Бактериологическое исследование при гриппе

Проведен анализ клинико-лабораторной картины гриппа. Пневмония — одно из наиболее частых осложнений гриппа, и при гриппе А (H1N1)pdm09 фактором риска ее развития может служить наличие у пациента сопутствующих заболеваний сердечно-сосудистой и эндокринной

Analysis of clinical and laboratory picture of influenza. Рneumonia is one of the most common complication of the flu, and influenza A (H1N1)pdm09 risk factor for its development may be the presence of the patient’s concomitant diseases of the cardiovascular and endocrine systems.

Вирус гриппа является причиной периодического возникновения тяжелых эпидемий и пандемий в связи с высокой изменчивостью его антигенной структуры. Для человеческой популяции в современных условиях эпидемически значимыми являются два подтипа вируса гриппа А — H3N2 и H1N1, а также вирус гриппа В. По данным научных исследований большинство больных гриппозной инфекцией отмечается при среднетяжелой форме заболевания. Однако у определенной доли больных гриппом среднетяжелой формы развивается осложненное течение заболевания, что увеличивает продолжительность пребывания пациента в стационаре и период временной нетрудоспособности. В связи с этим целью данного исследования был сравнительный анализ клинико-лабораторной картины гриппа, вызванного разными типами/субтипами вируса, при среднетяжелой форме заболевания, а также — осложненного и неосложненного течения гриппа.

Обследовано 176 больных гриппом А (H1N1)pdm09, 87 больных гриппом A (H3N2) и 44 больных гриппом В со среднетяжелой формой заболевания, поступавших в ИКБ № 1 ДЗ г. Москвы в 2009–2013 гг. Характеристика больных среднетяжелой формой гриппа, вызванного разными типами/субтипами вируса, представлена в табл. 1.

Для определения в клетках эпителия носоглотки больных генетического материала вирусов гриппа А (H3N2), гриппа А (H1N1)pdm09, гриппа В, применялся метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). При наличии кашля и/или лихорадки всем пациентам проводилось рентгенологическое исследование органов грудной клетки.

Группы больных гриппом, вызванным разными типами/субтипами вируса, при среднетяжелой форме заболевания были не совсем равнозначны по половозрастному составу. Так, если среди больных гриппом А, вызванным разными субтипами возбудителей, соотношение мужчин и женщин было примерно одинаковым, то среди больных гриппом В преобладали мужчины. Во всех группах больных гриппом были преимущественно лица молодого возраста: при гриппе А (H1N1)pdm09 и гриппе В — 15–29 лет (57,4% и 79,5% соответственно), при гриппе А (H3N2) — 15–39 лет (57,4%). Интересно, что только при гриппе А (H3N2) почти четверть пациентов была в возрасте старше 60 лет.

Сравнительный анализ клинической симптоматики гриппа, вызванного разными типами/субтипами вируса, представлен на рис. 1.

Основные клинические симптомы, характерные для гриппозной инфекции, встречались при инфицировании всеми субтипами. Однако, как видно из рис. 1, в группе больных А (H1N1)pdm09 головная боль и заложенность носа встречались достоверно чаще, чем в группе А (H3N2) (р = 0,04 и р = 0,02 соответственно). В то же время в группе больных гриппом А (H3N2) достоверно чаще регистрировались озноб, головокружение, тошнота, боль при движении глазных яблок, резь в глазах при взгляде на свет, слезотечение и насморк по сравнению с группой A (H1N1)pdm09 (р 40 °C). У 70% пациентов больных гриппом, вызванным различными штаммами, температурная реакция регистрировалась в диапазоне 38,0–40,0 °С, у 7% — более 40 °С. Достоверных отличий по выраженности температурной реакции в первый день болезни у больных гриппом А (H1N1)pdm09, А (H3N2) и В выявлено не было, как и не установлено отличий по максимальным значениям температуры тела в течение заболевания.

Проанализировав наличие и длительность основных клинических симптомов, выраженность температурной реакции в первый день болезни, а также значения максимальной температуры тела в течение всего заболевания, можно сделать вывод, что при среднетяжелом течении гриппа на основании клинической картины невозможно заподозрить, каким типом или субтипом вируса вызван инфекционный процесс.

Особый интерес представлял вопрос о влиянии сопутствующей патологии на среднетяжелое течение гриппа, вызванного разными типами/субтипами вируса. В группе больных гриппом A (H1N1)pdm09 почти четверть пациентов имела сопутствующую патологию (42/176, 23,9%), при гриппе А (H3N2) и гриппе В процент таких больных был несколько меньшим (14/87, 16,1% и 3/44, 6,8% соответственно). Среди больных гриппом A (H1N1)pdm09 достоверно чаще преобладали сопутствующие заболевания сердечно-сосудистой (ИБС, артериальная гипертензия) и эндокринной систем (сахарный диабет 2-го типа, ожирение 2–4 ст.), по сравнению с больными гриппом А (H3N2) (17/176, 9,7% и 7/87, 8% соответственно, р = 0,048). В трех группах больных гриппом по частоте выявления заболеваний ЛОР-органов (хронический ринит, хронический синусит, хронический тонзиллит, 1,1–2,8%), дыхательной системы (бронхиальная астма, хронический бронхит, хроническая обструктивная болезнь легких, бронхоэктатическая болезнь, 4,0–4,6%), желудочно-кишечного тракта (хронический гастрит, хронический панкреатит, желчнокаменная болезнь, язвенная болезнь, 1,1–5,2%), мочевыделительной системы (хронический гломерулонефрит, хронический пиелонефрит, мочекаменная болезнь, 1,2–3,4%) достоверных различий не выявлено. При гриппе В сопутствующая патология сердечно-сосудистой системы не отмечалась. Обращает на себя внимание тот факт, что патология эндокринной системы встречалась только при гриппе A (H1N1)pdm09, при этом среди всех пациентов с наличием каких-либо сопутствующих заболеваний она регистрировалась в 38,1% (16/42) случаев.

Из 17 больных гриппом A (H1N1)pdm09 с наличием патологии сердечно-сосудистой системы развитие осложнений наблюдалось почти у половины пациентов (47,1%). Аналогичная картина наблюдалась и у больных с патологией эндокринной системы, так, среди 16 пациентов частота развития осложнений достигла 43,8%. Полученные данные позволяют высказать предположение о том, что заболевания сердечно-сосудистой и эндокринной систем являются факторами риска осложненного течения гриппом A (H1N1)pdm09.

Учитывая данное обстоятельство, была проанализирована частота развития осложнений у больных гриппом среднетяжелого течения, вызванного разными типами/субтипами вируса. Соотношение общего числа осложнений, наблюдаемых в анализируемых группах больных гриппом, представлено на рис. 3.

Как следует из рисунка, в большинстве случаев в трех группах больных гриппом регистрировалось неосложненное течение заболевания. В то же время частота осложнений при гриппе А (H1N1)pdm09 в 1,6–2,6 раза превышала таковую при гриппе А (H3N2) и В.

Самым частым осложнением у больных среднетяжелой формой гриппа, вызванного А (H1N1)pdm09, А(H3N2) и В, была пневмония (36/53 — 67,9%, 4/10 — 40% и 1/8 — 12,5% соответственно), которая была диагностирована у больных при поступлении в стационар. Другими осложнениями были у исследуемых больных острый бронхит, острый синусит, обострение хронического бронхита, бронхиальной астмы, евстахиит, ангина, инфекция мочевыводящих путей. Достоверно чаще регистрируются осложнения при гриппе А (H1N1)pdm09, по сравнению с гриппом А (H3N2) и гриппом В.

Учитывая тот факт, что пневмония была наиболее часто встречающимся осложнением у больных гриппом А (H1N1)pdm09, в дальнейшем был проведен сравнительный анализ клинико-лабораторной картины у больных среднетяжелой формой пандемического гриппа, осложненного и не осложненного пневмонией.

Среди 176 больных среднетяжелой формой гриппа А (H1N1)pdm09 пневмония диагностирована у 36 (20,5%) пациентов, среди которых было 25 мужчин и 11 женщин. Средний возраст составил 40,7 ± 2,3 года. Пациенты с гриппом А (H1N1)pdm09, осложненным пневмонией, поступали на 6,1 ± 0,6 дня болезни (с 1-го по 18-й день). У всех больных наличие пневмонии было подтверждено при рентгенологическом исследовании органов грудной клетки, при этом в большинстве случаев регистрировалось одностороннее поражение легких (24/36; 66,7%), двухсторонний процесс отмечался у 33,3% (12/36) пациентов. Из 36 больных с пневмонией сопутствующая патология отмечалась у 15 человек (41,7%), при этом примерно у половины пациентов (53,3%) наблюдалось сочетание нескольких заболеваний, относящихся как к одной, так и к разным системам органов. Как и для группы гриппа А (H1N1)pdm09 в целом, у этих больных преобладала сопутствующая патология сердечно-сосудистой (22,2%) и эндокринной (19,4%) систем.

Методом дискриминантного анализа устанавливалось информативное значение каждого из перечисленных факторов (пол, возраст, сопутствующая патология) на развитие пневмонии. Отдельно выявлялась диагностическая информативность клинических симптомов, показателей клинического и биохимического анализов крови. Степень такой информативности оценивалась по абсолютной величине стандартизированного канонического коэффициента дискриминантной функции. Как показал дискриминантный анализ, пол и возраст оказывали влияние на развитие пневмонии: у больных гриппом А (H1N1)pdm09 мужского пола пневмония развивалась чаще, чем у женщин, и это различие носило достоверный характер. Однако при сопоставлении с подгруппой больных без пневмонии это различие утрачивало достоверный характер (F = 2,279; p = 0,124) и не позволяет относить такой признак, как пол, к числу факторов риска развития пневмонии. Основные различия по соотношению возрастных групп у больных гриппом А (H1N1)pdm09 при наличии и отсутствии пневмоний касаются лиц моложе 50 лет. Однако при межгрупповом сравнении эти различия перестают быть достоверными (F = 0,488; p = 0,486).

При анализе клинических симптомов не выявлено достоверных различий в их частоте, длительности и степени выраженности при среднетяжелой форме гриппа А (H1N1)pdm09 с наличием или отсутствием пневмонии. В связи с этим невозможно использовать клиническую симптоматику в качестве прогностического/диагностического критерия развития такого осложнения гриппа, как пневмония.

В табл. 2 представлены показатели клинического и биохимического анализов крови у больных гриппом А (H1N1)pdm09 при наличии и отсутствии пневмонии на момент поступления в стационар.

Как видно из таблицы, не выявлено клинически значимых различий в профилях лабораторных показателей при среднетяжелой форме гриппа А (H1N1)pdm09, осложненного и неосложненного пневмонией. Несмотря на то, что средние показатели общего анализа крови в группе больных с пневмонией находились в пределах нормы, у 11/36 (30,6%) больных регистрировался лейкоцитоз от 9,5 до 20,9 × 10 3 /мл­; лейкопения 1-й степени тяжести (от 3,0 до 3,8 × 10 3 /мл 3 ) отмечалась у 3/36 (8,3%); тромбоцитопения 1-й степени тяжести (от 95 до 178 × 10 3 /мл 3 ) регистрировалась у 20/36 (55,6%) пациентов. У 3 больных отмечалось сочетание лейкопении и тромбоцитопении. Лимфоцитоз, характерный для типичного течения вирусной инфекции, не был выявлен ни у одного больного.

В группе больных гриппом А (H1N1)pdm09, гриппом А (H3N2), гриппом В, у которых заболевание протекало в среднетяжелой форме, преобладали лица в возрасте от 15 до 39 лет. Аналогичные данные были получены и другими авторами как в России, так и за рубежом [1–3]. Среди наблюдаемых групп больных со среднетяжелым течением гриппа преимущественно отмечались осложнения со стороны нижних отделов дыхательных путей. Наибольшая частота развития осложнений была выявлена у больных гриппом А (H1N1)pdm09 — 30,1% (53/176), из них в 67,9% случаев регистрировалась пневмония. Анализ клинико-лабораторной картины показал, что по клиническим симптомам грипп А (H1N1)pdm09 практически не отличается от заболеваний, вызванных как другими типами/субтипами вируса гриппа, так и от острых респираторных заболеваний другой этиологии, что согласуется с данными других авторов [4]. Кроме того, такой важный симптом пневмонии, как кашель, теряет свою диагностическую ценность при гриппе А (H1N1)pdm09, поскольку у подавляющего большинства больных этот симптом присутствует вне зависимости от наличия/отсутствия пневмонии в сочетании с температурной реакцией организма.

Сравнительный анализ клинико-лабораторной картины гриппа, вызванного разными типами/субтипами вируса, показал, что она сопоставима при среднетяжелой форме гриппа А (H1N1)pdm09, А (H3N2) и В. В то же время достоверно чаще регистрировались осложнения при гриппе А (H1N1)pdm09 по сравнению с гриппом А (H3N2) и гриппом В, причем в большинстве случаев выявлялась пневмония. На основе клинико-лабораторных данных при среднетяжелой форме гриппа А (H1N1)pdm09 не удалось выявить факторов, ассоциированных с развитием пневмонии на ранних этапах заболевания, в том числе и не оказывали влияния пол и возраст пациента. На основании клинических данных можно только предположить, что одним из факторов риска развития пневмонии при гриппе А (H1N1)pdm09 может служить наличие у пациента сопутствующих заболеваний сердечно-сосудистой и эндокринной систем, в связи с чем данная категория пациентов, в первую очередь, нуждается в проведении профилактических мероприятий, в том числе вакцинации.

Работа выполнена в рамках гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации (НШ-5855.2014.7).

Литература

1. Авдеев С. Н. Пневмония и острый респираторный дистресс-синдром, вызванные вирусом гриппа А/H1N1 // Пульмонология. 2010. Приложение: грипп А/H1N1.
2. Киселев О. И., Цыбалова Л. М., Покровский В. И. Грипп: эпидемиология, диагностика, лечение, профилактика. М.: Медицинское информационное агентство, 2012., 496 с.
3. Jain S., Kamimoto L., Bramley A. M. et al. Hospitalized patients with 2009 H1N1 influenza in the United States, April–June 2009 // N Engl J Med. 2009; 361: 1935–1344.
4. Свистунова Н. В., Баранова И. П., Зыкова О. А., Федорова О. В. Сравнительный анализ клинических особенностей гриппа А (H1N1) и гриппа В у госпитализированных больных // Инфекционные болезни. 2013, т. 11, № 1, с. 27–32.

Н. Д. Ющук, доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН
Н. О. Бокова, кандидат медицинских наук
К. Р. Дудина 1 , доктор медицинских наук
О. О. Знойко, доктор медицинских наук, профессор
И. П. Балмасова, доктор медицинских наук
М. Г. Кулагина, кандидат медицинских наук

ГБОУ ВПО МГМСУ им. А. И. Евдокимова, Москва

Материалами для микробиологической диагностики гриппа и других ОРЗ являются мазки из пораженных органов, носоглоточные смывы, соскобы с конъюнктивы, кровь, спинномозговая жидкость, испражнения и образцы, полученные при аутопсии.

Материал для микробиологического исследования следует забирать в оптимальные сроки. К моменту появления первых симптомов заболевания содержание возбудителей в патологическом материале максимально и сохраняется на достаточном уровне всего несколько дней. Пробы для исследования забирают с соблюдением правил асептики, даже если материал сам по себе не является стерильным (фекалии и др.). Рекомендуется использовать стеклянные флаконы или посуду из нетоксичной пластмассы с завинчивающейся пробкой.

Многие возбудители нестойки по внешней среде, поэтому пробы следует сохранять влажными и на холоду, но не замораживать. Для сохранения жизнеспособности вирусов исследуемый материал погружают в стабилизирующую среду, состоящую из раствора Хенкса или гидролизата лактальбумина, обогащенных 5-10% прогретой сыворотки крупного рогатого скота. Для подавления роста сопутствующей микрофлоры к указанным выше растворам добавляют 500 ЕД/мл пенициллина, 200-300 мг/мл стрептомицина и 100-200 ед/мл нистатина.

Носоглоточное отделяемое берут натощак. Больному предлагают прополоскать горло10 мл изотонического раствора хлорида натрия и собрать смыв в широкогорлую банку. Ватными тампонами протирают носовые ходы и заднюю стенку глотки и помещают их в банку со смывом. В лаборатории тампоны отжимают о стенку сосуда и удаляют, а смыв центрифугируют или отстаивают в холодильнике. Для выделения вирусов используют надосадочную жидкость.

Соскобы с конъюнктивы забирают платиновой петлей и делают мазок на предметном стекле. Для выделения возбудителей материал забирают тампоном и помещают его в транспортную среду.

Кровь для серологического исследования берут из вены в объеме 10 мл не менее двух раз: на 1-2 сутки и на 10-20 дни болезни. Если нет уверенности в стерильности сыворотки, то ее лучше заморозить, так как это предотвращает рост контаминирующей микрофлоры и сохраняет специфические антитела, титр которых при длительном хранении при плюсовой температуре может снижаться. Спинномозговую жидкость исследуют при подозрении на менингит или энцефалит.

Пробы фекалий массой 4-8 г помещают в сухой стерильной флакон.

Трупный материал следует забирать как можно раньше, так как титр возбудителей в тканях после смерти падает очень быстро. От трупов берут кусочки легкого, трахеи, бронхов, кишечника, регионарные лимфатические узлы и помещают в стерильную посуду.

Взятые тем или иным способом образцы патологического материала транспортируют в лабораторию в термоконтейнерах, в которых поддерживается температура 2-4 о С. Доставка проб в лабораторию должна осуществляться в максимально короткий срок.

Микробиологическое исследование материалов от больных гриппом и ОРЗ (Приложение 1) включает в себя методы экспресс- и серологической диагностики, а также выделение возбудителей на культурах клеток, куриных эмбрионах, лабораторных животных и питательных средах с последующей идентификацией их на основании комплекса морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и антигенных признаков.

Методы экспресс-диагностики позволяют получить предварительный ответ в течение нескольких часов с момента поступления проб в лабораторию. С этой целью чаще всего используются реакция иммунофлуоресценции (РИФ) и иммуноферментный анализ (ИФА). Для обнаружения некоторых возбудителей (аденовирусы, реовирусы, хламидии и др.) применяют методы гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК) и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для обнаружения внутриклеточных включений при хламидийной инфекции мазки из патологического материала окрашивают по методу Романовского-Гимзе.

Для выделения возбудителей гриппа и других ОРЗ из полученного от больных патологического материала заражают культуры клеток, куриные эмбрионы и лабораторных животных, а также производят посев на питательные среды. После первичного заражения для увеличения концентрации возбудителей проводят 1-3 дополнительных пассажа, а затем осуществляют их идентификацию на основе иммунологических методов исследования (РИФ, РТГА, РН и др.). Результативность методов выделения возбудителей варьирует в широких пределах. Чаще всего положительные результаты могут быть получены в период эпидемических вспышек.

Серологические исследования являются наиболее распространенными методами диагностики гриппа и других ОРЗ в связи с их относительной простотой и доступностью для большинства микробиологических лабораторий. В основе этих методов лежит обнаружение увеличения титров специфических антител в динамике инфекции с помощью различных иммунологических реакций. Особенностью серологических методов исследования является получение результатов спустя 10-20 суток с момента начала заболевания. Вместе с тем, методы биологического обогащения исследуемого материала (заражение культур клеток и др.), несмотря на их сложность, в целом ряде случаев не позволяют получить ответ в более короткие сроки. Чаще всего применяют реакции связывания комплемента (РСК), торможения гемагглютинации (РТГА), нейтрализации (РН) и иммуноферментный анализ. Для постановки реакций используют стандартные антигенные диагностикумы, снабженные наставлением по применению. Диагностическое значение имеет обнаружение четырехкратного и более увеличения титра специфических антител к возбудителю инфекции при исследовании полученных от больного парных сывороток.

Об актуальных изменениях в КС узнаете, став участником программы, разработанной совместно с ЗАО "Сбербанк-АСТ". Слушателям, успешно освоившим программу выдаются удостоверения установленного образца.

Программа разработана совместно с ЗАО "Сбербанк-АСТ". Слушателям, успешно освоившим программу, выдаются удостоверения установленного образца.

Методические указания МУК 4.2.2136-06 “Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей” (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 9 ноября 2006 г.)

В справке нет пункта 3!

Дата введения: с момента утверждения

ВГПА - вирус гриппа птиц типа А

Биобезопасность - биологическая безопасность

ЛПУ - лечебно-профилактические учреждения

МФА - метод иммунофлуоресцирующих антител

ОТ-ПЦР - метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции

1.1 В настоящих методических указаниях определены порядок сбора, упаковки, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных (и умерших) пациентов при лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА).

1.2 Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебно-профилактических и других организаций, независимо от организационно-правовой формы.

3.1 При эпизоотическом неблагополучии в России и за рубежом по ВГПА и при отсутствии лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей на данной территории:

3.1.1 Забор материала от пациентов (или умерших) с подозрением на инфекцию ВГПА проводят в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ).

Применяемые на этом этапе тест-системы должны обеспечивать первичную идентификацию возбудителя как вируса гриппа типа А и дифференциацию штаммов этого вируса по типу гемагглютинина (например Н5).

3.1.4 При получении положительных результатов подтверждающего тестирования референс-лаборатория проводит изоляцию вируса, изучение его свойств и депонирование.

Максимальное внимание должно уделяться случаям ВГПА с предположительной передачей от человека человеку. Регистрация подобных случаев требует незамедлительного проведения комплекса противоэпидемических мероприятий и изучения генетических особенностей изолята ВГПА.

3.2 При наличии лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей ВГПА на данной территории:

3.2.1 Забор материала проводят в ЛПУ при подозрении на заболевание ВГПА.

3.2.3 Обязательное подтверждающее тестирование в референс-лаборатории не проводится. Направление материала в референс-лабораторию осуществляется в случаях возникновения противоречивых результатов при первичном тестировании.

4.3 Для исследования забирают следующие виды клинического материала:

- смывы из полости носа и ротоглотки (для ОТ-ПЦР-анализа);

- мазки из полости носа (для МФА и ОТ-ПЦР-анализа) и ротоглотки (для ОТ-ПЦР-анализа);

- носоглоточное отделяемое (для выделения вируса, ОТ-ПЦР-анализа).

- фекалии (для ОТ-ПЦР-анализа).

Перечисленные выше процедуры по забору клинического материала врачи осуществляют в противочумных костюмах IV типа (или длинном хирургическом халате, с завязками на спине, шапочках), дополненных ватно-марлевыми повязками или респираторами типа ШБ-1 (или РБ) “Лепесток-200”. На руки надевают резиновые перчатки.

Целесообразно также включать в исследование аспираты из трахеи, бронхоальвеолярный лаваж и биоптаты легких при возможности их забора. Данные процедуры осуществляет врачебный персонал, одетый в противочумный костюм I типа (или длинный хирургический халат, с завязками на спине, дополненный фартуком, бахилами, косынкой, очками, ватно-марлевой повязкой или респиратором типа ШБ-1 (или РБ) “Лепесток-200” и перчатками).

Выбор времени забора клинического материала очень важен, так как наиболее высокое содержание вируса в дыхательных органах человека регистрируется в течение первых четырех дней после появления признаков заболевания. Образцы должны быть собраны в течение 3 сут. после появления клинических признаков, указанных в п. 6.1.

Для постмортальной диагностики используют аутоптаты легких, трахеи и селезенки.

От одного больного должно забираться не менее трех видов клинического материала. Обязательно следует забирать мазки из полости носа и роторлотки и носоглоточное отделяемое. Каждый образец материала помещают в отдельную транспортную емкость.

4.4 Сбор материала производят в пробирки со стабилизирующей средой, приготовленной согласно приложению 4, и/или в пробирки с транспортной средой, предоставляемой (или рекомендуемой) фирмой-производителем тест-систем.

4.5 Отправку материала в лабораторию осуществляют в транспортной таре со стабилизирующей средой (приложение 4).

1) в транспортную емкость (плотно закрывающиеся пластмассовые пробирки или флаконы с завинчивающимися крышками); плотно закрытый верхний конец транспортной емкости вместе с крышкой герметизируют различными пластификаторами (парафин, парафильм и др.); емкость маркируют;

2) в полиэтиленовый пакет подходящего размера с ватой (или другим гигроскопичным материалом) в количестве достаточном для адсорбции всего образца в случае его утечки; полиэтиленовый пакет следует герметично заклеить или запаять;

5.1.1 Образцы от одного пациента могут быть упакованы в один полиэтиленовый пакет. Не допускается упаковывать образцы материалов от разных людей в один и тот же пакет.

5.1.2 В полиэтиленовый пакет вкладывают бланк направления с указанием: наименование направляющего учреждения, ФИО больного, возраст, место жительства, предварительный диагноз, эпидемиологический анамнез, вид материала, дата и время взятия материала.

5.2 Герметично закрытые полиэтиленовые пакеты помещают в термоизолирующий плотнозакрывающийся контейнер (термос), приспособленный для транспортирования биологических материалов.

5.2.1 В термоконтейнеры и термосы помещают охлаждающие элементы или пакеты со льдом. К наружной стенке термоконтейнера или термоса прикрепляют этикетку с указанием вида материала, условий транспортирования, названия пункта назначения. Сроки и условия транспортирования упакованных проб клинического материала указаны в приложении 2.

5.3 Транспортирование проб клинического материала в референс-лабораторию, вирусологические лаборатории и лаборатории учреждений противочумной системы Роспотребнадзора осуществляется нарочным(и), информированным о правилах доставки материала в соответствии с п. 3.4. СП 1.2.036-95.

6.1 При отсутствии лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей на данной территории лабораторные исследования с целью диагностики ВГПА следует проводить у пациентов с респираторными заболеваниями тяжелого течения и неясной этиологии при наличии как минимум двух из перечисленных (следующего комплекса - убрать) симптомов:

- фебрильная лихорадка с температурой тела выше 380C;

- затрудненное дыхание или дыхательная недостаточность;

- водянистая диарея при отсутствии слизи и крови в фекалиях;

в комбинации хотя бы с одним из следующих эпидемиологических признаков в период 1-7 дней перед появлением симптомов :

- посещение мест регистрации заболевания ВГПА у птиц или людей;

- тесный контакт (в радиусе 1 метра) с лицом, являющимся подозрительным, вероятным или подтвержденным случаем ВГПА;

- контакт с погибшими или больными птицами, уход, убой, ощипывание, разделка тушек, подготовка к употреблению домашней или дикой птицы или контакт с их останкам или объектами окружающей среды, контаминированными их фекалиями на территории, где в течение последнего месяца были заподозрены или подтверждены случаи инфекции ВГПА у животных или людей;

- манипуляции с образцами клинического материала (от животных или людей), подозрительным на зараженность ВГПА в лаборатории или в иной обстановке;

- употребление сырых или недостаточно приготовленных продуктов из домашней птицы на территории, где в течение последнего месяца были заподозрены или подтверждены случаи инфекции ВГПА у животных или людей.

- Тесный контакт с подтвержденно инфицированным ВГПА животным, но не домашними или дикими птицами (например, кошка или свинья).

Данный случай расценивается как подозрительный случай ВГПА.

Вероятный случай ВГПА - лицо, умершее от необъясненного острого респираторного заболевания, которое расценивается как эпидемиологически связанное по времени, месту и экспозиции с вероятным или подтвержденным случаем ВГПА, а также лицо, отвечающее критериям для подозрительного случая, и одному из дополнительных критериев:

a. инфильтраты или признаки острой пневмонии на рентгенограмме грудной клетки плюс признаки дыхательной недостаточности (гипоксемия, выраженное тахипноэ) или

b. положительный результат лабораторного подтверждения инфекции, вызванной вирусом гриппа А, но недостаточное лабораторное подтверждение инфекции.

6.2 При наличии лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей ВГПА на данной территории показанием к обследованию являются клинические симптомы, приведенные в п. 6.1. Дополнительные эпидемиологические признаки являются необязательными.

6.3 Исследование секционного материала от умерших на наличие вируса ВГПА проводят при:

- сходстве клинической картины заболевания, приведшего к летальному исходу, с описанной в п. 6.1 или невозможности исключения такой клинической картины в анамнезе и при наличии в анамнезе хотя бы одного из перечисленных в п.п. 6.1 дополнительных эпидемиологических признаков.

6.4 Исследования проводят с использованием диагностических тест-систем, разрешенных к применению в установленном порядке. Для выявления ВГПА методом ОТ-ПЦР предпочтение должно отдаваться диагностическим тест-системам, которые обеспечивают максимальную контаминационную безопасность исследований.

6.5 При проведении первичного тестирования на наличие вируса ВГПА должны исследоваться не менее 2 видов клинического материала (например: мазки из полости носа и из ротоглотки) с использованием как минимум двух методов - ОТ-ПЦР и МФА.

6.6 При получении отрицательных результатов исследования всех образцов выдается окончательный отрицательный ответ.

При отсутствии регистрации заболевания людей, вызванных ВГПА, на данной территории при получении хотя бы одного положительного результата при МФА исследовании или использовании ОТ-ПЦР выдается предварительный положительный ответ и образцы направляют для подтверждающего тестирования в референс-лабораторию.

В период регистрации заболевания людей, вызванных ВГПА на данной территории, обязательное подтверждающее тестирование не проводят, и при получении хотя бы одного положительного результата при вирусологическом исследовании или использовании ОТ-ПЦР выдается окончательный положительный ответ.

6.7 При подтверждении в референс-лаборатории положительного результата первичного тестирования, при исследовании хотя бы одного вида клинического материала выдается окончательный положительный ответ.

При получении в референс-лаборатории отрицательных результатов исследования двух видов клинического материала проводится повторное тестирование. При получении аналогичного результата выдается окончательный отрицательный ответ.

7.1 Первичное исследование материала от больного, подозрительного на зараженность вирусом ВПГА, проводят в лабораториях, имеющих разрешение на работу с ПБА III-IV групп патогенности.

Подтверждающее тестирование осуществляется в референс-лаборатории.

7.2 Проведение работ, не связанных с накоплением вируса, образованием аэрозолей инфицированного материала (окраска и просмотр мазков, постановка серологических реакций с необеззараженным, диагностическим материалом, серологические исследования с необеззараженным материалом) осуществляют в противочумном костюме IV типа, дополненном ватно-марлевой повязкой или респиратором типа ШБ-1 (или РБ) “Лепесток-200 и резиновыми перчатками. Работы проводят в боксе биологической безопасности II класса.

7.3 Проведение работ по заражению культур клеток или куриных эмбрионов, а также связанных с возможностью образования аэрозоля осуществляют в боксах безопасности III класса. Работы проводят в противочумном костюме IV типа, дополненном ватно-марлевой повязкой или респиратором типа ШБ-1 (или РБ) “Лепесток-200 и резиновыми перчатками.

7.4 Аптечка экстренной профилактики лабораторий, проводящих диагностику заболеваний, вызванных ВГПА, должна быть укомплектована в соответствии с СП 1.3.1285-03 и дополнена двумя из следующих противовирусных препаратов: Циклоферона и Амиксина, Ремантадина, Альгирема, Арбидола и Озельтамивира (Тамифлю).

7.5 Режимы обеззараживания различных объектов при лабораторной диагностике ВГПА (в соответствии с СП 1.3.1285-03).

7.5.1 Обеззараживание поверхностей помещения (пол, стены, двери), оборудования, рабочих столов и др. - двукратным протиранием с интервалом 15 мин 6% раствором перекиси водорода или 3% раствором хлорамина (экспозиция 120 мин), либо любым дезинфицирующим средством, обладающим вирулицидной активностью, с последующей обработкой УФ в течение 60 мин.

Запрещено одновременное использование 6% раствора перекиси водорода и 3% раствора хлорамина в пределах одной лаборатории в связи с опасностью взрывоподобного характера протекания химической реакции при смешении этих растворов.

7.5.2 Обеззараживание защитной одежды осуществляют:

а) кипячением в 2% растворе соды в течение 30 мин с момента закипания;

б) замачиванием на 30 мин при 50. С в 3% растворе перекиси водорода с 0,5% моющего средства.

7.5.3 Обеззараживание перчаток - замачиванием на 60 мин в 6% растворе перекиси водорода с 0,5% моющего средства или в 3% растворе хлорамина.

7.5.4 Обеззараживание лабораторной посуды, автоклавируемых дозаторов, наконечников, вируссодержащих жидкостей, агарозного геля, инструментария из металла проводится методом автоклавирования - давление 2,0 кГс/см2 (0,2 Мпа), температура 132+-2. С, время 45 мин.

7.5.5 Обеззараживание дозаторов - двукратным протиранием поверхностей дозатора с интервалом 15 мин 6% раствором перекиси водорода, с последующей обработкой в парах формалина в течение 60 мин.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

Рекомендуется использование следующей стабилизирующей среды для хранения и транспортировки материала от людей для дальнейших вирусологических исследований.

Среда готовится в стерильных условиях, автоклавирование не допускается, можно стерилизовать фильтрованием через нитроцеллюлозный стерильный фильтр в стерильную же посуду.

- среда для культур клеток N199, содержащая 0,5% BSA;

- пенициллин 2 х 10(6) ед./л, стрептомицин 200 мг/л, полимиксин В 2 х 10(6) ед./л, гентамицин 250 мг/л, нистатин 0,5 х 10(6) ед./л.

Методические указания МУК 4.2.2136-06 “Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей” (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 9 ноября 2006 г.)

Текст методические указания официально опубликован не был

2. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 ноября 2006 г.