куриных эмбрионов; 8 пассажей в культуре клеток куриных эмбрионов (при 36°С); 40 пассажей в культуре клеток куриных эмбрионов (при 32°С).

В результате этих пассажей получен современный аттенуированный вакцинный штамм Moraten. Такой вирус слабо размножался в привитом организме и вызывал слабо выраженные признаки болезни у приматов. Вакцинный штамм имел множественные мутации, часть из которых была связана с изменением прикрепительного белка. Успех вакцинации этим штаммом был обусловлен его слабой репликацией, потомство вирионов часто оставалось на месте репликации, и вакцинация вызывала слабую или инапарантную инфекцию у отдельных пациентов.

В дальнейшем аттенуация этого штамма была продолжена разными авторами, в результате чего получены новые вакцины (Загреб, ALK-C, САМ, Ленинград 16, Шанхай-191). Уровень антител у вакцинированных зависел от возраста пациента и наличия материнских антител. Полиморфизм генов, ответственных за иммунный ответ, также оказывал влияние на сероконверсию. Обычно одна доза (3,0-4,0 lg БОЕ) вакцины вызывала сероконверсию у 80-95% привитых. Когда дозу вакцины для детей 4-6 месячного возраста увеличивали в 10—100 раз, сероконверсия усиливалась. Однако применение высокотитражной вакцины в странах с высокой детской смертностью сопровождалось увеличением смертности девочек в последующие 2—3 года.

Иммунный ответ на живую вакцину подобен иммунному ответу на естественную инфекцию, хотя вакцинальный иммунитет более вариабельный и менее продолжительный. Для предупреждения вспышки кори с учетом ее высокой контагиозности необходимо, чтобы по крайней мере 98% населения было серопозитивными. Роль латентного инфицирования на фоне недостаточного иммунитета в поддержании вируса неизвестна. Корь остается наиболее распространенным заболеванием людей в разных частях света. В центре современной стратегии борьбы с корью остается одновременная массовая вакцинация. Теоретически, корь является идеальным объектом для ликвидации путем иммунизации живой вакциной. Вирус имеет один серотип, большинство случаев болезни легко распознается клинически, не существует животных носителей вируса и существуют эффективные вакцины.

Живые вакцины Jery Lynn, Urabe, Am9 и Ленинград-3 против эпидермического паротита получены путем аттенуации вируса серийным пассированием в куриных эмбрионах (КЭ) и в культуре клеток КЭ. Каждая из этих вакцин представляет собой смесь нескольких аттенуированных штаммов. Например, штамм Jery Lin В аттенуирован пассажами в куриных эмбрионах (17 пассажей) и в культуре клеток куриных эмбрионов. Вакцина из этого штамма представляет собой смесь, по крайней мере, двух аттенуированных штаммов JL5 и JL2 в соотношении 5:1. После однократного парентерального применения живых вакцин ВНА появляются в течение 2 недель у 95% привитых и могут сохраняться более 19 лет. Для профилактики паротита в России применяют живую вакцину Ленинград-3 из аттенуированного штамма (Л-3), размноженного в первичной культуре клеток японских перепелов. Иммунитет развивается примерно у 60% привитых (> 10 000 ТЦД50) и сохраняется не менее 8 лет.

Вирус краснухи аттенуировали серийными пассажами в различных культурах клеток, в результате которых получено несколько вакцинных штаммов. Среди них вакцина HPV77/DE5 из вируса размноженного в культуре клеток эмбриона уток, широко используемая в Северной Америке. Вакцину из штамма Cendehill использовали в Европе. Несколько аттенуированных штаммов получены в Японии.

Иммунитет у вакцинированных связан с циркулирующими антителами, которые появляются через 2—3 недели после вакцинации и сохраняются 20 лет. Эффективная иммунизация предусматривает двукратную вакцинацию на втором году жизни и после 6 лет при вакцинации 95% детей. В России зарегистрированы живые вакцины против краснухи Рудивакс (Франция), SII (Индия) и вакцина MMR (США) против кори, паротита и краснухи. Вакцину MMR прививают лицам старше 15 лет. После однократного введения сероконверсия к трем вирусам развивается не менее, чем у 95% привитых. Антитела сохраняются более 11 лет.

С целью получения живой безопасной иммуногенной вакцины штамм Н2 вируса гепатита А серийно размножали в культуре клеток почки новорожденных обезьян, а затем в культуре фибробластов человека (КМВ17). Этой вакциной в Китае привито более 20 млн человек, и не было отмечено случаев вакцинального гепатита или выделения вакцинного вируса с фекалиями.

Аттенуированный вакцинный штамм ТС-83 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей получен в результате 45 пассажей вирулентного штамма в культуре клеток сердца морской свинки. Аналогичный штамм-15 этого вируса получен серийным пассированием вируса в культуре клеток куриного эмбриона.

Испытания, проведенные на добровольцах, показали, что живая вакцина против цитомегаловирусной инфекции человека из штамма Таун была безопасной и защищала от заболевания, но не от инфицирования полевым штаммом вируса. Вакцинный вирус не выделялся из организма привитых пациентов.

Единичные точечные мутации в геноме многих вирусов сопровождаются аминокислотными заменами в поверхностных белках и аттенуацией. Так было с вирусами лихорадки долина Рифт, Синдбис, клещевого и японского энцефалитов и другими вирусами. У аттенуированного штамма ТС-83 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей выявлены замены одной аминокислоты в Е-1, пяти аминокислот в Е2 и делеция в З'-концевой некодирующей области генома.

Вакцинный штамм 17-D вируса желтой лихорадки содержит мутации в гене, кодирующем протективный гликопротеин VP3. Нуклеотидная дивергенция вакцинного штамма составляла 1%.

Тканевой тропизм и нейровирулентность реовирусов млекопитающих и птиц определяются генными сегментами S-1, кодирующими поверхностный белок Q-1. Вирионный белок Q-1 реовирусов так же, как VP1 пикорнавирусов, ответственен за тропизм к клеткам хозяина и представляет главную мишень для нейтрализующих антител.

Природно аттенуироваиные мутанты реовируса с измененным тропизмом к клеткам центральной нервной системы могут быть изолированы экспериментально селекцией вируса с изменениями в капсидном протеине Q-1. Реовирусные мутанты проявляют пониженный тропизм к специфическим участкам мозга, хотя размножаются нормально во внутренних органах экспериментально инфицированных мышей.

Выявлена интересная зависимость между вирулентностью коронавирусов кошек и клеточным тропизмом. Вирулентные штаммы в основном поражают моноциты авирулентные — реплицируются в эпителии кишечника.

В аттенуации вируса простого герпеса важная роль принадлежит гликопротеинам. Мутанты вируса с делециями в генах гликопротеинов G и Е оказались аттенуированными для мышей. Гликопротеины D и Н также играют существенную роль в тканевом тропизме и инфекционности вируса. Делеция аминокислотных остатков в положении 324-244 гликопротеина D полностью исключает эти функции]. Определенный вклад в инфекционность вируса вносит гликопротеин С. Вирус, лишенный gC, в 10—20 раз имел меньшую инфекционность по сравнению с исходным.

С целью выяснения роли отдельных генов в вирулентности вируса болезни Ауески были получены мутанты с делециями 1-3 генов, кодирующих гликопротеины оболочки вириона. Делеционные мутанты по одному гену gI или gIII обладали пониженной вирулентностью для свиней и однодневных цыплят, тогда как мутанты, дефектные по двум генам, кодирующим гликопротеины gIII и gI или gIII и gp63, оказались полностью авирулентными для указанных животных. Из этого следует, что вирулентность вируса болезни Ауески является синергидной функцией отдельных экспрессируемых генов, а репродукция вируса в культуре не коррелирует с вирулентностью. Полигенный контроль вирулентности обнаружен также у вируса долины Рифт.
Аттенуация для обезьян реассортантов вирусов гриппа птиц и человека детерминирована геном нуклеопротеина.

Вакцинация сегодня является одним из методов защиты от инфекционных и вирусных заболеваний, в том числе и тех, что приводят к серьезным осложнениям. Благодаря вакцинации организм человека учится быстро отвечать, если встретится с патологией. Вакцина представляет собой иммунобиологический препарат, действие которого направлено на формирование иммунитета к заболеваниям. Она производится из ослабленных или мертвых микробов, продуктов их жизнедеятельности или из их антигенов. А что такое живая аттенуированная вакцина? Стоит разобраться в этом вопросе.

Описание проблемы

Аттенуированная вакцина – это живая вакцина, что производится на основе ослабленных микробов, которые имеют стойкую безвредность. Попадая в организм человека, микробы начинают размножаться, что приводит к вакцинальному инфекционному процессу. У многих привитых людей инфекция протекает без проявления симптомов и приводит к формированию стойкого иммунитета. В качестве примера можно привести аттенуированную вакцину против краснухи, туберкулеза, кори или полиомиелита.

Возможные осложнения

Аттенуированная вакцина – это та, что приготовлена из апатогенных возбудителей инфекции, что ослаблены и утратили свои патогенные свойства, а также способность провоцировать у человека развитие заболевания, но они могут размножаться в организме.

Инфекция, что возникает после введения такой вакцины, развивается определенный промежуток времени, но не проявляет никаких симптомов, зато она стимулирует формирование иммунитета к патогенным микробам. Таким образом, инфекция протекает в легкой форме, она активирует защитные силы организма.

Но в некоторых случаях живая аттенуированная вакцина провоцирует развитие патологии. Это обычно происходит при сниженном у человека иммунитете или при остаточной вирулентности штамма.

Сегодня в медицине применяют пять аттенуированный вакцин, это:

БЦЖ – против туберкулеза.
Оральная полиомиелитная – против полиомиелита (ОПВ).
Вакцина ротавирусная.
Против желтой лихорадки (ЖЛ).
Аттенуированная вакцина против кори.

Все они редко могут вызывать развитие побочных реакций:

БЦЖ – инфекция с летальным исходом (крайне редко) встречается у людей с иммунодефицитом, а также поражение костей, что вызывали определенные партии вакцины.
ОПВ – паралитический полиомиелит (крайне редко).
Коревая – фебрильные судороги (конвульсии) возникают крайне редко у детей до пяти лет, а также пурпурная тромбоцитопения, аллергическая реакция на компоненты вакцины, анафилаксия, что требует неотложной медицинской помощи.
Ротавирусная – данных о развитии побочных реакций нет.
ЖЛ – энцефалит, вакциноассоциированная висцеротропная патология (крайне редко) возникает обычно у людей преклонного возраста.

Безопасность

Аттенуированная вакцина – это та, что активирует все составляющие иммунной системы, что обеспечивает длительную защиту от инфекционных заболеваний. Так как она содержит живые микробы, есть определенный риск развития патологий. Конечного, риск появления способности микробов вернуться в патогенную форму и спровоцировать развитие болезни достаточно мал, но в крайне редких случаях могут появиться такие побочные явления:

ВАПП или вакциноассоциированный паралитический полиомиелит.
Полиовирус.
Местный лимфаденит, диссеминированная БЦЖ-инфекция.
Ретровирус.

Люди с ВИЧ не могут адекватно реагировать на проведение вакцинации, риск развития у них побочных реакций достаточно велик. Не рекомендуется делать вакцинацию женщинам в период вынашивания ребенка.

Аттенуированная вакцина – это та, что характеризуется высоким риском ошибок при вакцинации. Некоторые вакцины, например, представлены в форме сухого порошка. Их перед введением нужно развести специальным растворителем. В этом случае медики могут допустить ошибку, используя неправильный растворитель или медикамент. Многие вакцины нуждаются в том, чтобы медики уделяли особое внимание соблюдению холодовой цепи, для того чтобы их активность сохранилась.

Таким образом, риск развития патологий сводится к следующему:

Способность микробов возвращаться в патогенную форму.
Возможность применения время людям с ВИЧ.
Риск развития инфекций.
Процедурные ошибки.
Введение вакцины во время беременности.

Ограничения в использовании вакцины

Аттенуированная вакцина – это та, что противопоказана в таких случаях:

Период вынашивания ребенка.
Острые заболевания инфекционного и неинфекционного характера.
Обострение хронических патологий.
Иммунодефицитные состояния.
Рак крови, появление злокачественных новообразований.
Прохождение лучевой терапии.
Прием иммунодепрессантов.
Склонность к сильным аллергическим реакциям.
Развитие осложнений на предыдущую прививку.

Заключение

Борьба с инфекционными патологиями при помощи вакцинации в настоящее время остается одним из самых больших достижений человека в области медицины. Сегодня профилактика инфекционных заболеваний является мощным, безопасным и достаточно эффективным способом борьбы с инфекциями разного происхождения. В медицине используется множество вакцин, в том числе и живые, что формируют защиту против многих болезней, например, кори, полиомиелита, краснухи и т. д.

Сегодня в медицинской практике ВОЗ рекомендовано использование пяти аттенуированных вакцин. Это БЦЖ (туберкулез), ОПВ (полиомиелит), ЖЛ (желтая лихорадка), ротавирусная и против кори. При правильном проведении и соблюдении всех рекомендаций медиков риск развития побочных реакций сводится к минимуму.

Иммунный ответ

Безопасность и стабильность

Поскольку ЖАВ содержат живые организмы, есть определенная степень непредсказуемости, вызывающая беспокойство, когда речь заходит о безопасности и стабильности.

Способность аттенуированных патогенов вернуться в патогенную форму и вызвать заболевание в вакцинах или контактируемых с ними организмах, крайне редка. Крайне редко встречаются следующие серьезные побочные проявления:
- вакциноассоциированный паралитический полиомиелит (ВАПП) и
- полиовирус вакцинного происхождения, вызывающий заболевание (ПВВП) и ассоциированный с оральной полиомиелитной вакциной (ОПВ).
В своем иммунном ответе, правильно функционирующие иммунные системы уничтожают аттенуированные патогены. Лица с иммунной недостаточностью, например, ВИЧ-инфицированные пациенты, возможно, не смогут адекватно реагировать на аттенуированные антигены.
Инфекции, вызываемые устойчивыми микроорганизмами, например, при вакцинации против туберкулеза (БЦЖ), могут вызвать местный лимфаденит или диссеминированную БЦЖ-инфекцию.
Если вакцина была выращена в зараженной культуре тканей, есть возможность ее заражения другими вирусами (например, ретровирусами с коревой вакциной).
В качестве меры предосторожности, ЖАВ, обычно не вводится в период беременности. Тем не менее, реальная опасность для внутриутробного развития плода остается лишь теоретической. Так, многочисленные исследования показали, что случайная вакцинация против краснухи, имевшая место в период беременности, не вызывала повышенного риска появления врожденных пороков.
ЖАВ характеризуются повышенным потенциалом ошибок при иммунизации:
- некоторые ЖАВ поставляются в лиофилизированной форме (в форме сухого порошка). Перед введением, такие вакцины должны быть восстановлены путем разведения со специальным растворителем, что оставляет место для программных ошибок, если использован неверный растворитель или лекарственный препарат.
- многие ЖАВ требуют особого внимания к соблюдению холодовой цепи, для сохранения активности вакцины и вызывают сбой программы, если такие требования не выполняются.

Побочные реакции, ассоциированные с ЖАВ

Пять рекомендованных ВОЗ вакцин производятся, с использованием технологии ЖАВ:

Противотуберкулезная (БЦЖ),
Оральная полиомиелитная,
Коревая,
Ротавирусная,
Вакцина против желтой лихорадки.

В таблице ниже перечислены редкие, наиболее тяжелые побочные реакции, вызываемые данными вакцинами. Обратите внимание на частоту появления побочных реакций, чтобы понять, насколько низка или высока вероятность побочного проявления. Ознакомьтесь с комментариями, чтобы лучше понять дополнительную сопутствующую информацию по указанным побочным проявлениям.

Какие из нижеперечисленных утверждений верны (возможны несколько вариантов ответов)

A. Фебрильные судороги — это редкая реакция на вакцинацию против кори.

B. Вероятность появления аллергических реакций при введении второй дозы коревой вакцины ниже, по сравнению с введением первой дозы коревой вакцины.

C. К живым вакцинам относятся БЦЖ, коревая, ротавирусная, коклюшная и вакцина против желтой лихорадки.

D. Вакциноассоциированный паралитический полиомиелит вызывается вакцинами крайне редко (2-4 случая на 1 000 000 вакцинированных лиц).

Правильные ответы: A и D.

Ответ B : Появление аллергических реакций анафилаксии более вероятно после введения второй дозы коревой вакцины.

Ответ C : Коклюшная (цК) — это инактивированная вакцина. К живым вакцинам относятся:

Противотуберкулезная (БЦЖ)
Оральная полиомиелитная вакцина,
Коревая,
Ротавирусная,
Вакцина против желтой лихорадки.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к аттенуированным вирусам чумы плотоядных, и может быть использовано при изготовлении препаратов для диагностики и специфической профилактики заболевания пушных зверей и собак, вызванного вирусом чумы плотоядных. Новый штамм Virus pestis carnivorum "ВНИИВВиМ - 88 Деп" получен из вакцинного штамма ЭПМ путем адаптации и клонирования в сублинии перевиваемых клеток из почки африканской зеленой мартышки CV-1. Характеризуется высокой репродуцирующей способностью в указанной культуре клеток с проявлением специфического цитопатогенного эффекта, накоплением вирусспецифического антигена и вируса в титрах до 5625 - 31620 ТЦД 50/см 3 , безвредностью, ареактогенностью, высокой иммуногенной активностью, отсутствием контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Генетически стабилен. Неконтагиозен и нереверсибелен.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к аттенуированным вирусам чумы плотоядных, и может быть использовано в научных и производственных лабораториях и на предприятиях биологической промышленности при изготовлении препаратов для диагностики и специфической профилактики заболевания пушных зверей и собак, вызванного вирусом чумы плотоядных.

Известны вакцинные штаммы Рокборн и 668-КФ, а также модифицированные авирулентные варианты штаммов Onderstepoort, Wisconsin, Snyder Hill и других, адаптированные к выращиванию в первичных и перевиваемых культурах клеток животного и птичьего происхождения и которое используются при получении профилактических препаратов против чум плотоядных (патенты ФРГ N1138888, кл. 30h6, 1962; патент США, кл. 424-89, N2965544, 1960; N3155589, 1964; N3836626, 1974; N4351827, 1982; N5000951, 1990; авт. св. СССР, кл. C 12 N 7/08, N527072, 1977; кл. A 61 K 39/12, N1287592, 1984; патент СРР, кл. A 61 K 39/175 N82518, 1983).

Известен также широко применяемый в нашей стране при производстве моно-, би- и поливалентных культуральных вакцин для защиты пушных зверей и собак штамм ЭПМ вируса чум плотоядных (ЧП), адаптированный к выращиванию в культуре клеток эмбриона японской перепелки (патент США, кл. 435-237 N4224412, 1980; патент РФ, кл. A 61 K 39/295, N 2030917, 1995).

Штамм ЭПМ характеризуется свойствами вакцинного штамма: ареактогенен, иммуногенен, свободен от вирусов - контаминантов, патогенных для пушных зверей и собак (в том числе от вирусов лейкозносаркоматозного комплекса), обладает антигенной и инфекционной активностью (по цитопатогенному действию ЦПД в культуре клеток перепелиных эмбрионов и по бляшкам на хорионаллантоисной мембране ХАО куриных эмбрионов), неконтагиозен, стабилен при хранении. Одна прививочная доза вакцины из штамма ЭПМ содержит: для собак - от 630 до 6300 ТЦД 50, для норок, соболей и хорьков - от 120 до 1200 ТЦД 50, для лисиц и песцов - от 240 до 2400 ТЦД 50 вируса.

Основным недостатком штамма ЭПМ (прототипа) является использование при его поддержании и культивировании эмбрионов японской перепелки (ЭП), которые несвободны от посторонних микроорганизмов (агентов вирусной природы, микоплазм), что требует создания специализированных, постоянно контролируемых птицеферм со здоровым поголовьем и чрезвычайно повышает расходы на производство и контроль контаминированности перепелиного стада, яиц и биопрепаратов (Пшеничнов В. А. , Семенов Б.Ф, // Труды Перм. мед. ин-та.-1974, т. 124, с. 11-16).

Второй недостаток прототипа состоит в нестандартности применяемого клеточного субстрата, а следовательно, в вариабельности результатов научно-исследовательских и производственных работ на ЭП, что обусловлено невозможностью получить из гомогена клеток эмбриона больших партий однородных по своим характеристикам (по чувствительности затрат на контроль пригодности каждого источника ткани.

К другим недостаткам штамма ЭПМ следует отнести то, что при культивировании он дает максимальное накопление специфического антигена и биологической активности до 2000 - 20000 ТЦД 50/см 3 только на 11 - 14 сут после инокуляции в культуру клеток, что значительно удлиняет технологический процесс наработки вируссодержащего материала и изготовления биопрепаратов.

Целью изобретения является аттенуированный, безвредный и высокоиммуногенный штамм вируса ЧП для изготовления высокоактивных, стандартных и дешевых диагностических и вакцинных препаратов.

Поставленная цель достигается адаптацией штамма ЭПМ посредством серии перемежающих пассажей к сублинии перевиваемых клеток из почки африканской зеленой мартышки, полученной в ВНИИВВиМ из исходной культуры CV-1, с последующим клонированием методом предельных разведений и поддерживанием в указанной клеточной системе.

Новый аттенуированный штамм обладает следующими свойствами.

Штамм обладает морфологическими свойствами, характерными для вируса ЧП рода Morbillivirus семейства Paramyxoviridae.

Штамм размножается в перевиваемой культуре клеток сублинии CV-1 с развитием ярко выраженного ЦПД в виде симпластов и последующей деструкцией клеток. Титр вируса в указанной культуре достигает до 5625 - 31620 ТЦП 50/см 3 . Без адаптации вирус размножается в культуре клеток из тканей куриных и перепелиных эмбрионов, вызывая специфическое ЦПД и накаливаясь в титрах до 1000-10000 ТЦД 50/см 3 .

Штамм культивируют в монослое перевиваемых клеток сублинии CV-1 в стационарных и роллерных культурах. В оптимальных условиях максимум биологической активности достигается через 36 - 52 ч. В качестве питательной среды используют среду Игла-МЕМ с 4,5 - 5 об.% сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС), pH 7,2 - 7,4.

Размножается в перевиваемой культуре клеток сублинии CV-1 с проявлением специфического ЦПД.

Вызывает образование вируснейтрализующих антител.

Гемагглютинирующие свойства. Не обладает.

Бляшкообразующая способность. Не регулярно образует бляшки на ХАО куриных эмбрионов.

Патогенность для человека. Непатогенен.

Вирулентность для восприимчивых животных. Невирулентен.

Безвредность для лабораторных животных. Безвреден.

Реверсия в вирулентное состояние. Нереверсибелен.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Неконтаминирован.

Индуцирует формирование иммунитета против ЧП у пушных зверей (норок, тхорзофреток, песцов, лис, енотов) и собак. У вакцинированных животных выявляются вируснейтрализующие антитела к вирусу ЧП в титрах 1:8-1:32 и выше.

Стабильность генетических и иммунобиологических признаков.

В течение 10 последовательных пассажей в культуре клеток сублинии CV-1.

Способ и срок хранения, периодичность пассажей.

Штамм хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 40 o C и "освежают" пассированием в культуре клеток сублинии CV-1 один раз в 5 лет.

Предлагаемый штамм отличается от известного штамма ЭПМ тем, что выращивается в перевиваемой линии клеток и обладает в ней высокой репродуцирующей способностью. Небольшой период культивирования (до 2 сут), достаточно высокая биологическая активность (до 31620 ТЦД 50/см 3 ), безвредность, антигенная и иммуногенная активность нового штамма гарантируются условиями адаптации и клонирования, при которых достигается стабильность его аттенуированных свойств, генетических и иммунобиологических признаков. Предлагаемый штамм легко культивируется на недефицитной питательной среде Игла-МЕМ с использованием сыворотки крови КРС, не теряет своих полезных свойств после низкотемпературного хранения и "освежения".

Новый штамм адаптирован к выращиванию в неонкогенной, стабильной, с высокой пролиферативной активностью перевиваемой культуре клеток сублинии CV-1, что исключает необходимость использования дорогостоящей, нестандартной и небезопасной первичной культуры ЭП и приводит к уменьшению экономических затрат на получение вируссодержащего культурального материала, а следовательно, культуральной вирусвакцины и диагностических препаратов. Высокая стандартность вируссодержащего материала обусловлена способом поддерживания нового штамма, основанном на системе посевных серий вируса и клеток, а также на криобанке рабочих клеток, охарактеризованных по стабильности морфологических, ростовых и кариологических показателей, на отсутствие туморогенности, контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами (Каталог клеточной коллекции ВНИИВВиМ, номер 43.2).

Предлагаемый аттенурованный штамм вируса ЧП был обозначен как штамм "ВНИИВВиМ-88" и депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным номером "ВНИИВВиМ-88 Деп" (справка о депонировании прилагается).

Для иллюстрации преимуществ настоящего изобретения ниже приведены примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Получение посевного вируса.

Для этой цели используют штамм "ВНИИВВиМ-88" 4-го пассажа с титром 10000 ТЦД 50/см 3 , хранившийся в лиофилизированном состоянии в ампулах по 1 см 3 при минус 70 o C, и монослойную культуру клеток сублинии CV-1 в матрасах, поддерживаемую серийным пассированием общеизвестным безциентрифужным способом с коэффициентом пересева 1: 3. В качестве ростовой среды применяют среду Игла-МЕМ с 9-10 об.% сыворотки крови КРС.

Двухсуточный монослой клеток, выращенный в матрасах емкостью 1,5 дм 3 , инфицируют штаммом "ВНИИВВиМ-88" из расчета 0,0005 - 0,001 ТЦП 50/клетку, предварительно слив из них ростовую среду. Контакт вируса с клетками проводят в течение 30 - 40 мин при 36,5-37,5 o C, затем в каждый матрас вносят по 150 см 3 поддерживающей среды Игла-МЕМ с 4,5-5 об.% сыворотки крови КРС.

Культивирование вируса проводят при 36,5-37,5 o C в течение 36-52 ч. При проявлении специфического ЦПД у 50% клеток вирус сливают из матрасов, предварительно отобрав из них пробы для контроля на контаминацию бактериями, грибами, микоплазмами и титрования по ЦПД в культуре сублинии CV-1.

Стерильный вирус фасуют во флаконы и хранят до использования при температуре от минус 70 до минус 50 o C. Посевной вирус используют для получения вирусного сырья при производстве культуральной вирусвакцины и вирусспецифического антигена (пример 2). Всего в нашем опыте с 4-х матрасов получено 600 см 3 посевного вируса 5-го пассажа с титром 31620 ТЦД 50/см 3 .

Чтобы получить достаточное количество стандартного и дешевого вирусного сырья, проводят до 10-ти последовательных серийных пассажей вируса, как описано выше. Репродукция вируса при пассировании сопровождается развитием ЦПД и высоким уровнем накопления (до 31620 ТЦД 50/см 3 ) в те же сроки. В примерах 3 - 7 штамм "ВНИИВВиМ-88" различных пассажей охарактеризован по таким основным показателям, как безвредность для лабораторных животных и пушных зверей, ареактогенность, антигенная и иммунногенная активность.

Пример 2. Получение вирусспецифического антигена.

Культивирование вируса проводят в монослойной культуре клеток сублинии CV-1 в роллерных сосудах или матрасах соответственно емкостью 3 или 1,5 дм 3 при условиях, указанных в примере 1.

При проявлении ЦПД в виде симпластов в 50-70% монослоя клетки отделяют от стекла в культуральную жидкость при помощи кисточки или встряхиванием сосудов. Клетки осаждают центрифугированием при 2000-2500 g в течение 15-20 мин и ресуспендируют и физиологическом растворе из расчета 1-2 см 3 на 100 см 3 исходной культуральной жидкости.

Суспензию клеток однократно замораживают и оттаивают, вновь центрифугируют и надосадок используют в реакции диффузной преципитации в разведениях от 1:8 до 1:16, в ИФА - от 1:625 до 1:3125.

Пример 3. Безвредность штамма для лабораторных животных.

Испытания штамма на уровне 5, 7, 10 и 15 пассажей проводили на взрослых белых мышах и морских свинках. На каждый опыт брали по 5 животных. Неразведенный вирус вводили подкожно по 0,5 см 3 мышам и внутрибрюшинно по 1 см 3 морским свинкам. В течение 10 сут наблюдения признаков заболевания и гибели животных не отмечали.

Пример 4. Безвредность штамма для пушных зверей.

Безвредность штамма 5, 10 и 15 пассажей проверяли на тхорзофретках, которые являются высокочувствительной к ЧП моделью. Испытывали вирус в дозе по 3000-3500 ТЦД 50. На каждый опыт брали по 4 тхорзофретки, которым вводили по 1 см 3 вируса внутримышечно.

В период наблюдения (21 сут) все привитые звери остались клинически здоровыми. Каких-либо отклонений от физиологической нормы в поведении и приеме пищи, признаков заболевания и случаев гибели среди зверей не отмечали.

Пример 5. Реактогенность штамма.

Реактогенность штамма 5, 10 и 15 пассажей оценивали в опытах на тхорзофретках, которым вводили внутримышечно по 1 см 3 вируса в дозе по 600-700 ТЦД 50. На каждый опыт брали по 4 тхорзофретки и 4 зверя оставили невакцинированными для контроля.

За период наблюдения (21 сут) все привитые звери остались клинически здоровыми, без общей температурной и местной воспалительной реакции на месте введения вируса, без каких-либо отклонений их физиологического состояния от нормы. Контрольные животные также не заболели.

Пример 6. Антигенная активность штамма.

У тхорзофреток, вакцинированных штаммов "ВНИИВВиМ-88" различных пассажей (пример 5), на 20-21 сут после вакцинации отбирали кровь и определяли в пробах сывороток вируснейтрализующие ВН-антитела по реакции нейтрализации в культуре сублинии CV-1. В качестве антигена использовали вирус 4-го пассажа в дозе 1000 ТЦД 50.

У всех вакцинированных тхорзофреток выявили ВН-антитела к вирусу ЧП в титрах 1:32 - 1:64 (и выше) в то время, как титр ВН-антител в пробах нормальной сыворотки составил менее 1:2.

Пример 7. Иммуногенная активность штамма.

Иммуногенную активность штамма различных пассажей оценивали по устойчивости вакцинионированных тхорзофреток к контрольному заражению вирулентным вирусом ЧП.

Через 21 сут после вакцинации (пример 5) иммунизированных и контрольных зверей заражали вирулентные штаммом "Snyder Hill" в дозе 100 ЛД 50 внутримышечно.

Все иммунизированные тхорзофретки оказались устойчивыми к заражению вирулентным вирусом при полной гибели зверей в контроле. В течение 25 сут наблюдения после контрольного заражения у вакцинированных тхорзофреток не наблюдали симптомов заболевания чумой.

Таким образом, новый аттенуированный штамм вируса чумы плотоядных, адаптированный и выращенный в перевиваемой культуре клеток сублинии CV-1, отвечает всем требованиям, предъявленным к вакцинным штаммам, и может рекомендоваться в качестве производственного при изготовлении высокоактивных, стандартных и дешевых культуральных биопрепаратов, в частности, живой вакцины и специфического антигена.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аттенуированный штамм вируса чумы плотоядных Virus pestis carnivorum, депонированный в коллекции штаммов микроорганизмов ВГНКИ под номером "ВНИИВВиМ-88 Деп", пригодный для изготовления вакцинных и диагностических препаратовь

Читайте также:

Классы МПК:	C12N7/00 Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их A61K39/175 вирус собачьей чумы
Автор(ы):	Карпов Г.М. , Вишняков И.Ф. , Куриннов В.В. , Юрков С.Г. , Витина С.А. , Хрипунов Е.М. , Савукова В.Я. , Балышев В.М.
Патентообладатель(и):	Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии
Приоритеты: