Аттенуированный штамм против бешенства

Изобретение предназначено для получения средства специфической профилактики против бешенства. Вакцина против бешенства содержит авирулентный мутант штамма SAD Berne вируса бешенства. Штамм характеризуется тем, что содержит в положении 333 природную глутаминовую кислоту, кодон которой отличается от кодонов аргинина по крайней мере двумя нуклеотидами. Штамм депонирован в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов и имеет регистрационный номер C. N.С.М. 1-1238. Штамм получен путем отбора с использованием моноклональных антител, нейтрализующих штамм SAD и нейтрализующих штамм ТAG 1. Штамм и вакцина на его основе характеризуются повышенной безопасностью и эффективностью. 3 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.

Рисунки к патенту РФ 2128519

Изобретение относится к новой вакцине против бешенства.

Вирус бешенства является рабдовирусом, содержащим пять протеинов, в котором один внешний протеин, гликопротеин, инициирует синтез нейтрализующих антител у привитых животных. Введение очищенного гликопротеина защищает животное от внешней инфекции. Наиболее используемые штаммы вируса бешенства, а именно штаммы CVS и SAD, которые происходят от штаммов SAD, таких как SAD Berne и SAD B19, описаны в "Rabies Viruses", H.F. Clark и T.I. Wictor-Strains of Human Viruses, изд. Majer and Plotkin Karger, Bale, 1972, стр. 177 - 182. Последовательность аминокислот гликопротеина штамма CVS описана Yelverton и др. в "Rabies virus glucoprotein analogs: biosynthesis in Escherichia coli" Science 219, 614 - 620.

Этот гликопротеин содержит два основных антигенных различных сайта, связанных с нейтрализацией вируса /сайты II и III/. Сайт III в положении 330 - 340 содержит аргинин 333, который определяет вирулентность этого штамма.

Последовательность аминокислот гликопротеина штамма SAD Berne не установлена полностью. Однако можно определить, что антигенный сайт III гликопротеина штамма SAD Berne идентичен этому же сайту гликопротеина штамма CVS.

Используемые в настоящее время вакцины против бешенства являются либо вакцинами, полученными из инактивированного вируса, либо вакцинами, состоящими из вирусных штаммов, вирулентность которых уменьшена, либо рекомбинантными вирусами /например, вакцина/.

Главным недостатком способа получения вакцины является работа с вирулентными штаммами, что требует точного соблюдения условий работы, и создает риск отравления для работающего персонала.

С другой стороны, инактивированные вакцины, вводимые оральным путем, не обладают защитными свойствами.

Снижение вирулентности вирусных штаммов основано на хорошо известной методике; оно может быть осуществлено, например, последовательным пропусканием вирусных штаммов через хозяина другого вида штамма /кролика или мыши, например/ или через клеточную культуру. Получают таким образом штаммы, несвойственные первоначальному хозяину, и, следовательно, менее патогенные при сохранении их вакцинирующей способности.

Штаммы SAD, такие как SADB19 и SAD Berne, являющиеся доступными, являются ослабленными штаммами и были испытаны в Европе для вакцинации лисиц. Они могут быть смешаны с приманкой для орального введения. Однако эти штаммы проявляют патогенность на других видах животных и на человеке. Следовательно, они создают потенциальный риск отравления, что значительно уменьшает интерес к этим штаммам для оральной вакцинации.

Действительно, например, оральное введение штамма SAD Berne группе из 23 диких грызунов, выбранных среди Apodemus flavicolus et sylvaticus, Arvicola terrestris, Clethrionomys clareolus, Minotus agresti, вызывает смерть от бешенства двух животных.

Испытания на мышах также показывают, что штамм SAD Berne является патогенным для этого типа животных, как при внутричерепном, так и при внутримышечном введении, как это показывают кривые на фиг. 1a и 1b, на которых соответственно показано:
фиг. 1a - кривая смертности взрослых мышей в зависимости от доз, вводимых интрацеребральным путем (в единицах образующих пятна, ЕОП);
фиг. 1b - кривая смертности взрослых мышей в зависимости от доз, введенных внутримышечным путем (в единицах, образующих пятна).

При оральном пути введения у мышей отмечается 10%-ная смертность при дозе 10 5,5 ЕОП.

Штамм SAD Berne, применяемый как таковой в вакцинационной кампании на лисицах, представляет опасность для дикой фауны и человека. Это же относится и к штамму SAD B19.

Для устранения этого недостатка уже предлагалась авирулентная вакцина против бешенства. Эта вакцина, описанная в заявке на патент EP 350398, содержит авирулентный мутант штамма SAD вируса бешенства, который характеризуется тем, что вместо аргинина 333 гликопротеина он имеет аминокислоту, отличающуюся от лизина, например глицин, изолейцин или серин.

Этот мутант получают заменой одного нуклеотида в кодоне аргинина 333.

К сожалению, этот мутант может при простой обратной мутации вновь дать родительский штамм.

Следовательно, эта вакцина, используемая оральным путем, не всегда безопасна для животных других видов.

Настоящее изобретение относится к эффективной вакцине, которая позволяет устранить указанные недостатки.

Вакцина по изобретению включает авирулентный мутант штамма SAD вируса бешенства, который характеризуется тем, что вместо аргинина 333 гликопротеина он содержит природную аминокислоту, кодон которой отличается от кодонов, кодирующих аргинин двумя нуклеотидами.

Изобретение относится также и к способу получения авирулентного мутанта, указанного выше. Этот способ включает:
1) отбор, исходя из штамма SAD вируса бешенства, мутантов, которые не нейтрализованы моноклональными антителами, нейтрализующими вышеупомянутый штамм SAD, но не нейтрализующими штамм TAG1, описанный ниже;
2) отделение путем секвенирования области 333 гликопротеина мутантов, отобранных на стадии 1) от мутанта, содержащего в положении 333 лизин;
3) получение моноклонального антитела, которое одновременно нейтрализует вышеупомянутый штамм SAD и мутант, полученный на стадии 2), но не нейтрализует штамм TAG1;
4) проведение повторного отбора из мутантов, полученных на стадии 1) с помощью моноклонального антитела, полученного на стадии 3).

Моноклональные антитела, используемые при отборе мутантов по изобретению, получают слиянием клеток миеломы и клеток, производящих антивирусные антитела по методике гибридизации, описанной KOHLER et MILSTEIN, в журнале NATURE, 256, 495 - 497 /1975/, эта методика широко известна в настоящее время специалистам.

Согласно этой методике можно подвергать слиянию клетки, происходящие от различных видов, однако предпочтительными являются клетки животного одного и того же вида. Например, используют преимущественно, с одной стороны, клетки миеломы мыши и, с другой стороны, клетки селезенки мыши, предварительно иммунизированные штаммом вируса бешенства согласно протоколу, приведенному ниже.

Спленоциты иммунизированных мышей собирают после извлечения селезенки классическим способом.

Клетки миеломы мышей, используемые для получения нейтрализующих моноклональных антител, являются клетками миеломы мышей Balb-C, происходящих из колонии SP 2 O. Эти клетки миеломы были отобраны с точки зрения их чувствительности к аминоптерину и культивированы в соответствующей среде, такой как основная среда Игла, модифицированная DULBECCO (Dulbecco Modified Eagle medium), называемая далее среда DMEM, к которой добавлено 15% сыворотки жеребенка.

После инкубации при 37 o C клетки промыват в среде DMEM и вновь суспензируют, затем культивируют в избирательной среде, предназначенной исключительно для роста гибридных клеток. Эта среда содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин.

Отбирают затем супернатанты культур, спустя 7 - 20 дней после слияния клеток, приводя во взаимодействие супернатанты с суспензией вируса CVS и удерживая антитела, которые нейтрализуют вышеупомянутую суспензию.

Термин "антитело, нейтрализующее вирус" обозначает такие антитела, которые при помещении их в суспензию данного вируса ингибируют его вирулентность.

Нейтрализующая способность моноклональных антител, полученных выше, определяется классическим способом, хорошо известным специалисту. Этот способ состоит в смешивании 100 мкл суспензии вируса с содержанием вируса 1000 ЕОП и 100 мкл супернатанта культуры гибридомы, в инфицировании культуры клеток этой смесью и, после 4 дней инкубирования, в подсчете лизированных пятен на агаре по методу, описанному BUSSEREAU et al., 1982, J. Virol. Meth. Vol. 4, стр. 277 - 282. Антитела являются нейтрализаторами, если они ингибируют образование пятен на агаре в вышеупомянутых условиях.

Среди этих антител отбирают затем антитела, которые не нейтрализуют авирулентный мутант TAG1, производный штамма CVS, представленный в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов (C.N.C.M. - Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes) Института Пастера - Франция 12 апреля 1985 под N 1-433. Полученные моноклональные антитела, которые нейтрализуют штамм CVS, но не нейтрализуют авирулентный мутант TAG1, позволяют селекционировать авирулентные мутанты исходя из любого штамма вируса бешенства, который нейтрализуется этими моноклональными антителами.

Моноклональные антитела, полученные таким образом, являются антителами, нейтрализующими также штаммы SAD вируса бешенства. Они подходят также для осуществления первичного отбора по способу изобретения.

Секвенирование области 333 гликопротеина мутантов, отобранных на стадии 1) осуществляют по классической методике, хорошо известной специалисту [SANGER et al., 1977, Proc. Nat. Acad.Sci. USA, vol. 74, p. 5463 - 5467].

Это секвенирование позволяет изолировать мутант, который имеет в положении 333 гликопротеина лизин; этот мутант именуется далее "мутант SK".

Кодон /AAA/ этой аминокислоты /лизина/ отличается от кодона аргинина в положении 333 штамма SAD единственным нуклеотидом, причем кодон аргинина в положении 333 имеет строение AGA.

Далее переходят к получению моноклонального антитела, нейтрализующего одновременно штамм SAD и мутант, полученный выше.

Это моноклональное антитело получают удерживанием среди моноклональных антител, нейтрализующих SAD и не нейтрализующих TAG1, такого, который нейтрализует равным образом лизиновый мутант или мутант SK, полученные выше.

Это моноклональное антитело позволяет осуществить второй отбор /стадию 4/ способа по изобретению.

Патогенная возможность мутантов, полученных после второй селекции, определяется путем интрацеребральной инъекции 10 5 ЕОП взрослым мышам. Мутанты, которые не убивают при этой дозе и при этом методе введения, рассматриваются как авирулентные.

Мутанты по изобретению являются двойными авирулентными мутантами штамма SAD, в частности штамма SAD Berne, получаемыми двумя последовательными селекциями с помощью моноклональных антител, определенных выше.

Мутанты по изобретению могут, кроме того, заключать в себе другие мутации, как например мутацию, придающую устойчивость к моноклональным специфичным антителам антигенного сайта II, что позволяет распознать возможный ревертант вирулентности штаммов SAD, используемых для оральной вакцинации лис.

Мутанты по изобретению могут быть размножены на клетках почки новорожденного хомяка BHK 21, в присутствии среды GEM (основная среда минимум-модификации Глазгоу, выпускаемая фирмой FLOW) и 2%-ной сыворотки теленка при 33 o C во влажной атмосфере с 5%-ным содержанием CO 2 .

Их охарактеризовывают обычными методами, например, определяя летальную дозу 50 /ЛД 50 / на мышах, иммунофлуоресценцией или обсчитывая лизированные пятна на агаре. Они могут храниться при -70 o C.

Анализ последовательности нуклеотидов гликопротеина этих мутантов показывает, что кодон аминокислоты в положении 333 отличается по крайней мере двумя нуклеотидами от всех кодонов, возможных для аргинина. Среди мутантов, которые отвечают этим условиям, предпочтительным особенно является мутант, имеющий в 333 глутаминовую кислоту, так как он хорошо размножается на клеточной культуре, менее патогенен для новорожденных мышей, и он обладает высокой защитной способностью.

Двойной мутант, несущий глутаминовую кислоту, кодон которой: GAA на месте аргинина в положении 333, полученный по вышеприведенному способу; исходя из штамма SAD Berne, называемый далее SAG2, представлен в Национальную Коллекцию Культур Микроорганизмов /C.N.C.M. - Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes/ Института Пастера - Франция 9 июля 1992 под N 1-1238. Этот мутант содержит другую мутацию, а именно устойчивость к моноклональному специфическому антителу антигенного сайта II, что является дополнительным маркером штамма.

Далее представлено детальное описание изобретения, на примере мутанта SAG2, что однако не ограничивает изобретение только этим мутантом.

A - Исследование генетической стабильности штамма при проведении пассажей на мозге мышат.

10 3 ЕОП SAG2 вводят 6 мышатам в возрасте 4 дней. Когда животные заболевают /6/, их умерщвляют. Готовят 6 отдельных измельченных образцов; каждый образец оттитровывают и 30 мкл разбавленного 1/10 образца вводят 3 взрослым мышам /патогенный контроль/ и мышонку /следующий пассаж/, 6 мышат позволяют сделать 6 независимых серий из 3 пассажей.

Титры мозговых веществ в ЕОП /мл даны в таблице.

Все инъектированные взрослые особи /54 мыши/ после 1-го, 2-го и 3-го пассажей остались живы и показали отсутствие реверсии.

B - Защитная способность SAG2.

Мутант SAD2 вводят интрацеребральным путем мышам и определяют защитную способность мутанта в опыте внутримышечного введения 100 ЛД 50 штамма CVS.

Полученные результаты представлены на фиг. 2, где графически показана защитная способность /%/ как функция количества введенного мутанта, выраженного в (ЕОП) UFP/мышь (log). Повторяют то же исследование с мутантом SK, имеющим в положении 333 лизин.

C - Патогенность SAG2 при интрацеребральном введении.

Вводят мутант SAG2 мышам в дозах от 10 -0,5 до 10 6 ЕОП/мышь и не отмечают смертности в течение периода времени 28 дней.

Параллельно, осуществляют тот же опыт с вирусом SAD Berne или мутантом SK.

Результаты представлены на фиг. 3, где дан график зависимости % смертности /ось ординат/ от количества введенного мутанта мышам /ось абсцисс/.

Установлено, что мутант SAG2 не вызывает никакой смертности, тогда как мутант SK имеет слабую остаточную патогенность.

D - Патогенность SAG2 при внутримышечном введении.

Повторяют испытание, приведенное выше, но при внутримышечном введении. Полученные результаты представлены на фиг. 4, где приведен % смертности /ось ординат/ в зависимости от введенной дозы в ЕОП/мышь /ось абсцисс/.

Видно, что SAG2 и мутант SK не вызывают никакой смертности.

Мутанты по изобретению могут применяться в виде живой вакцины при всех обычно используемых способах введения при вакцинации и особенно при внутримышечном или оральном способе введения. Мутанты предварительно разбавляют в инертном фармацевтически пригодном растворителе, таком как физиологическая сыворотка.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Авирулентная вакцина против бешенства, отличающаяся тем, что содержит авирулентный мутант штамма SAD вируса бешенства, в котором гликопротеин содержит в положении 333 природную глутаминовую кислоту, кодон который отличается от кодонов аргинина, по крайней мере двумя нуклеотидами.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что мутантом является мутант штамма SAD Berene.

Описание патента на изобретение RU2080125C1

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к способам получения вакцин для иммунизации собак.

В настоящее время существует ряд инактивированных вакцин против бешенства собак, выпускаемых в разных странах. Наиболее иммуногенными являются культуральные вакцины фирмы "Мерье" (Франция) [1] и культуральная вакцина из штамма "Внуково-32" (ИПВЭ РАМН) [2]
Известны также высококачественные культуральные живые аттенуированные вакцины против чумы плотоядных. Одной из лучших считается вакцина "Вакчум", разработанная в ИПВЭ РАМН [3]
В настоящее время наблюдается тенденция перехода от одновалентных вакцин к поливалентным, так как при этом меньше травмируется животное и обеспечивается лучшая возможность соблюдать правила антисептики. Ассоциированной вакцины против бешенства и чумы плотоядных в литературе не описано.

В основу изобретения положена задача создания вакцины, вырабатывающей иммунитет у собак как к вирусу бешенства, так и к вирусу чумки (чумы плотоядных).

Задача решена предлагаемой вакциной "Дивак", представляющей собой смесь двух вакцин на стадии жидкого полуфабриката: против чумы плотоядных - 1 o C1,1 часть, против бешенства 1,9 o C2 части. Антирабическая вакцина представляет собой вакционный вирус бешенства, штамм "Внуково-32", выращенный в первичной клеточной культуре клеток сирийского хомяка или в клетках перевиваемой линии 4647 и инактивированный ультрафиолетовыми лучами (УФ-лучами). Вакцина против чумы плотоядных "Вакчум" это живой аттенуированный вирус штамм "Рокборн", аттенуированный в культуре первичных клеток почечной ткани зеленых мартышек или в клетках 4647.

Авторам удалось, впервые в вирусологической практике, ассоциировать живую и убитую вакцины. Это стало возможным благодаря тому, что инактивация антирабической вакцины осуществляется УФ-лучами и вакцина не содержит формалина или других инактиваторов, убивающих вирус второго компонента.

Предлагаемая вакцина находит широкое применение в связи с большим количеством служебных и домашних собак ценных пород. Она разрешена к применению Главветупром Министерства сельского хозяйства.

Утверждены также Технические условия ТУ-08064-19-22-95 и инструкции по изготовлению и контролю.

Способ осуществляют следующим образом.

Получение антирабической вакцины.

Адаптацию аттенуированного штамма "Внуково-32" проводят в культуре первичных клеток почки сирийского хомяка. Монослой клеток почки сирийского хомяка, выращенный при температуре 37±1 o C, отмывают два раза рабочим раствором Эрла и инфицируют вируссодержащей культуральной жидкостью (штамм "Внуково-32") в дозе 0,001 LD₅₀ на одну клетку. Аналогично поступают в случае с клетками 4647. Сорбция вируса проходит при 37 o ±1 o C в течение 1 ч. В качестве поддерживающей среды используют среду Игла, содержащую 0,2 o C0,22% ростовых протеинов. Зараженные клетки инкубируют при 32 o ±1 o C, через 3 сут проводят смену поддерживающей среды и еще через 3 сут собирают урожай вируса. Вируссодержащий материал сохраняют при -20±1 o C и после соответствующих контрольных исследований на бактериальную и микологическую стерильность производят фильтрацию вируса, затем инактивацию его ультрафиолетовыми лучами, на аппарате иррадиаторе ультрафиолетовых лучей со скоростью 20 21 об/мин, на расстоянии 18 20 см, в слое 1 1,1 мм.

Получение вакцины против чумы плотоядных "Вакчум".

Адаптацию аттенуированного штамма "Рокборн" вируса чумы плотоядных к культуре почечной ткани зеленых мартышек проводят в течение 8 10 пассажей при температуре 34 ± 0,2 o C, доводя инкубационный период развития вируса до 4 5 дн. На основе адаптированного вируса готовят посевной вирус.

Система посевного вируса предусматривает приготовление в большом объеме вакционного вируса, отвечающего всем требованиям аттенуированного штамма, сохранение его в жидком азоте и использование по мере необходимости для изготовления вакцины.

Для производства вакцины используют культуру клеток почечной ткани зеленых мартышек или перевиваемой линии 4647.

Выращивание вакционного вируса в указанных культурах ведут при температуре 34 ± 0,2 o C на средах с добавлением 5±0,2% сыворотки крупного рогатого скота. Вируссодержащую жидкость удаляют 3 5 раз, заменяя ее свежей питательной средой, причем первое удаление производят после появления цитопатологических изменений в 30 40% клеток, и повторяют эту операцию до полной дегенерации клеток. Сборы вируссодержащей жидкости объединяют и освобождают от детрита.

Получение ассоциированной вакцины против бешенства и чумы плотоядных.

Полуфабрикаты вакцины против чумы плотоядных и антирабической вакцины смешивают в соотношении 1 o C 1,1 часть вакцины против чумы плотоядных + 1,9 o C 2 части антирабической вакцины, добавляют 10%-ный раствор желатозы до конечной концентрации 1 ± 0,1% и 40%-ный раствор сорбита до конечной концентрации 5±0,1% Затем разливают вакцину по (3,0±0,1) мл и лиофилизируют. Все этапы процесса изготовления вакцины (Дивак) проводят в стерильных условиях.

Препарат, полученный после лиофилизации, подвергают биологическим испытаниям, и при получении благоприятных результатов препарат считают вакциной, готовой к использованию.

Высокая иммуногенность и низкая реактогенность обоих компонентов вакцины, выращенных в культуре клеток, а также применяемый способ инактивации вируса бешенства ультрафиолетом, дающий возможность соединения его с живым вирусом чумы плотоядных, позволяют впервые в мире создать высокоэффективную ассоциированную вакцину этих двух вирусов вакцину нового поколения.

Эта вакцина уже сейчас применяется в ветеринарной практике (в 1992 94 гг использовано 25 000 доз вакцины) и найдет широкое применение в дальнейшем, как в России, так и в странах СНГ и дальнем зарубежье.

Вся технологическая документация и инструкция по применению утверждены соответствующими инстанциями. Серийное производство вакцины осуществляется на экспериментально-производственном предприятии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН.

Похожие патенты RU2080125C1

Классы МПК:	A61K39/205 Rhabdoviridae, например вирус бешенства C12N7/00 Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их
Автор(ы):	Жаклин Бенжан (FR) , Анн Фламан (FR) , Мари-Кристин Тюфферо (FR) , Патрис Кулон (FR) , Флоранс Лафэй (FR)
Патентообладатель(и):	Вирбак (FR)
Приоритеты:

название	год	авторы	номер документа
Способ получения вакцины против чумы плотоядных "вакчум"	1974	Чумаков М.П. Прохорова И.А. Грачев В.П. Петухова В.В. Свежинина Ю.А. Миронова Л.Л. Ральф Н.М.	SU527072A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ	1996	Вишняков И.Ф. Карпов Г.М. Куриннов В.В. Хрипунов Е.М. Савукова В.Я. Юрков С.Г. Витина С.А. Шевченко А.А. Малоголовкина Н.В. Сазонкин В.Н.	RU2129442C1
ВАКЦИНА ПРОТИВ ЧУМЫ, АДЕНОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ПАРВОВИРУСНОГО И КОРОНАВИРУСНОГО ЭНТЕРИТОВ, ЛЕПТОСПИРОЗА И БЕШЕНСТВА СОБАК	2013	Непоклонов Евгений Анатольевич Алипер Тарас Иванович Мусиенко Мария Ивановна Соболева Галина Леонидовна Мухин Алексей Николаевич	RU2546247C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ	1991	Крутилина Д.В. Маннанов Р.А.	RU2032738C1
ЖИВАЯ КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ВАКЦИНА ЭПМ ПРОТИВ ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ	1994	Дорофеев В.М. Колышкин В.М. Уласов В.И.	RU2067002C1
ШТАММ № R-72 ВНИИЗЖ ПАРВОВИРУСА СОБАК ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ	2003	Старов С.К. Герасимова Н.И. Фомина Т.А. Захаров В.М. Хлыбова Т.В. Евсеев А.М. Фоменко В.Ю. Глобенко Л.А. Ковалишина Н.И. Мороз Н.В.	RU2242994C1
ВАКЦИНА ПРОТИВ ЧУМЫ, ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА И ПАРВОВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА ПЛОТОЯДНЫХ	1997	Балышев В.М. Вишняков И.Ф. Федорищев И.В. Карпов Г.М. Щетникова Л.А. Хрипунов Е.М. Савукова В.Я. Шевченко А.А. Юрков С.Г. Зуев В.В.	RU2154496C2
АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ VIRUS PESTIS CARNIVORUM	1996	Карпов Г.М. Вишняков И.Ф. Куриннов В.В. Юрков С.Г. Витина С.А. Хрипунов Е.М. Савукова В.Я. Балышев В.М.	RU2108385C1
ШТАММ ВИРУСА VIRUS DISTEMPER CANIS "ВЛАДИМИР" ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ И ВАКЦИНЫ "ВЛАДИВАК" ПРОТИВ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПЛОТОЯДНЫХ НА ЕГО ОСНОВЕ	1998	Элизбарашвили Э.И. Уласов В.И. Рахманина М.М. Сазонкин В.Н.	RU2147441C1
СПОСОБ СТЕРИЛИЗУЮЩЕЙ ФИЛЬТРАЦИИ ВИРУССОДЕРЖАЩЕГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ	1989	Дулина А.В. Крутилина Д.В. Шафеева Р.С.	RU1755580C

Реферат патента 1997 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БЕШЕНСТВА И ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ

Изобретение относится к ветеринарии, а именно профилактической иммунизации собак против бешенства и чумы плотоядных. Вакцина приготовлена из авирулентного штамма Рокборн вируса чумки и авирулентного штамма Внуково-32 вируса бешенства. Вакцину выпускают в заполненных инертным газом герметически закрытых флаконах (ампулах). В отличие от всех существующих, указанная вакцина - это смесь двух культуральных вакцин: живой аттенуированной вакцины против чумы плотоядных, выращенной в первичных клетках почечной ткани зеленых мартышек или клетках перевиваемой линии почек обезьян (4647) и инактивированной антирабической вакцины, выращенной в первичной клеточной культуре клеток сирийского хомяка или в клетках 4647. Вакцина выпускается в удобной для применения форме.

Формула изобретения RU 2 080 125 C1

Способ получения вакцины против бешенства и чумы плотоядных, отличающийся тем, что антирабическую вакцину "Внуково 91", инактивированную УФ-лучами, и вакцину против чумы плотоядных "Вакчум" смешивают в соотношении 1:1,9 - 1,1: 2,0, после чего добавляют раствор желатозы до конечной концентрации 10±0,1% и 40%-ный раствор сорбита до конечной концентрации 5±0,1% и лиофилизируют.

Ученые атакуют пока неизлечимую вирусную инфекцию бешенства с двух сторон. Молекулярные биологии создают ДНК-вакцину против вируса бешенства. Зоологи массово вакцинируют диких животных — природных носителей вируса путем массового разбрасывания приманки с вакциной в местах их обитания.

Летальность при заражении вирусом бешенства у человека — 100%. Единственный способ спасения — своевременная вакцинация. Сейчас ведутся работы по созданию ДНК-вакцин от бешенства как для человека, так и для животных. Животных тоже надо лечить, потому что человек всего лишь промежуточный и случайный хозяин вируса при его циркуляции в природе, а без ликвидации природных очагов вируса борьба с бешенством будет бесконечной.

134 года назад впервые пациенту, укушенному бешеной собакой, была введена вакцина на основе препарата мозга зараженного кролика. Это был большой риск для уже знаменитого ученого Луи Пастера, опыты на животных были в самом разгаре, и гарантировать исход вакцинации человека не мог никто. Ясно было только одно — без лечения укушенный ребенок умрет. Вакцина сработала, это стало выдающимся событием в медицинской науке. Пастер был удостоен беспрецедентных почестей, стал членом академий, кавалером более 200 орденов разных стран мира, в его институте проходили вакцинацию тысячи пациентов ежегодно.

Сложно поверить, но и спустя столько лет человечество все еще находится под угрозой страшного заболевания. Несмотря на ежегодную вакцинацию более 15 миллионов человек, потенциальную угрозу этот вирус несет для 3,3 млрд человек в 100 странах мира. 99% случаев заболевания связаны с укусами больных собак, но источником заражения могут быть и другие плотоядные (кошки, ежи и др.), в некоторых регионах мира переносчиком заболевания могут стать летучие мыши.

Для человека нет спасения, если уже появились симптомы заболевания. По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), из-за отсутствия лечения ежегодно от бешенства погибает до 60 тыс. человек, 40% из них — дети в возрасте от 5 до 15 лет.

Вирус бешенства относится к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. Помимо вируса бешенства другие 11 представителей этого рода тоже вызывают прогрессирующий энцефалит. Можно считать бешенство энцефалитом, вызываемым лиссавирусами, а вирус бешенства — основным вирусным видом этого рода.

Заражение обычно происходит через повреждение кожи после царапины или укуса зараженным животным. Вирус содержится в его слюне. В зависимости от удаленности места укуса от основных нервных окончаний, от количества попавшего в рану вируса период скрытого развития заболевания занимает от недели до года, в среднем три месяца, особенно опасны укусы в область головы и шеи.

Вирус распространяется по нервной системе, организм не вырабатывает к нему антитела, и заражение невозможно диагностировать на ранней стадии. Разработаны эффективные способы определения вируса только на стадии клинических его проявлений и при посмертном обследовании.

Но бешенство отличается от многих других инфекций тем, что вакцинация оказывается эффективной после заражения: вирус распространяется по организму скрытно, неуклонно, но очень медленно.

До сих пор миллионы людей получают вакцину этого типа. Она опасна своими побочными эффектами, поскольку кроме вируса бешенства содержит остатки тканей животного, что может вызвать аллергическую реакцию. Но такая вакцина проста в производстве и относительно дешева. ВОЗ рекомендует в ближайшее время отказаться от вакцин этого типа и перейти на работу с вакцинами, полученными из культуры тканей.

В 1956 году было предложено выращивание вируса в тканях эмбриона утки, а к концу 1960-х годов развитие методов культивирования тканей позволило размножать вирус в биореакторе, что значительно повысило чистоту препарата и снизило побочные эффекты.

Сейчас на рынке предлагаются препараты на основе разных штаммов вируса, полученные в разных культурах клеток. Главное условие: все они должны отвечать стандартам по иммуногенной активности: не менее 2,5 международных единиц в разовой дозе для внутримышечного введения.

Бешенство в России

В России за медицинской помощью после нападения животных обращаются от 250 тыс. до 450 тыс. человек в год. Все группы риска проходят постэкспозиционную (профилактическую) вакцинацию, причем в связи с опасностью заболевания без ограничения для детей, беременных женщин и людей с иммунодефицитом.

Несмотря на это, в России с начала этого века регистрируется от четырех до 22 смертей от бешенства в год. Потребность России в антирабической вакцине оценивается в 1,5 млн доз, срок хранения таких препаратов составляет до трех лет при температуре от +2°С до +8°С в защищенном от солнечного света месте.

Все это делает актуальным поиск вариантов вакцин нового типа — более дешевых (цена дозы в $45 в некоторых регионах мира оказывается для многих недоступной), более стабильных и менее капризных к условиям хранения (не везде можно обеспечить температурный режим хранения), более иммуногенных при меньшем количестве побочных эффектов.

ДНК-вакцины интересны тем, что в их составе можно комбинировать белки разных представителей рода лиссавирусов, их проще хранить, дешевле производить. ДНК-вакцины уже проходят испытания в животноводстве.

Но в случае ДНК-вакцин для человека существенным ограничением для их внедрения становится смертельный характер заболевания.

Но даже при полном охвате групп риска постэкспозиционной вакцинацией проблема бешенства не будет решена до конца. В природе останутся ее зоонозные очаги, и придется постоянно ждать, не произойдет ли там какой-нибудь мутации вируса, против которой даже самые продвинутые ДНК-вакцины окажутся бессильными. Требуется вакцинация диких животных — носителей вируса, желательно поголовная. Основные целевые виды вакцинируемых животных: лисица, енотовидная собака, песец, корсак, шакал.

Ее проводят с помощью специальных кормовых добавок или кормовых брикетов с дозой вакцины, которые распространяются в дикой природе или в зонах, граничащих с поселениями, на неблагополучных и угрожаемых по бешенству территориях. При поедании приманки животное раскусывает блистер с вакциной, вирус контактирует со слизистой оболочкой ротовой полости и глотки в области окологлоточного лимфоидного кольца, проникает в организм и, проходя ограниченное количество циклов репродукции, инициирует иммунный ответ к вирусу бешенства через 21 сутки.

Методика не нова. В странах Западной Европы она применятся с конца 1970-х годов. Пионером была Швейцария, где в 1978 году была применена массовая оральная вакцинация лис, после того как ученые в опытах продемонстрировали, что орально введенный аттенуированный штамм вируса бешенства SAD может защищать лис от заболевания. Через пять лет после первого испытания в Швейцарии по этому пути пошла Германия, где использовали вакцину SADD 19, производную от швейцарского вакцинного штамма. Еще через три года к вакцинации диких животных присоединилась Франция.

В начале 1990-х здесь на площади 120 тыс. кв. км было разбросано 4,4 млн приманок. После этого заболевание бешенством не отмечалось здесь ни среди людей, ни среди животных. Фактически был создан грандиозный иммунологический барьер от Ла-Манша до швейцарской границы. Частота бешенства снизилась на 99,7%, заболевание во Франции практически исчезло.

У нас такие же меры принимались еще при Советском Союзе, но при огромной территории нашей страны разделить ее сплошными иммунологическими барьерами и зачистить потом территории внутри них невозможно.

Была избрана другая стратегия — выявление зоонозных очагов вируса бешенства и иммунизация животных в них приманками с вакцинами, в том числе с применением авиации для разбрасывания приманок с вакцинными блистерами. Образно говоря, в отличие от стран ЕС, в России ковровые бомбардировки вакцинированными приманками невозможны, тут требуется прицельное бомбометание.

Вакцинированные брикеты разбрасываются с самолетов малой авиации из расчета 20–30 брикетов на 1 кв. км. Считается, что систематическое применение такого метода вакцинации позволяет в течение шести лет перевести территорию в разряд благополучных по бешенству. После реформы системы управления в ветеринарии в начале 2000-х годов, когда полномочия по борьбе с бешенством переданы на региональный уровень, занимаются этим ветеринарные службы регионов.

В 2018 году природные очаги бешенства обнаруживались на большей части территории России (за исключением 14 регионов). Лидерами по числу случаев заболевания животных стали Московская, Белгородская, Саратовская области, правда, эпидемиологический порог не был достигнут.

По данным Россельхознадзора, в 2019 году о раскладке брикетов с оральной вакциной от бешенства (в том числе с применением малой авиации) сообщили ветеринарные службы Московской области, Удмуртии, Бурятии, Татарстана, Кировской области, Ненецкого автономного округа и др.

Работы много. Но если она продолжится, а на смену традиционным антирабическим вакцинам придут более эффективные ДНК-вакцины, можно достичь цели, и бешенство в нашей стране перейдет в разряд экзотических болезней.

Алексей Дейкин, кандидат биологических наук, Институт биологии гена РАН