Бетулин при гепатите с

Основным источником Берканы (бетулина) является берёза, растение отечественной экологической ниши. Он впервые выделен из бересты в 1778 году. В 1876 году опубликованы результаты элементарных анализов этого вещества (У. Хаусман). Бетулин является пентациклическим тритерпеном с углеродным скелетом ряда лупана, особенность которого – кольцо с пятью атомами углерода.

В составе растительных оболочек бетулин необходим для защиты растения от повреждающих факторов окружающей среды: радиации, бактерий, грибков, вирусов, насекомых. В небольших количествах он содержится во множестве растений, но особенно много его в бересте, так как древесина берёзы достаточно мягкая и подвержена гниению.

О надёжности защитных свойств бересты говорит факт её сохранности в почве почти тысячу лет (новгородские берестяные грамоты).

В народной медицине береста использовалась при различных заболеваниях (нарывы, фурункулы, расстройства желудочно-кишечного тракта, берестяным дымом стерилизовали выстиранные бинты и корпию в военно-полевых условиях), использовалась как жвачка для укрепления зубов и дёсен. Размолотая береста входила в состав хлеба у многих народов. Береста – пищевой продукт.

Фармакологическая активность бетулина очень широка и достаточно хорошо изучена. В настоящее время интерес к его свойствам только возрастает, о чём говорят многочисленные отечественные и зарубежные публикации.

Свойства бетулина:

• Гепатопротекторное
• Желчегонное
• Антилитогенное
• Антиоксидантное
• Противовоспалительное
• Противоопухолевое
• Гипохолестеринемическое
• Противовирусное
• Иммуномодуляторное
• Гиполипидемическое
• Антигипоксантное
• Гастропротекторное
• Нейропротекторное
• Антисептическое.
• Антимутагенное.

Этот спектр свойств взаимосвязан, многие вытекают одно из другого.

Бетулин обладает сродством к биологическим мембранам клеток человека, не является чужеродным веществом для организма.

Изучение острой токсичности показало, что бетулин не является токсичным веществом, не проявляет аллергенных свойств, не обладает ни эмбриолетальным, ни тератогенным действием, а также

не влияет на развитие плацент. При хроническом введении бетулина на протяжении 30 суток не выявлены какие-либо токсикологические эффекты.

Гепатопротекторное действие

Исследования гепатопротекторного действия бетулина проводились на моделях острого гепатита, вызванного парацетамолом, четырёххлористым углеродом, этанолом. Парацетамол вызывает разрушение мембран клеток печени, угнетение активности ферментных систем, угнетение тканевого дыхания, вызывает перекисное окисление липидов клеточных мембран, снижает синтетические процессы в клетках печени, нарушает желчеобразовательную функцию печени.

Четырёххлористый углерод вызывает некроз гепатоцитов, воспалительный отёк, клеточную инфильтрацию. Его повреждающее действие на печень связано с превращением в процессе биотрансформации в сильнейший свободный радикал — трёххлористый углерод, который окисляет мембраны клеток печени и тиоловые группы ферментов.

Этиловый спирт вызывает некроз гепатоцитов, жировую дистрофию (накопление в печени жира), накопление алкогольного гиалина (фибриллярного белка), следствием чего является цирроз печени.

При непосредственном повреждении различными факторами в первую очередь страдает плазматическая мембрана печёночных клеток, а это сопровождается выходом ферментов цитозоля в кровь (АСТ, АЛТ, лактатдегидрогеназы, ЩФ).

Многочисленные опыты показывают способность бетулина защищать клеточные мембраны от повреждающего действия ксенобиотиков. Профилактическое применение бетулина (14 дней) в дозе 10 мг на килограмм веса предупреждает деструкцию гепатоцитов, воспалительную инфильтрацию, колликвационный некроз, улучшает желчеобразовательную функцию печени (на 4 сутки после интоксикации восстанавливалась интенсивность секреции желчи), защищает зоны печени с локализацией цитохрома Р-450. При этом активность АЛТ снижалась на 82%, ЩФ на 69%,

Бетулин стабилизирует мембраны митохондрий (энергетического депо клетки), препятствуя их повреждению в результате окислительных процессов, запускает естественный процесс апоптоза, не позволяя митохондриальной ДНК выйти из повреждённой клетки и тем самым инициировать аутоиммунный процесс (воспаление).

Таким образом, бетулин уравновешивает внутриклеточный ионный гомеостаз за счёт стабилизации плазматической мембраны и мембран внутриклеточных органелл, а также активации основного детоксицирующего фермента – цитохрома Р-450. На это указывает установленная на кафедре биологи-ческой химии Пятигорского фармацевтического института способность бетулина в условиях гипокси — состояния, сопровождающего токсическое поражение печени, повышать в ней уровень цитохрома Р-450 и относительной активности монооксигеназ.

Выводы:

Бетулин, как природный гепатопротектор эффективен (профилактически и в составе основной терапии) при острых и хронических поражениях печени любой этиологии, в том числе осложнённых холестазом. При вирусных заболеваниях печени (гепатит А, Б, С). При химио и лучевой терапии онкологических больных. При алкогольных поражениях печени (как профилактическое средство). При травмах, ожогах, хирургических операциях, особенно с общим наркозом.

Причиной хронического гепатита являются:

• Алкоголь,
• Лекарства: противотуберкулёзные, седативные, гипотензивные, цитостатические, антибиотики тетрациклинового ряда, наркотические средства и др.
• Бензол, четырёххлористый углерод,
• Анилиновые красители,
• Соли тяжёлых металлов.
• Острый вирусный гепатит.

Применение бетулина в комплексной терапии гепатитов и цирроза печени приводит к ускорению клинического выздоровления и восстановлению физической работоспособности. Важным фактором является отсутствие токсичности и побочных эффектов даже при грубом поражении паренхимы пе-чени.

Желчегонное, антилитогенное действие

Бетулин оказывает значительное желчегонное действие, которое сочетается с антилитогенным действием. Бетулин – основное средство для профилактики образования желчных камней и холецистита, так как он влияет непосредственно на причины их возникновения.

Причины, приводящие к формированию хронического холецистита и желчных камней:

Дискинезия. Атония желчных протоков с застоем желчи.

Дисхолия. Нарушение физико-химических свойств желчи. Если холестерина в желчи выше нормы, то он выпадает в осадок, способствуя образованию камней. Бетулин нормализует уровень холестерина, выводя его из организма с желчными кислотами, улучшает отток желчи, снимает воспалительные явления, улучшает работу печени. В присутствии бетулина в организме происходит задержка всасы-вания холестерина из кишечника, усиление выделения холестерина с желчью и окисление его в желчные кислоты, угнетение синтеза холестерина в печени.

Нужна осторожность при наличии крупных камней, так как двинувшийся камень может перекрыть желчевыводящий проток.

Противовоспалительное, иммуномодуляторное действие

Воспаление – это процесс борьбы между патогенным фактором и организмом. Если защитные функции организма (иммунитет) работают хорошо, воспаление может быть непродолжительным. Если плохо – хроническим, с тяжёлыми последствиями. Например, тканевая гипоксия угнетает процесс восстановления повреждённых клеток и может быть причиной иммунодепрессии. Иммуно -депрессия, в свою очередь, является причиной инфекционных патологий, наблюдается при травмах, росте злокачественных опухолей.

Бетулин значительно активирует фагоцитоз (неспецифические факторы иммунитета), активирует макрофаги (клетки — киллеры), которые начинают активнее поглощать бактерии, вышедшие из-под контроля организма раковые клетки и клетки, поражённые вирусами.

Бетулин проявляет выраженный противовоспалительный эффект в отношении фазы экссудации и пролиферации. Действие проявляется при местном и при системном введении. Бетулин действует на иммунную систему через цитокиновую сеть. Цитокины — растворимые пептидные медиаторы, являются медиаторами межклеточных взаимодействий при иммунном ответе. Они определяют тип и дли-тельность иммунного ответа, контролируют пролиферацию клеток, гемопоэз, воспаление, заживление ран и другие процессы. Цитокины, выделяемые эндотелиальными клетками и макрофагами, воспроизводят ранние стадии воспаления и его симптомы (отёк, покраснение, болезненность, гипертермию). Цитокины бывают провоспалительные и пртивовоспалительные. Мишенями их действия являются эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки кровеносных сосудов и лейкоциты крови. ЭК реагируют на вирусную инфекцию продукцией интерферона, однако, при повышенной репродукции вирусов выработка интерферона может снижаться.

Иммуномодулирующее действие бетулина на цитокиновую сеть является одним из механизмов его терапевтического действия.

Противовирусное действие

Бетулин индуцирует синтез интерферона при пероральном введении. Это важно для борьбы с вирусными инфекциями. Противовирусная активность бетулина установлена в отношении вирусов гриппа птиц, вируса гриппа типа А, вируса герпеса простого, гепатита С, ВИЧ-1, ИРТ (инфекционного ринотрахеита), БС-ВД (болезнь слизистых, вирус диареи).

Механизм лечебно-профилактического действия бетулина связан с его вирулицидным, интерфероногенным, иммуномодулирующим действием.

Бетулин блокирует сайт в молекуле вирусного белка, с которым в норме связывается протеиназа, в результате чего вирус лишается возможности инфицировать другие клетки. Бетулин влияет на позднюю стадию репликации вируса, по-видимому, на процесс формирования капсида – конусообразной сердцевины, которая вместе с внутренним нуклеокапсидом обеспечивает правильную упаковку вирусного генома – двух молекул одноцепочечной РНК. В результате сердцевина и внутренний нуклеокапсид принимают неправильную форму и созревание вирусной частицы не происходит. Любой сбой в процессе расщепления вирусного белка приводит к утрате вирусом инфекционности.

Таким образом, бетулин препятствует полноценной репродукции вируса в организме.

Преимуществом бетулина является тот факт, что количество противовирусных препаратов ограниче-но, многие иммуномодуляторы не могут широко применяться в клинической практике из-за токсичности и побочных явлений. Например, препараты интерферона отличает кратковременность действия, необходимость применять в начальной стадии болезни, высокая стоимость. Длительное применение интерферона вызывает тревогу и раздражительность, острые психозы и попытки суицида. Рибавирин вызывает ярко выраженную анемию. Бетулин не токсичен и не имеет побочных действий. Свойства бетулина заключаются в отмене гиперактивности системы интерферона или повы-

шении её функциональной активности при гипореактивности, в сохранении способности лейкоцитов продуцировать интерферон. Бетулин действует на иммунную систему через цитокиновую сеть.

Противоопухолевое действие

Бетулин – препарат сопроводительной терапии при лечении онкологических заболеваний.

В условиях иммунного дефицита раковые опухоли появляются чаще. Даже простая травма на время снижает иммунитет. (Бетулин – иммуностимулятор). Опухолевые клетки растут в условиях дефицита кислорода, при котором нормальные клетки не могут развиваться. (Бетулин – антигипоксант). В раковых клетках перестроен энергетический метаболизм, в результате чего они потребляют в 20 раз больше питательных субстратов, чем нормальные клетки. Мембрана раковой клетки перестраивается для пропуска этих потоков. Бетулин, встраиваясь в клеточную мембрану раковой клетки, на начальном этапе препятствует её реорганизации и обрекает на естественную гибель (апоптоз). Таким образом, бетулин действует избирательно на больные клетки и повышает устойчивость здоровых клеток.

Бетулин – единственный из отечественных препаратов, который обладает высокой гепатопротекторной, нефропротекторной, антиоксидантной активностью на фоне ПХТ. Усиливает противоопухолевый и антиметастатический эффект полихимиотерапии.

Гипохолестеринемическое действие. Профилактика атеросклероза.

Антиоксидантное действие

В основе всех патологических процессов лежит повреждение плазматических мембран и мембран внутриклеточных органелл (особенно митохондрий, лизосом и оболочки клеточного ядра). Мембраны клеток содержат повышенное количество фосфолипидов, в состав которых входят полиненасыщенные жирные кислоты. Они – главная мишень для активных форм кислорода. Этот процесс называется перекисным окислением липидов (ПОЛ).

Активные формы кислорода образуются как при различных патологиях, так и в процессе тканевого дыхания. Нейтрализовать их воздействие призваны антиоксиданты, в частности, витамины и тритерпеновые соединения. Антиоксиданты являются важным звеном механизма регуляции пролифера-тивных процессов.

На модели острого токсического гепатита установлено ингибирование окисления липидов печени крыс бетулином. В ингибировании окисления принимают участие несколько реакционных центров, принадлежащих структуре бетулина. Наибольший вклад принадлежит первичному гидроксилу С-28-ОН. Это более половины эффективности всей структуры бетулина в целом.

Ингибирующее действие бетулина связано с вовлечением спиртовых групп в процесс окисления, где происходит обмен активных радикалов на оксипероксильные радикалы, в структуре которых существует внутримолекулярная водородная связь, что снижает их активность в реакциях продолжения цепей. Это приводит к уменьшению энтропии при образовании активированного комплекса.

Известно, что постреанимационный период характеризуется повышением проницаемости биологических мембран органов и тканей под влиянием лизосомальных ферментов в период острой гипоксии. Острая гипоксия сопровождается нарушением тканевого дыхания, что приводит к гибели клеток, если фактор агрессии не устранить или ослабить его воздействие введением антиоксидантов. Синтетические антиоксиданты проявляют побочные действия, поэтому лучше отдавать предпочтение природным АО.

ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ БЕТУЛИНА И ПРОФИЛАКТИКА
СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ЗАБО-ЛЕВАНИЙ

Бетулин обладает гиполипидемическим и гипохолестеринемическим действием.

Атеросклероз – заболевание артерий. Сопровождается появлением атеросклеротических бляшек, сужением кровеносных сосудов, недостаточностью кровообращения. Медленно в скрытой форме развивается в организме. Клинические признаки атеросклероза говорят о серьёзной патологии. Ате-росклероз приводит к ишемической болезни сердца, острому инфаркту миокарда, инсульту, пораже-ниям сосудов конечностей и органов брюшной полости.

Механизм атеросклероза хорошо изучен. Заболевание начинается с окисления липопротеинов и накопления их в стенках сосудов. Липопротеины (сферические структуры) состоят из холестерина, эфиров холестерина и триглицеринов жирных кислот. Основная их часть метаболизируется и выводится печенью, поэтому сбои в работе печени и продукты окисления холестерина влияют на образование атеросклеротических бляшек.

Клеточный состав атеросклеротических бляшек оказался подобным составу очага иммунного воспаления. Эндотелий кровеносных сосудов наиболее подвержен повреждениям со стороны инфекционных агентов. Это ведет к морфологическим изменениям его клеток, происходит повреждение эндотелия сосудов воспалительного и невоспалительного характера.

Вирусы группы герпеса участвуют в патогенезе атеросклероза. Известно, что вирус простого герпеса-1 инфицирует не только нервную и эпителиальную ткань, но и эпителий крупных и мелких сосудов. ВПГ-1 и ЦМВ (цитомегаловирус) инициируют воспалительные изменения в сосудистой стенке.

В присутствии бетулина в организме происходит задержка всасывания холестерина из кишечника, усиление выделения холестерина с желчью и окисление его в желчные кислоты, угнетение синтеза лишнего холестерина в печени.

Бетулин препятствует развитию воспалительных процессов в стенках сосудов. Обладает противовирусным и бактерицидным действием. Улучшает барьерные функции сосудистого эндотелия.

Клеточные мембраны кардиомиоцитов содержат повышенное количество фосфолипидов, особо чувствительных к перекисному окислению. Принято считать, что деградация мембран кардиомиоцитов при ишемии на 60% протекает по неферментативному пути с участием свободных радикалов. Бету-лин как превентивный антиоксидант способствует предотвращению развития их повреждения.

Бетулин обладает корригирующим действием на эндотелий сосудов, находящийся в состоянии дисфункции.

АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ

Гипоксия – одна из разновидностей стрессовых ситуаций.
Гипоксия – причина патологических состояний:

• ишемической болезни сердца,
• инфаркта миокарда,
• нарушений функций мозга,
• нарушений функций печени, почек и т. д.

Опыты на лабораторных животных свидетельствуют, что профилактическое введение бетулина в течение 8 дней в дозе 10 мг на килограмм веса имеет ярко выраженную антигипоксическую активность на моделях гемической и нормобарической гипоксий.

Бетулин эффективен как профилактическое средство от кислородной недостаточности при:

• физических нагрузках,
• стрессовых ситуациях,
• при различных заболеваниях, на фоне приёма лекарств.

За счёт структурирования мембран митохондрий бетулин стимулирует перенос кислорода через митохондриальную мембрану.

Бетулин оказывает положительный эффект на систему обмена веществ, способствует профилактике ожирения. Опыты показали, что бетулин снижает уровень жиров в крови, повышает чувствительность к инсулину, а это уменьшает риск развития диабета. Шведские учёные полагают, что бетулин обладает лучшими качествами, чем имеющиеся сегодня лекарства от высокого содержания холестерина и профилактики сосудистых заболеваний.

Владельцы патента RU 2244554:

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и используется для лечения вирусного гепатита С. Препарат для лечения вирусного гепатита С, включающий экстракт бересты с содержанием бетулина более 70% и фармацевтически приемлемый носитель. Препарат вводят пациенту перорально. Препарат способствует эффективному лечению вирусного гепатита С. 3 н.з. п. ф-лы, 2 табл.

Настоящее изобретение относится к области медицины, а более конкретно относится к изысканию новых, эффективных средств лечения гепатита С.

Вирусные гепатиты относятся к категории наиболее опасных и распространенных инфекционных заболеваний. Ежегодно в мире от патологий, связанных с этой болезнью, умирают около 2 миллионов человек.

Причиной возникновения вирусных гепатитов являются, по крайней мере, 5 различных вирусов - энтеральные вирусы А и Е и парентеральные (В, С, Д).

Вирус гепатита С является самым "молодым", он был открыт лишь в 1989 году. С его открытием началось интенсивное изучение этой разновидности гепатита, являющейся основной причиной развития хронических диффузных заболеваний печени и гепатоклеточной карциномы.

Отличительной особенностью вируса гепатита С является способность к длительному персистированию в организме, что обуславливает высокий уровень хронизации инфекции (50-80% случаев). Устойчивость вируса обусловлена его способностью реплицироваться с высоким уровнем "мутации", в результате чего возникает несколько иммунологически различающихся вариантов, благодаря которым вирус избегает иммунного надзора. Образующиеся вируснейтрализирующие антитела являются высокоспецифичными и не способны нейтрализовать вновь появляющиеся варианты вируса.

Крайне высокий уровень заболеваемости вирусным гепатитом и, в частности, гепатитом С обуславливает актуальную задачу изыскания и создания эффективных средств терапии этой инфекции.

В настоящее время в практической медицине официально известно два препарата, используемых для лечения вирусного гепатита С (интерферон и рибавирин или виразол), однако это не делает задачу изыскания новых средств лечения этого заболевания неактуальной, в частности, из-за побочных эффектов, которые сопровождают применение известных препаратов, таких как развитие анемии, нейтропении, лейкопении, диспептические явления.

Задачей настоящего изобретения является изыскание нового, высокоэффективного средства для лечения гепатита С.

Другой задачей настоящего изобретения является изыскание высокоэффективного средства для лечения гепатита С природного происхождения, поскольку при этом отпадает целый ряд проблем, сопутствующих применению химиопрепаратов.

Указанные задачи решены настоящим изобретением благодаря установлению авторами высокой противовирусной активности по отношению к вирусу гепатита С у экстракта березовой коры (бересты) с содержанием бетулина в экстракте свыше 70%.

Бетулин является одним из первых природных веществ, которое впервые было выделено из растительного сырья еще в 1778 году. В 1876 году У.Хаусманн опубликовал результаты элементарных анализов бетулина (Hausmann U., Annalen der chemie, 182, р.365).

Основным источником природного бетулина является береза. Белая часть березовой коры у отдельных видов березы (Betula verrucosa, Betula papyfera) содержит до 30% и более бетулина (Hayek, E.W. et al.(1989) A Bicentenmal of Betulin, Phytochemistry, 28(9) р.2229-2242).

Бетулин является пентациклическим тритерпеном с углеродным скелетом ряда лупана, который также называют бетулинолом, трохотоном, березовой камфарой и (корили-) резинолом. Характерной особенностью ряда лупана является кольцо с пятью атомами углерода в составе пентациклической системы, которое в положении С-19 имеет α-изопентениловую группу. Бетулин отличается высокой термостабильностью, его температура плавления находится между 250 и 261°С, причем после сублимации рекристаллизованного продукта достигаются еще более высокие значения. Его молекулярный вес составляет 442,7, он растворим в пиридине и тетрагидрофуране, но мало растворим в дихлорметане, хлороформе и холодных органических растворителях, причем с повышением температуры его растворимость значительно возрастает. В воде и холодном петролейном эфире бетулин практически не растворим. Кроме того, кинетические исследования показали очень низкую реакционную способность гидроксильных групп бетулина.

Еще в 1899 году Дж.Уилер показал антисептические свойства бетулина, и поэтому он использовался для стерилизации перевязочных бинтов и пластырей (Wheeler J., (1899), Pharm. J., Die Darstellung des Betulin durch Sublimation, 494, Ref. Chem. Centr. 1900 I, стр. 353). В натуропатии и народной медицине получали и получают до сих пор отвары березовой коры, которые применяют для лечения малярии, водянки, подагры и при кожных заболеваниях, а также в виде настойки для компрессов при лечении абсцессов.

Большое число исследований посвящено гепатопротекторной активности бетулина. Было обнаружено, что бетулин снижает активность аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, содержание малеинового диальдегида, предупреждает воспалительный процесс в печени (Ю.К.Василенко и др. "Фармакологические свойства тритерпеноидов коры березы" Экспериментальная и клиническая фармакология, 1993, т.54 №4 стр. 53-55).

Однако не имеется достоверных сведений о противовирусной активности бетулина, в отличие от его различных синтетических производных. Так, сообщалось, что 3-замещенные глютариловые производные бетулина in vitro обладают цитотоксичностью в отношении лимфоцитов, трансформированных HIV ("Synthesis and anti - HIV activity of betulin derivaties", Bioorg Med Chem Lett. 1998 May 19, 8(10) p.1267-1272).

Большое число публикации посвящено получению целого ряда производных бетулиновой кислоты как потенциальных средств борьбы со СПИДом (см. например, "Synthesis and anti - HIV activity of betulinic acid and dihidrobetulinic acid derivaties", Bioorg Med Chem lett, 1997, Dec 5(12) p.2133-2143).

Возможность применения производных бетулина исследовалась и в отношении гепатита на моделях гепатита не вирусного происхождения, вызванного Cll₄, тетрациклином и ацетоном. (О.Б.Флехтер "Синтез эфиров тритерпеноидов группы лупана и их гепатопротекторная активность", Биоорганическая химия, 2000, том 26, №3, стр. 215-223).

Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что экстракт коры березы обладает антивирусными свойствами. Этот эффект был обнаружен на модели экспериментальной инфекции, вызванной вирусом гепатита С человека в организме мышей.

Несмотря на то, что антивирусная активность производных бетулина была показана рядом авторов на модели ВИЧ инфекции in vitro, неожиданность этого результата обусловлена не только тем обстоятельством, что предыдущие исследования бетулина не обнаруживали у него и у его производных противовирусной активности в отношении вирусного гепатита С, но и тем, что сами авторы изобретения при исследовании экстракта березовой коры в культурах клеток (in vitro) не обнаружили у него этой активности. Она проявилась лишь в условиях in vivo.

Далее описаны результаты исследований влияния экстракта березовой коры на репродукцию вируса гепатита С (далее сокращенно ВГС) в организме лабораторных животных.

Материал и методы:

Вирус: В работе использовали цитопатогенный вариант ВГС, выделенный из сыворотки крови хронически инфицированной ВГС больной. По данным генотипирования изолированный вариант ВГС относится к наиболее распространенному в России генотипу 1b ВГС. В исследованиях использовали инфекционные дозы ВГС, равные 10,0 ТЦД 50.

Противовирусный препарат. В работе использовали экстракт с содержанием бетулина, определенным методом ВЭЖХ - 72%. В опыте использовали различные разведения от 50 до 150 мг на 1 кг веса, которые вводили животным пероральным способом ежедневно в течение 4 дней.

Животные. Для изучения противовирусной активности бетулина использовали белых беспородных половозрелых мышей массой 18-20 г.

Методы. Материал, содержащий ВГС, вводили животным внутрибрюшинным способом. Часть животных оставляли контрольными. На 9-й день после заражения мышей “кормили” (вводили пероральным способом) раствором бетулина (физиологический раствор, с 10% Твина-80) (здесь и далее под бетулином понимается описанный выше препарат) в объеме 50 мкл, содержащих 50, 100 и 150 мг бетулина. Бетулин давали мышам 1 раз в день в течение 4-х дней. В опыте использовали по 10 животных на каждый вариант опыта. Через 2 дня, а также через 10 дней после последнего введения препарата, по 50% животных вскрывали, извлекали печень, головной мозг, забирали кровь. Пробы сывороток крови, надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин гомогенатов ткани печени и головного мозга использовали для определения антигенов ВГС и инфекционной активности вируса гепатита С. С этой целью вируссодержащие пробы титровали в культурах перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи СПЭВ. Антиген ВГС в данных пробах изучали в реакции гемагтлютинации, используя классический метод, описанный Clarke и Casals (1968).

Культуры клеток. Были использованы высоко чувствительные к цитопатогенному действию ВГС культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), полученные из фирмы “Нарвак”, Москва. Их использовали в виде однодневного монослоя клеток, выращенного в 24-луночных пластиковых панелях. Культуры клеток СПЭВ выращивали на среде 199 с 10% сыворотки эмбриона телят, с добавлением глютамина и антибиотиков (100 ЕД/мл). Для титрования остаточной инфекционной активности вируса использовали ту же линию клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ).

Инфекционную активность ВГС, содержащегося в пробах органов и тканей инфицированных мышей, учитывали по результатам титрования, как правило, на 6-7 день после инфекции, когда развивалось максимальное цитопатогенное действие вируса, используя формулу Рида и Менча для подсчета титра вируса гепатита С.

Данные исследований приведены в таблицах 1 и 2. Как видно из данных табл. 1а, все пробы сывороток крови, полученных от ВГС инфицированных мышей, относящихся к различным группам, содержат как антигенную, так и инфекционную активности ВГС. Причем максимальные проявления этих показателей обнаружены в контрольной группе ВГС инфицированных животных, не получавших бетулин. У животных, получавших препарат в дозе 50 мг на 1 кг веса в 50 мкл, была отмечена заметная тенденция к снижению титров гемагглютинина ВГС, а инфекционные титры ВГС в сыворотке крови падали на 2,6 lg (средние данные). Значительное снижение антигенной и инфекционной активностей ВГС в сыворотке крови отмечали в группе животных, получавших ежедневно препарат “бетулин” в дозе 100 мг/кг. В этом случае титры инфекционной активности ВГС падали на 3,4 lg и более чем в 2 раза снижалась антигенная активность ВГС в пробах сыворотки крови мышей. В меньшей степени препарат проявлял активность в случае использования его в дозе 150 мг/кг. Снижалась антигенная активность вируса, титры инфекционной активности незначительно снижались под влиянием препарата (на 1,8 lg). Близкие результаты, свидетельствующие об эффективности препарата “бетулин”, были получены при изучении тканей печени от всех групп животных (табл.1б). В частности показано, что максимальное снижение антигенов ВГС и его инфекционной активности наблюдали в случае использования препарата в разовой дозе 50 и 100 мг на 1 кг веса при 4-кратном введении препарата. Из данных таблицы 1б видно, что антигенная активность ВГС при этом снижалась в 2 и более раз и до 2 lg отмечали снижение инфекционной активности ВГС в тканях печени. Сокращались и размеры печени ВГС инфицированных мышей под влиянием лечебного эффекта препарата Наибольшие титры ВГС (до 7,0 lg ТЦД₅₀/20 мкл) наблюдали в тканях головного мозга ВГС инфицированных мышей (таблица 1 в). Однако и в этом случае у мышей, получавших препарат “бетулин” в дозах 50 и 100 мг на 1 кг наблюдали снижение титров инфекционной активности ВГС на 2,0-2,5 lg соответственно. При этом снижение антигена ВГС отмечали во всех группах животных, получавших препарат. В группе мышей, получавших бетулин в дозе 150 мг на 1 кг, отмечена тенденция к увеличению титров инфекционной активности ВГС в головном мозге.

Таким образом, данные, полученные при изучении органов и тканей мышей на 17 день после инфекции ВГС и 3-й день после 4-кратного применения препарата “бетулин”, свидетельствуют о высокой противовирусной активности препарата в отношении инфекции, вызванной ВГС у животных.

В этой связи выявлялась продолжительность положительных изменений в организме ВГС инфицированных мышей после отмены препарата. Поэтому 2-я группа ВГС инфицированных животных была обследована на 28 день после инфекции и на 11 день после отмены лечения препаратом “бетулин”.

Полученные результаты приведены в таблицах 2а, б, в. Исследование антигенной активности ВГС в органах и тканях мышей в этот период времени позволило установить, что лечение препаратом “бетулин” в дозах 50 мг и 100 мг на 1 кг, как правило, приводило к значительному снижению содержания гемагглютинина ВГС в пробах сыворотки крови, печени и головного мозга ВГС инфицированных животных (в дозе 100 мг на 1 кг до 4 раз - в печени мышей, в 2 и более раз - в сыворотке крови и головном мозге животных). Доза препарата, равная 150 мг на 1 кг, как правило, приводила к незначительному снижению содержания антигена ВГС в органах и тканях животных, инфицированных ВГС.

Изучение инфекционной активности ВГС в органах и тканях ВГС инфицированных мышей показало, что в отдаленные сроки после завершения лечения антивирусный эффект введенного препарата сохранялся в течение более чем 10 дней. Однако анализ полученных данных позволил обнаружить иные закономерности в параметрах инфекции ВГС в эти сроки. В частности, показано, что титры ВГС, содержащиеся в сыворотке крови и в печени контрольной группы животных в значительной степени превышали эти значения, выявленные в ранние сроки после заражения мышей (на 1,5 lg - в сыворотке крови, на 2,4 lg - в печени). В то же время, на 28-й день после инфекции в тканях головного мозга титры вируса стали заметно снижаться.

Противовирусный эффект препарата “бетулин” в эти сроки после отмены препарата был несколько снижен, однако наибольший эффект наблюдался в период, когда для лечения использовали дозу, равную 50 мг на 1 кг веса. В этом случае в сыворотке крови животных титры вируса снижались в среднем на 1,9 lg, в печени - на 2,9 lg, в головном мозге - на 2,4 lg. 4-кратное введение препарата “бетулин” в дозе 100 мг на 1 кг приводило к менее существенным изменениям титра ВГС в сторону уменьшения (см. таблицы.2а, б, в).

Таким образом, установлено положительное действие препарата “бетулин” на снижение показателей инфекции, вызванной ВГС у мышей, и через 10 дней после его отмены.

Полученные авторами изобретения результаты позволяют утверждать, что экстракт березовой коры обладает высокой антивирусной активностью в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С, что позволяет предлагать его в качестве средства для лечения этого вида гепатита.

При этом нет оснований утверждать, что содержание бетулина в экстракте не менее 70% является критическим и ограничивать им объем изобретения. Практически значимые результаты могут быть получены и при меньших значениях содержания бетулина. Установление этих граничных значений может быть осуществлено специалистами при проведении обычной рутинной работы, в частности, основываясь на изложенном выше в описании настоящего изобретения.

Предпочтительной формой применения экстракта бересты являются твердые лекарственные формы: таблетки, пилюли, капсулы, порошки. При этом могут использоваться обычные для этого вида фармацевтически приемлемые носители. Препарат может включать один или несколько наполнителей, таких как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, сахара, крахмалы, маннит, сорбит и другие полиолы, карбонат кальция, фосфат кальция, сульфат кальция, полиэтиленгликоли и др.

Препарат также может включать поверхностно-активные вещества и другие обычные компоненты для твердых фармацевтических препаратов, такие как красители, ароматизаторы, адсорбенты.

При изготовлении препарата в виде таблетки с покрытием последнее может быть получено из таких пленкообразующих веществ как гидроксипропилцеллюлоза, пластификатора, такого как полиэтиленгликоли, и других вспомогательных добавок таких как, например, пигменты.

1. Применение экстракта бересты в качестве средства для лечения вирусного гепатита С.

2. Препарат для лечения вирусного гепатита С, включающий экстракт бересты с содержанием бетулина более 70% и фармацевтически приемлемый носитель.

3. Способ лечения вирусного гепатита С, характеризующийся тем, что пациенту перорально вводят препарат по п.2.