Био иммунохимия гепатит в

Вирусный гепатит B – распространенное инфекционное заболевание. Вирус передается разными путями и способен выживать в неблагоприятных условиях, из-за чего риск поражения печени возрастает. Обнаружение в крови антител к вирусу Anti-HBs – способ диагностики болезни на ранних сроках. Помимо этого, они используются при создании вакцин, действие которых направлено на профилактику гепатита В.

О чем я узнаю? Содержание статьи.

Что такое HBsAg?

Все вирусы имеют оболочку, называющуюся капсидом. Оболочка представляет собой сложную комбинацию из аминокислот, липидов и иных веществ.

HBsAg – это поверхностный антиген вируса гепатита В. Он представляет собой сложный белковый комплекс, образующий внешнюю оболочку вируса. Выявление такого вещества в составе крови – главный признак заражения. Если анализ крови показывает наличие такого антигена, это означает, что пациент является носителем вируса.

Организм реагирует на попадание вирусного антигена, из-за чего активизируется выработка антител. Это первичная иммунная реакция на проникновение инфекционных агентов.

При заражении вирусом гепатита В вырабатываются антитела к HBsAg, выявление которых в результатах лабораторных исследований выступает диагностическим критерием. Также антитела к HBsAg активно вырабатываются при введении вакцины, что указывает на формирование иммунитета к болезни.

Антитела HBsAg: виды и расшифровка

Все антитела к HBsAg подразделяют на 5 типов. Они отличаются несколькими критериями.

К ним относятся:

Последовательность аминокислот.
Молекулярная масса.
Заряд.
Наличие гликопротеиновых компонентов.

Иммунохимические исследования, проводимые с использованием анализатора abbot architect, позволяют выявить антитела к HBsAg двух основных фракций: IgM и IgG. С помощью обычного анализа крови определить фракцию Anti-HBs нельзя.

Антитела к вирусу Гепатита В

HBs IgM – иммуноглобулины, которые появляются непосредственно после заражения. Их выявляют спустя 5 суток после проникновения инфекции. Такие Anti HBs свидетельствуют о том, что организм распознал чужеродные микроорганизмы. Определения IgM недостаточно для подтверждения диагноза. У некоторых пациентов иммуноглобулины отсутствуют несмотря на то, что заражение произошло.
HBs IgG – это разновидность Anti HBs, чья функция заключается в формировании продолжительного иммунитета. Их секреция протекает медленнее, но сохраняется дольше, чем IgM. Рост концентрации отмечается спустя 2-3 недели с момента поражения вирусом печени.

Для точной постановки диагноза недостаточно обнаружить поверхностные Anti HBs. Важный диагностический критерий – наличие антител к ядерным антигенам – Anti HBc. Они формируются при контакте с ДНК-содержащим участком вируса. Для такого исследования обычно берется образец пораженного участка печени путем пункционной биопсии.

Показания к анализу Anti-HbsAg

Анализ на определение антител Anti-HBs назначается при плановых осмотрах либо при возникновении подозрений на заражение гепатитом В. Некоторые группы граждан должны проходить обследования регулярно, так как входят в группу риска.

В группу входят:

Медицинские сотрудники.
Работники ЖКХ.
Беременные женщины.
Пациенты, перенесшие гепатит А либо иную болезнь печени.
Постоянные доноры крови.

Сдать анализ крови нужно лицам, которые предположительно либо достоверно контактировали с зараженными. Процедура назначается при подготовке к хирургическим операциям. В срочном порядке наличие Anti-HBs проверяется у лиц, у которых проявляются симптомы поражения печени.

Такая симптоматика позволяет предположить воспалительный процесс, протекающий в печени. Выявление иммуноглобулинов к гепатиту B позволит подтвердить диагноз и назначить соответствующее лечение.

Какие бывают анализы на антитела?

Есть несколько вариантов, позволяющих выявить антитела к поверхностному антигену вируса гепатита B.

К ним относятся:

Радиоиммунный анализ.
Иммуноферментный анализ.
Флуоресцентное исследование крови.
Иммуноэлектронная микроскопия.

Недостаток этих методов в том, что они позволяют выявить Anti-HBs спустя 20-30 суток с момента заражения. В этот период обычно развивается острая фаза заболевания, которая способна нанести существенный урон печени и спровоцировать серьезные осложнения.

При первых симптомах гепатита используется экспресс-тест. У пациента забирают образец капиллярной крови из пальца и наносят ее на тест-полоску. Реакция индикаторов указывает на положительный либо отрицательный результат. При положительном требуется серологический анализ.

Расшифровка результатов

Прежде всего исследование направлено на выявление антител в составе образца. Этот критерий оценки указывает на наличие болезни, либо его отсутствие. Результат не может достоверно указывать на форму, стадию поражения, интенсивность протекающего патологического процесса.

Нормой считаются значения, при которых содержание Anti HBs менее 0.05 МЕ/мл. В таких случаях результат исследования признается отрицательным. Если количество антител превышают норму, результат считается положительным.

Это результат, при котором концентрация anti-HBsAg не превышает норму. Обычно это свидетельствует о том, что пациент не заражен и риск развития гепатита минимален.

Но отрицательный результат может быть ложным. Это происходит на ранних стадиях, когда антигены не успели оказать воздействие на иммунную систему и в крови не содержится иммуноглобулины в концентрациях, достаточных для выявления в анализах. Ложный результат возможен при приеме определенных медикаментов либо недавней иммунизации.

При обнаружении антител в концентрациях, превышающих 0.05 МЕ/мл результат анализа на Anti HBs считается положительным. Он указывает на содержание в крови иммуноглобулинов, количество которых превышает норму, что происходит при заражении и активном развитии воспаления печени.

Положительный результат тоже может быть ложным. Это случается после вакцинации от гепатита В, при которой в организм вводят безвредные или мертвые антигены, стимулируя выработку иммуноглобулинов.

Anti HBs – это антитела, которые формируются иммунными клетками при появлении в организме вируса гепатита В. Обнаружение таких частиц – важный диагностический критерий, способный указать на заражение, оценить эффективность лечения либо вакцинации. Анализы на Anti HBs выполняются разными способами. Диагностическую процедуру нужно периодически проходить для профилактики, чтобы исключить риск скрытого носительства.

Гепатит и HBsAg

Итак, антиген HBsAg – один из компонентов оболочки вируса гепатита В (HBV). В контексте лабораторных исследований он является маркёром (индикатором) вируса.

Если говорить о составе капсида (внешняя оболочка вируса) гепатита В подробнее, то это сложная комбинация белков, гликопротеинов, липопротеидов и липидов клеточного происхождения. HBsAg в данном случае отвечает за процесс адсорбции вируса клеткой, то есть обеспечивает поглощение HBV гепатоцитами – клетками печени. Как и любой другой вирус, после внедрения в благоприятную среду, он начинает реплицировать (продуцировать) новые ДНК и протеины, необходимые для дальнейшего размножения (копирования) вируса. Фрагменты вируса, в нашем случае – HbsAg, поступают в кровоток, по которому распространяются дальше.

Возбудитель гепатита В относится к гепаднавирусам ( Hepadnaviridae ), само название которых указывает на их отношение к печени ( hepa ) и к ДНК ( DNA ). Таким образом, HBV – это гепатотропный вирус, при этом единственный среди всех вирусов гепатита, содержащий ДНК. Его активность (контагиозность и вирулентность) зависит от многих факторов:

возраста (например, до 1 года – ≈90%, до 5 лет – ≈20–50%, старше 13 лет – ≈5%);
индивидуальной восприимчивости;
штамма вируса;
инфицирующей дозы;
гигиенических условий жизни и труда;
эпидемиологической обстановки.

Но в целом контагиозность вируса гепатита B невысокая, ниже средней, если только полностью не пренебрегать всеми правилами безопасной половой жизни и гигиены.

Но как же передается вирус гепатита B? Процесс инфицирования происходит посредством крови и биологических жидкостей следующими путями:

Парентеральным , то есть при попадании напрямую в кровь или слизистую оболочку, минуя защитные барьеры организма, такие как кожный покров или желудочно-кишечный тракт. Примерами такого инфицирования может служить нестерильный шприц или любой хирургический инструмент.
Вертикальным – трансплацентарным, то есть внутриутробно от матери к ребенку, во время родов, после них.
Половым (во всех его формах).
Бытовым , то есть через предметы личной гигиены (бритвы, расчески, зубные щетки), при нанесении татуировок, пирсинге и др.

По окончании инкубационного периода наступает так называемая продромальная фаза заболевания, предшествующая острому периоду и предвещающая его. Тогда проявляются первые признаки болезни в виде общего недомогания, слабости, усталости, лихорадки с температурой на грани 37°C, понижения аппетита, тошноты, нарушений стула, суставно-мышечных болей, чувства сдавленности и тяжести в правом подреберье, раздражительности и апатии, кожных высыпаний в области суставов и зуда. Здесь следует отметить, что все эти симптомы могут быть выражены в разной степени у различных людей, вовсе отсутствовать или оставаться незамеченными. Продромальный, или преджелтушный, период может длиться от 1 до 30 дней. О его окончании свидетельствуют увеличенная печень и селезенка (30–50% случаев), повышенный уробилиноген в моче, обесцвечивание кала, а в сыворотки крови можно обнаружить рост концентраций АлАт и АсАт, пониженное содержание лейкоцитов, хотя в целом лейкоцитарная формула в норме.

Желтушность кожного покрова и иктеричность склер (желтая пигментация белковой оболочки глаз) знаменуют вступление в острую фазу , или в период разгара гепатита B. Повышение содержания общего и прямого билирубина в сыворотке крови нарастает первую неделю-две желтушного периода заболевания, достигая своего максимума, после чего происходит стагнация и постепенный спад в пигментации кожи вплоть до полного исчезновения желтой окраски, на что может уйти до 180 дней и даже более.

В пиковых точках болезни в большинстве случаев фиксируют брадикардию, пониженное артериальное давление, ослабление сердечных тонов. Кроме того, если гепатит протекает в тяжелой форме, обнаруживаются:

угнетение центральной нервной системы;
выраженные нарушения в работе ЖКТ;
склонность к кровотечениям в слизистых оболочках (сильно понижен протромбиновый индекс);
концентрация АлАт выше АсАт;
пониженная сулемовая проба, реакция СОЭ – 2–4 мм/час, лейкопения;
лимфоцитоз.

После острого периода (не путать с тяжелой формой!) болезнь развивается по одному из следующих сценариев (см. рис . 1 и 2):

наступает период реконвалесценции (выздоровления) , с постепенным снижением (исчезновением) признаков гепатита B на клиническом, биохимическом и морфологическом уровнях;
присоединяется суперинфекция в виде гепатита D и/или заболевание переходит в фульминантную форму, в так называемый молниеносный тяжелый гепатит (менее 1% случаев);
болезнь переходит в активную хроническую форму :
- a. выздоровление;
- b. цирроз печени (20%), карцинома (1%);
болезнь переходит в состояние устойчивой ремиссии ( стабильная хроническая форма ):
- a. излечение;
- b. внепеченочные патологии.

Рис. 1. Прогноз развития гепатита B

С точки зрения нагрузки на организм, врачи определяют три основных формы протекания острого гепатита B: легкая, средняя и тяжелая. С позиций выраженности симптомов заболевания, выделяют его желтушную (типичную), безжелтушную и субклиническую (атипичные) формы. В типичном варианте болезнь протекает в точности, как описано выше, однако это только 35% от всех случаев. Примерно 65% приходится на атипичные формы, когда не происходит пигментации кожных покровов и слизистой, а другие симптомы выражены слабо (безжелтушный вариант), или когда любые клинические проявления отсутствуют вовсе (субклиническая форма).

Рис. 2. Исход болезней при инфецировании HBV

Диагностические критерии бессимптомного носительства следующие:

антиген HBsAg определяется в крови после 180 дней;
маркёр HBeAg ( см. таблицу ) в сыворотке не обнаруживается;
анти- HBe ( см. таблицу ) – присутствует;
уровень HBV ДНК в сыворотке крови менее 105 копий/мл;
концентрации АлАт/АсАт показывают норму при повторных анализах;
при биопсии печени гистологический индекс активности (МГА) воспалительно-некротического процесса в печени обычно ниже 4.

Как можно увидеть, серологический маркер HBsAg является первым, основным, самым надежным, но далеко не единственным показателем инфекции гепатита B, кроме него требуют определения в сыворотке крови следующие антигены, антитела и молекулы ДНК вируса:

HBeAg

указывает на репликацию HBV в гепатоцитах, высокую активность вируса в крови и высокий риск перинатальной передачи вируса

HBcAg

маркирует репликацию HBV в гепатоцитах, обнаруживается только при морфологическом исследовании биоптатов печени и на аутопсии, в крови в свободном виде не выявляется

анти-НВс (total) (НВсАb)

суммарные антитела к HBcAg, выявляются через 7–14 дней после HBsAg

важный диагностический маркер, особенно при отрицательных результатах индикации HBsAg, используется для ретроспективной диагностики гепатита B и при неверифицированных гепатитах, определяют НВсАg без разделения на классы

IgM анти-НВс (НВсАb IgM)

антитела класса М к ядерному антигену , присутствуют в крови от 60 до 540 дней

один из наиболее ранних сывороточных маркеров гепатита В, наличие его в крови указывает на острую инфекцию (фазу болезни), при хроническом ГВ маркирует репликацию HBV и активность процесса в печени

анти-НВе (HBeAb)

может указывать на начало стадии реконвалесценции (исключение – мутантная форма HBV)

анти-HBs (HBsАb)

защитные антитела к поверхностному антигену HBV

указывают на перенесенную инфекцию или наличие поствакцинальных антител (их защитный титр от HBV-инфекции >10 МЕ/л); обнаружение же антител в первые недели гепатита В прогнозирует развитие гипериммунного варианта фульминантного гепатита В

HBV-DNA

ДНК вируса ГВ

маркер наличия и репликации HBV

Вышеуказанные маркёры появляются и исчезают в определенной последовательности в соответствии с этапами прохождения заболевания. Некоторые из них, такие как IgG анти-НВс, остаются на всю жизнь. Полную и достоверную диагностическую картину дает только весь набор маркёров. Кроме того, для острого, хронического, фульминантного и смешанного гепатитов существуют свои серологические профили (об этом ниже).

Нельзя не затронуть такое редкое, но чрезвычайно опасное явление, как параллельное инфицирование гепатитом D (HDV), оно может возникнуть в двух вариантах:

HDV – это своеобразный паразит вируса гепатита B, его сателлит, он не может реплицироваться в отсутствие HBV , поскольку синтез белков его внешней оболочки невозможен без наличия в гепатоцитах вируса гепатита B. Таким образом, переболеть гепатитом B можно и без дельта-инфекции, а вот наоборот не получится. Присоединение HDV вызывает в 30% случаев молниеносный (фульминантный) гепатит с развитием острой печеночной недостаточности и печеночной энцефалопатии, которые нарастают стремительно, в 60% случаев приводя к летальному исходу. Однако общий исход гепатита B в фульминантную форму находится в пределах 0,4–1% случаев. Поэтому при положительном результате на антиген HBsAg в обязательном порядке следует проводить диагностику дельта-инфекции. Для этого используются серологические маркеры:

IgM анти-HDV

антитела класса М к вирусу гепатита D

маркируют репликацию HDV в организме

IgG анти-HDV

антитела класса G к вирусу гепатита D

свидетельствуют о возможной инфицированности HDV или перенесенной инфекции

HDAg

антиген вируса гепатита D

маркер наличия HDV в организме

HDV-RNA

РНК вируса гепатита D

маркер наличия и репликации HDV

Анализ может быть сдан любым желающим, но есть определенные категории лиц, у которых подобное тестирование проводится обязательно:

сотрудники медицинских учреждений, в особенности те, которые работают с кровью пациентов: медицинские сестры манипуляционных кабинетов, гинекологи, хирурги, фельдшеры, стоматологи;
лица с повышенным уровнем ферментов АсАт и АлАт;
больные, которым предстоит хирургическое вмешательство;
потенциальные доноры крови;
лица, являющиеся носителями вируса гепатита B, больные с хронической формой данного заболевания;
беременные женщины.

Кроме того, исследование рекомендуется делать при наличии таких симптомов, как тошнота, рвота, потеря аппетита, изменение цвета мочи и кала, желтушность – то есть всех тех признаков гепатита B, которые были описаны в начале статьи. Но в целом каждый человек, если подходит к своему здоровью ответственно, должен делать серологическое исследование на HBsAg один раз в год.

Сегодня существует уже три поколения методов серологической диагностики HBsAg , и самые информативные и чувствительные из них, способные выявлять концентрации до 0,05 нг/мл, постепенно вытеснили своих предшественников.

Реакция преципитации в геле, РПГ (Gel precipitation test)

Встречный иммуноэлектрофорез, ВИЭФ (Counter immunoelectrophoresis),

Реакция связывания комплемента, РСК (Complement fixation test)

Реакция латекс-агглютинации, РЛА (Latex agglutination test)

Метод флюоресцирующих антител, МФА (Immunofluorescence)

Иммуноэлектронная микроскопия, ИЭМ (Immune electron microscopy)

III

Реакция обратной пассивной гемагглютинации, РНГА (Indirect hemagglutination test)

Радиоиммунный анализ, РИА (Radioimmunoassay)

Иммуноферментный анализ, ИФА (Enzyme immunoassay)

Почему ИФА и РИА более информативны в сравнении с предшественниками? Дело в том, что они способны выявлять IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определенные выводы о динамике инфекционного процесса или о состоянии реконвалесценции.

Качественные и количественные варианты ДНК-зондирования методом ПЦР имеют 100% точность и могут использоваться на самых ранних сроках после заражения. С помощью ПЦР выявляют персистирующие вирусы, которые находятся в клетке, продолжающей выполнять свои функции, а потому они с трудом обнаруживаются или не обнаруживаются другими методами.

Подобную диагностику можно проводить уже через 1–3 недели с момента предполагаемого заражения. Для такого тестирования используется венозная кровь (5–10 мл), которая берется натощак. Для получения ответа требуется один день.

НВsAg -качественный тест указывает лишь на наличие либо отсутствие заболевания. Очевидно, что отрицательный результат означает отсутствие заболевания, а положительный – наличие патологии. Последнее также может свидетельствовать о ранее перенесенном заболевании или носительстве. Любые сомнения подобного рода снимаются проведением количественного исследования на определение HBV-DNA методом ПЦР. Таблицы с трактовками маркеров острого и хронического гепатита B мы приводим ниже:

Основные ссылки

Вы здесь

Чтобы просмотреть текст книги нажмите на нужную главу в оглавлении

Вирус гепатита B (HBV) принадлежит к новому семейству ДНК вирусов Hepadnaviridae. К его особенностям относятся поразительный гепатотропизм и уникальный способ репликации с использованием механизма обратной транскрипции. Собранный вирион или частица Дейна состоит из кольцевой молекулы ДНК, защищенной ядерным капсидом/коровым антигеном (HBcAg). Внешняя оболочка вируса образована поверхностным антигеном (HBsAg). HBsAg также обнаруживается в сыворотке в виде неинфекционных сферических частиц или нитей. Малые компоненты HBV- нуклеакапсиды, HBe антиген (HBeAg) также можно обнаружить в крови во время репликативной фазы вируса.

HBV является широко распространенным по всему миру вирусом. В Москве, как и в целом по России, в последние годы отмечается рост заболеваемости парентеральными вирусными гепатитами [158].

Основные пути заражения: горизонтальный - половое и парентеральное заражение, и вертикальный - перинатальная передача от инфицированной матери плоду. Клинические последствия от заражения гепатитом B варьируют от полностью неразличимых (70% случаев) до острых гепатитов. Большинство пациентов полностью выздоравливают в течение 6 месяцев с начала заболевания. У небольшой доли инфицированного населения ( 1:1000) IgM антител на HBcAg появляются во время острой фазы HBV инфекции, совпадая с появлением IgG и ростом аминотрансфераз. Так как уровень анти-HBc IgM быстро уменьшается, высокий титр этих антител является свидетельством острой фазы гепатита B. Поэтому тестирование на анти-HBc IgM является полезным инструментом при диагностике острой HBV инфекции, позволяющим различать острые и хронические гепатиты B.

Во время активной фазы болезни в организме появляются как IgM, так и IgG антитела к вирусному коровому антигену. В то время как анти-HBc IgM быстро исчезает, анти-HBc IgG сохраняются годы. Поэтому анти-HBc IgG являются удобным индикатором для подтверждения предшествующих контактов с HBV. Более того, анти-HBc IgG является единственным маркером, который можно обнаружить во время так называемого серологического окна острого гепатита B, периода, когда анти-HBs антитела, указывающие на элиминацию вируса, еще не обнаруживаются, а специфические IgM уже исчезли (Рис. 11).

Рисунок 11. Относительная концентрации маркеров гепатита B при острой инфекции в зависимости от времени инфицирования

Антитела к HBsAg (анти-HBs) являются основными нейтрализующими HBV антителами, которые защищают против повторного инфицирования и сохраняются в течение всей жизни. Поэтому обнаружение анти-HBs служит индикатором выздоровления от гепатита B или успеха вакцинации с использованием HBsAg частиц. Концентрация антител ? 10 IU/L указывает на иммунитет к HBV.

В 1999-2001 гг. ВОЗ провела сравнительные испытания быстрых простых тестов 10 производителей (Determine HBsAg, DoubleCheck HBs Antigen, ImmunoComb II HBs Ag 90’, Serodia-HBs.PA, GLD Rapid HBsAg, Hepacard, AQ One HBsAg Test, Uni-Cold HBsAg, Genedia HBsAg, Hep B Stark-Pack) для обнаружения поверхностного антигена вирусного гепатита B [160]. При этом оценивалась не только чувствительность и специфичность, но и результаты, полученные на сероконверсионных и низкотитражных панелях. В качестве образцов сравнения, референс-тестов, выступали ELISA тест-системы MonolisaAgHBs Plus и Hepanostika HBsAg. Результаты испытаний представлены на рисунке. Столбцы диаграммы характеризуют количество выявленных положительных образцов низкотитражной и сероконверсионных панелей. Как видно из диаграммы (Рис.12), тесты ИммуноКомб продемонстрировали результаты, близкие или превосходящие результаты ИФА референс-тестов на сероконверсионных и низкотитражных панелях.

Рисунок 12. Сравнительная характеристика тестов при диагностике образцов сероконверсионных и низкотитражных панелей

Количество образцов низкотитражной панели, идентифицированных тестом ИммуноКомб как содержащие HBsAg, совпадает с количеством образцов, выявленных референс-тестом Hepanostika и на один образец меньше, чем референс-тестом Monolisa. Количество образцов сероконверсионной панели, диагностированых тест-системами ИммуноКомб, превышает показатель референс-тестов. Все остальные тесты отставали от референс-тестов в определении положительных образцов этих панелей. Как видно из данных, представленных на рисунке 13 ИммуноКомб HBsAg 90’ диагностирует HBsAg в среднем на 1 сутки раньше, чем референс-тест Monolisa Ag HBs Plus. Все остальные тесты обнаруживают HBsAg, отставая от референс-теста, по крайней мере, на 2 суток.

Рисунок 13. Образцы сероконверсионной панели, определяемые каждым из тестов относительно референс-теста Monolisa Ag HBs Plus (0 соответсует первому образцу, определяемому референс-тестом)

Эффективность быстрых простых тестов по выявлению поверхностного антигена вируса Гепатита В не уступает аналогичным характеристикам ELISA тестов. ИммуноКомб диагностирует HBsAg на более ранних стадиях и в более низких концентрациях, чем другие участвующие в испытаниях тесты.

Данный диагностический препарат позволяет диагностировать антиген различных субтипов в концентрации 0,25 нг/мл и проводить индивидуальное и групповое тестирование.

В таблице 24 представлены результаты международных испытаний БПТ ИммуноКомб HBS AG 90' [13].

Таблица 24. Качество тестов ИммуноКомб HBS AG 90'