Что такое инфекционная активность вируса

Исследовали на модели культур клеток зависимость специфической инфекционной активности вируса бешенства промышленных (фиксированных) штаммов L. Pasteur и CVS от длительности и температуры хранения. Вирусную суспензию накапливали в клеточной культуре / С13 и замораживали при -20 и -80°С. Анализ специфической активности проводили через 1 неделю, 1, 2, 3, 6 и 12 месяцев хранения. Экспериментально установили, что для исследованных штаммов более эффективной для длительного хранения является температура -80°С.

Ключевые слова: вирус бешенства, вируссодержащая суспензия, антирабический иммуноглобулин, антирабическая вакцина, долгосрочное хранение, низкие температуры

The dependence of specific infectious activity on the cell culture model of rabies virus industrial (fixed) strains L. Pasteur and CVS from the duration and storage temperature was investigated. Viral suspension was produced by cell culture / C13 and frozen at -20 and -80°C. Analysis of the specific activity was performed after 1 week, 1, 2, 3, 6 and 12 months of storage. It was experimentally discovered that the temperature -80°C is more effective for storage for the studied strains.

Keywords: rabies virus, virus-containing suspension, rabies immunoglobulin, rabies vaccine, long-term storage, low temperature

Введение

Бешенство является опасным нейроинфекционным заболеванием теплокровных животных (в том числе и человека), которое встречается более чем в 150 странах мира [7, 10]. Возбудителем данного заболевания является РНК-содержащий вирус рода Lyssavirus, семейства Rhabdoviridae, порядка Mononegavirales. Заражение бешенством главным образом происходит через укус, в ходе которого инфекция передаётся со слюной. Основной мишенью вируса бешенства является центральная нервная система (ЦНС). Вирус бешенства является единственным из царства Virae, который поражает всех теплокровных животных с летальностью 100 %. От укусов животных, больных бешенством, ежегодно в мире погибает более 55 000 человек. В связи с этим согласно оценке Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) бешенство входит в пятёрку болезней, которые наносят наибольший ущерб человечеству и мировой экономике. Единственным методом борьбы с данным заболеванием являются пред- и постэкспозиционная профилактика, в рамках которой используются антирабические иммуноглобулин (АИГ) и вакцина (в дальнейшем — антирабические препараты) [1, 7, 10, 11].

Для получения антирабических препаратов и контроля их качества используются аттенуированные (или фиксированные) штаммы вируса бешенства, которые получают в ходе воздействия на полевые изоляты мутагенов или других факторов, позволяющих менять свойства вирионов. В отличие от полевых изолятов штаммы фиксированного вируса бешенства могут быть полностью или частично лишены способности к заражению целого организма животного или человека, но сохраняют возможность заражать ткани и клетки при непосредственном контакте. Наиболее распространёнными в производстве антирабических препаратов являются фиксированные штаммы вируса бешенства L. Pasteur и CVS, выделенные более 100 лет назад из полевых изолятов, ослабленные путём пассирования через мозг кроликов и адаптированные к мозгу мышей и клеточным линиям. С 1996 года ВОЗ рекомендует при производстве антирабических препаратов полностью отказаться от использования вируса бешенства, полученного пассированием через мозговую ткань животных, и использовать для накопления вирусной суспензии клеточные культуры [8, 11].

Цель исследования

Цель исследования — экспериментально определить эффективный температурный режим для долгосрочного хранения суспензии вируса бешенства штаммов L. Pasteur и CVS в условиях производства.

Материалы и методы

В качестве субстрата для накопления суспензии вируса бешенства использовали перевиваемую клеточную линию ВНК-21 / C13 (ATCC CCL-10), которая широко применяется для производства культуральной вакцины против бешенства [5, 6, 8, 12]. Клеточную линию накапливали в пристеночном монослое 1 сутки в стерильных пластиковых флаконах (SPL, Германия). В ходе исследования использовали фиксированные штаммы вируса бешенства L. Pasteur (адаптированный к клеточной линии Vero, № 2061 / Vero, 15 пассаж) и CVS (challenge virus standard), рекомендованные ВОЗ для производства АИГ и антирабических вакцин для животных и человека [8, 12]. Штамм L. Pasteur был адаптирован к клеточной линии ВНК-21 / C13 [6] и предоставлен Институтом Пастера (Нови-Сад, Сербия) вместе с технологическим регламентом производства антирабического антигена.

Вирусную суспензию культивировали в течении 4-х суток с момента заражения в поддерживающей среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) c 0, 2 % бычьего альбумина (PAA, Австрия) в СО₂-инкубаторе (Binder, Германия) при 33ºС и 5 % СО₂. Сбор вирусной суспензии проводили на 4 сутки после заражения. Полученную вирусную суспензию центрифугировали при 3000 об/мин 15 минут в рефрижераторной центрифуге (MPW, Польша) при 4ºС для удаления клеточного детрита. Супернатант собирали, добавляли к нему сахарозу с конечной концентрацией 5 %, расфасовывали в пластиковые криопробирки (PAA, Австрия) и замораживали при -20 и -80ºС в морозильных камерах (National Lab, Германия). Контроль температуры, при которой хранили криопробирки, производили с помощью спиртовых термометров [5, 6, 8, 12].

Для определения специфической инфекционной активности вирусной суспензии использовали метод титрации вируса в культуре клеток линии ВНК-21 / C13. Суспензию вируса бешенства размораживали через 1 неделю, 1 , 2, 3, 6 и 12 месяцев хрнения при низких температурах (срок наблюдения) и титровали с коэффициентом разведения 5 на культуре клеток ВНК-21 / C13 в 96-луночных планшетах (SPL, Германия) в 5-ти повторах (n = 5). Культивировали клетки 48 часов в СО₂-инкубаторе при 37ºС и 5 % СО₂, затем фиксировали монослой клеточной лини охлаждённым при -20ºС ацетоном. Так как промышленные штаммы вируса бешенства не оказывают на клеточные линии цитопатогенного действия, то для определения инфекционной активности вирусной суспензии использовали метод непрямой флуоресценции. Для этого применяли специфические моноклональные антитела к вирусу бешенства, меченные изотиоцинатом флуоресцина (FITC) (Fujirebio, U.S.A.), которыми производили окрашивание клеточного монослоя. Учёт результатов производили с помощью медицинского микроскопа (МИКМЕД-6, ЛОМО, Россия) (увеличение 100×) с люминисцентной насадкой. При микроскопировании учитывали яркое специфическое свечение зелёного цвета, которое свидетельствует о наличии вируса бешенства в клетках, и лунки с таким свечением отмечали как положительные (рисунок 1) [4, 5, 9, 12].

Рисунок 1 — Клетки лини ВНК-21 / С13, инфицированные вирусом бешенства штамма L. Pasteur. Окраска FITC-меченными моноклональными антителами, увеличение 100×

Расчёт титра вируса проводили с помощью формулы Спирмена-Карбера и выражали в десятичном логарифме 50 %-ой фокусформирующей инфицирующей дозы (lg FFD₅₀):

, где

x₀ — lg наибольшего разведения, в котором во всех лунках отмечается положительное свечение;

d — lg фактора разведения;

n_i — общее количество лунок, приходящихся на каждое разведение титрации вирусной суспензии;

r_i — количество положительных лунок в каждом разведении титрации вирусной суспензии [3, 9, 12].

Статистический анализ данных осуществляли с помощью стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel-2010 и Past. Вид распределения определяли с помощью W-критерия Шапиро-Уилка, достоверность различий между группами данных рассчитывали с использованием параметрического t-критерия Стьюдента (для групп с нормальным распределением данных). Расхождение считали статистически значимым при p ≤ 0, 05.

Результаты и обсуждение

В ходе проведенных исследований была проанализирована сохранность специфической инфекционной активности суспензии вируса бешенства штаммов L. Pasteur и CVS после хранения при температурах -20 и -80°С через 1 неделю, 1, 2, 3, 6 и 12 месяцев (срок наблюдения). В качестве контроля использовали данные по хранению вируса на протяжении 1-ой недели.

При анализе данных по хранению вирусной суспензии промышленного штамма L. Pasteur при -20ºС были получены следующие результаты. Активность вирусной суспензии через 1 неделю после замораживания при температуре -20°С составила 8,11±0,29 lg FFD₅₀ (n = 5) (рисунок 2). При сравнении данных по специфической активности вируса после 1-ого месяца хранения различия не были статистически значимыми (р ≥ 0, 05). После 2-х месяцев хранения при этой температуре активность вируса данного штамма начала снижаться (р ≤ 0, 05 ). Аналогичные данные были получены при сравнении активности вирусной суспензии после хранения на протяжении 3-х, 6-ти и 12-ти месяцев при температуре -20°С. Различия между данными по специфической активности после указанных сроков хранения были статистически значимы (р ≤ 0, 05). Через 12 месяцев хранения при температуре -20°С активность вируса штамма L. Pasteur составила 4, 75 ± 0, 19 lg FFD₅₀, что на 3, 36 lg FFD₅₀ меньше, чем данные контроля.

Рисунок 2 — Динамика изменения инфекционной активности вируса бешенства штамма L. Pasteur в ходе хранения при температурах -20°С и -80°С, * — статистически значимые различия между контролем и последующими сроками хранения; # — статистически значимые различия между каждым из сроков; $ — статистически значимые различия между показателями активности одного срока хранения, но при разных температурах

Специфическая инфекционная активность вирусной суспензии штамма L. Pasteur через 1 неделю после замораживания при температуре -80°С составила 8, 18 ± 0, 19 lg FFD₅₀ (n = 5) и не изменялась в течение 2-х месяцев (р ≥ 0, 05). Между 2-м и 3-м месяцами хранения при температуре -80°С инфекционная активность вируса начала достоверно снижаться (р ≤ 0, 05 ), как и на протяжении последующего хранения. Через 12 месяцев хранения при температуре -80°С активность вируса штамма L. Pasteur составила 5, 66 ± 0, 29 lg FFD₅₀, что на 2, 52 lg FFD₅₀ меньше, чем данные контроля. Со 2-ого по 12-й месяцы хранения при -80°С показатели инфекционной активности были достоверно выше (р ≤ 0, 05 ), по сравнению с образцами, хранившимися при -20°С.

Активность вирусной суспензии промышленного штамма CVS через 1 неделю после хранения при температуре -20°С составила 6, 78 ± 0, 19 lg FFD₅₀ (n = 5) (рисунок 3) и не изменялась до 2-х месяцев хранения (р ≥ 0, 05). Между 2-м и 3-м месяцами хранения при данной температуре произошло достоверное снижение (р ≤ 0, 05 ), активности, как и на протяжении последующего хранения. Через 12 месяцев хранения при температуре -20°С активность штамма CVS составила 4, 96 ± 0, 29 lg FFD₅₀, что на 1, 82 lg FFD₅₀ меньше, чем специфическая активность вируса при хранении в данном температурном режиме в течение недели.

Рисунок 3 — Динамика изменения инфекционной активности вируса бешенства штамма CVS в ходе хранения при температурах -20°С и -80°С, * — статистически значимые различия между контролем и последующими сроками хранения; # — статистически значимые различия между каждым из сроков; $ — статистически значимые различия между показателями активности одного срока хранения, но при разных температурах

Активность вирусной суспензии штамма CVS через 1 неделю после замораживания при температуре -80°С составила 6, 78 ± 0, 47 lg FFD₅₀ (n = 5) и не изменялась в течение 6-ти месяцев (р ≥ 0, 05). Достоверное снижение (р ≤ 0, 05) показателя активности вируса произошло между 6-м и 12-м месяцами хранения при данной температуре. После 12 месяцев хранения при температуре -80°С активность вирусной суспензии снизилась на 0,28 lg FFD₅₀ и составила 6, 5 ± 0, 19 lg FFD₅₀ по сравнению с данными контроля. С 3-ого по 12-й месяцы хранения при -80°С показатели инфекционной активности данного штамма были достоверно выше (р ≤ 0, 05 ), по сравнению с образцами, хранившимися при -20°С.

В результате проведенных исследований более низкие результаты сохранности обоих штаммов вируса были получены при хранении вирусной суспензии при температуре -20°С. Это может быть связано с тем, что эвтектическая температура солевых растворов, входящих в состав среды консервирования и ультраструктурных компонентов вирионов находится ниже -20°С, и вирионы подвергаются действию повреждающих факторов, связанных с кристаллизацией жидкой фазы, изменением рН и гиперконцентрацией электролитов [2].

Результаты исследования показали, что фиксированный штамм CVS более устойчив к хранению при низких температурах, чем штамм L. Pasteur. Предположительно, различия криоустойчивости изучавшихся промышленных штаммов вируса бешенства обусловлены особенностями строения их капсидов. Этот вопрос требует отдельного изучения.

Полученные результаты по сохранности вируса бешенства промышленных штаммов в суспензии не соответствуют требованиям производства, так как необходимо сохранение спицефической ативности вируса на протяжении более длительных сроков. Поэтому следует провести исследования по применению различных режимов замораживания вирусной суспензии и использованию различных криозащитных сред. Полученные данные, вероятно, смогут позволить хранить промышленные штаммы вируса бешенства при низких температурах более длительное время без потери их специфической активности.

Вирусы — неклеточная форма жизни, которая может воспроизводиться только внутри живых клеток (внутриклеточный паразит). Они вызывают острые и хронические вирусные заболевания. Некоторые из вирусов способны встраивать свою ДНК в хромосомы клетки-хозяина, тем самым вызывая мутации.

Виды хронических вирусных заболеваний

Вирусы способны поражать различные органы и системы человеческого тела. Острые и хронические вирусные заболевания делят на:

• кишечные (ротавирусы);
• респираторные (грипп);
• поражающие ЦНС (энцефалит);
• приводящие к болезням внутренних органов (гепатиты);
• вызывающие болезни кожи и слизистых оболочек (ветряная оспа);
• поражающие сосудистую систему (геморрагические лихорадки);
• нарушающих работу иммунной системы (ВИЧ).

Хроническими вирусными заболеваниями называют патологии, которые часто рецидивируют, вызывая тяжелые поражения центральной нервной системы и внутренних органов, а также подавляют защитные функции иммунной системы.

В зависимости от генетического материала вирусы бывают:

• ДНК-содержащими, состоящими из 1 или 2 спиралей ДНК (аденовирус, герпесвирус, папилломавирус, гепаднавирус);
• РНК-содержащими, которые включают в себя только РНК (ортомиксовирус, флавивирус, ретровирус, полиовирус).

К распространенным острым и хроническим вирусным заболеваниям относятся:

• герпетическая инфекция (поражает все органы и системы, вызывает генитальный герпес, ветряную оспу, герпес губ и т. д.);
• гепатиты (гепатит B, вызывающий цирроз и рак печени);
• ВИЧ (приводит к развитию СПИДа);
• клещевой энцефалит (поражает центральную и периферическую нервную систему);
• краснуха (сопровождается воспалением дыхательных путей, характерной сыпью на коже и интоксикацией);
• ВПЧ (хроническое вирусное заболевание вызывает кожные наросты и может индуцировать онкологические процессы);
• паротит (поражение слюнных и околоушных желез);
• корь (поражает слизистую рта и дыхательных путей, сопровождается сыпью на коже и слизистой);
• инфекционный мононуклеоз (проявляется лимфаденопатией, тонзиллитом, гепатоспленомегалией, лихорадкой);
• грипп (поражение верхних и нижних дыхательных путей с выраженной интоксикацией);
• аденовирусная инфекция (ОРВИ) и т. д.

Стадии развития вирусных заболеваний (острых и хронических)

Жизненный цикл вируса включает в себя такие этапы:

1. Адсорбция на клеточной мембране и проникновение в клетку.
2. Экспрессия и репликация вирусного генома.
3. Сборка вирусов и выход из клетки.

Особенности лечения хронических вирусных заболеваний

Сложность терапии заключается в том, что вирусы являются внутриклеточными паразитами.

Лечение хронических вирусных заболеваний включает в себя:

• этиотропную терапию. Она направлена на уничтожение возбудителей хронических вирусных заболеваний, находящихся внутри клеток, и включает в себя применение препаратов, нарушающих репликацию вируса.
• иммуномодулирующую терапию. Призвана усилить иммунитет организма для борьбы с вирусом.

Хронические вирусные заболевания и иммунитет

Когда вирус проникает внутрь клетки, то функции местного иммунитета выполняют интерфероны и другие цитокины. Вирусные белки в комплексе с антигенами HLA становятся мишенями для несущих соответствующие рецепторы Т-лимфоцитов.

К началу второй недели после заражения активируется гуморальный и клеточный иммунитет. Вырабатываются антитела к вирусу и накапливаются специфичные к нему лимфоциты. Интенсивность иммунного ответа нарастает в течение второй-третьей недели. Выработка антител и накопление лимфоцитов продолжаются еще в течение нескольких месяцев.

В ответ на инфекцию клетки тела также вырабатывают интерфероны α или β. Они подавляют репродукцию вирусов, оказывая воздействие на транскрипцию вирусных геномов.

Рассмотрены подходы к профилактике респираторных вирусных инфекций, включая применение средств инактивации внеклеточного вируса на поверхностях и в объеме помещений, что позволяет предотвратить инфицирование людей в местах их скоплений.

Approaches to prevention of respiratory viral infections were considered, including application of inactivation drugs for extracellular virus on the surfaces and inside the facilities, which allows to prevent contamination in gathering of people.

Наиболее эффективным средством профилактики гриппа является вакцинация. Однако вследствие постоянной смены антигенных свойств возбудителя требуется постоянный мониторинг и разработка новых вакцинных штаммов, соответствующих циркулирующим в человеческой популяции в каждый конкретный эпидемический сезон.

Наряду с вакцинацией для предотвращения и лечения заболевания применяются химиопрофилактика и химиотерапия гриппа. В настоящее время для этих целей доступен широкий спектр патогенетических, иммуномодулирующих, общеукрепляющих препаратов наряду со средствами специфической противогриппозной терапии. Этиотропные препараты для лечения гриппа представлены соединениями двух групп, отличающимся по механизму действия и вирусным мишеням. Ремантадин и амантадин блокируют белок М2 вируса гриппа, препятствуя тем самым процессу расщепления гемагглютинина и слияния мембран вируса и лизосомальной вакуоли [4]. Препараты второй группы ингибируют вирусную нейраминидазу, необходимую для почкования и распространения вирусных частиц. Сюда относятся занамивир (Реленца®), осельтамивир (Тамифлю®), перамивир (Рапиваб®) и ланинамивир (Инавир®) [5], последние два в России не зарегистрированы. Кроме того, в Японии, Корее и Китае используется препарат T-705 (Фавипиравир), являющийся нуклеозидным аналогом [6–8], направленный на вирусную полимеразу и обладающий, активностью не только против вируса гриппа, но и против широкого круга других вирусов [9].

В отношении группы производных адамантана можно отметить сравнительно высокую токсичность и узкий спектр действия (препараты активны против гриппа А, но не против гриппа В, не имеющего белка M2). Для ингибиторов нейраминидазы характерна высокая стоимость синтеза, что делает эти препараты менее доступными для широкого использования. Кроме того, к препаратам обеих групп вирус гриппа способен вырабатывать устойчивость [10, 11].

Однако для более надежного контроля заболеваемости наряду с вакцинопрофилактикой и химиотерапией важную роль играют средства инактивации внеклеточного вируса на поверхностях и в объеме помещений. Такие меры позволяют во многом предотвратить инфицирование людей в местах их скоплений, таких как общественные места, массовые мероприятия и т. п. Для обеззараживания поверхностей и объемов помещений используются ультрафиолетовые лампы различного спектрального диапазона и химические средства дезинфекции.

Преимуществом ультрафиолетового облучения является его комплексный механизм. Эффективность такого воздействия на патогены обусловлена как прямым воздействием излучения, так и реакционноспособными молекулами озона О3, генерируемыми при взаимодействии ультрафиолетовых квантов с кислородом воздуха. Следует, однако, отметить, что доза облучения падает пропорционально квадрату расстояния от источника и для инактивации вируса на поверхностях в помещениях потребуется время, также пропорциональное квадрату линейных размеров помещения. Кроме того, для эффективного обеззараживания поверхностей требуется прямая их экспозиция к облучению, что не всегда достижимо в помещениях сложного профиля и с установленным оборудованием и мебелью. В этом случае основной эффект дезинфекции достигается за счет диффузии молекул озона, имеющей меньшую эффективность.

В России в настоящее время для обеззараживания помещений из дезинфицирующих средств в форме аэрозоля применяют [12]:

• 37%-е растворы формальдегида;
• 20%-й раствор параформальдегида с добавлением 1% едкой щелочи;
• 24%-й раствор глутарового альдегида;
• 30%-й раствор алкамона;
• препарат надуксусной кислоты;
• 10%-й раствор перекиси водорода с добавлением 1% муравьиной кислоты.

Для дезинфекции воздуха и поверхностей помещений в присутствии животных в форме аэрозоля применяют молочную кислоту, йод, триэтиленгликоль и гипохлорит натрия. Следует указать на такие недостатки этих препаратов, как:

• высокая токсичность для человека;
• необходимость направленного распыления при обработке поверхностей;
• необходимость дополнительной очистки или нейтрализации после обработки деконтаминантом (например, 25% аммиак после обработки формальдегидом и глутаральдегидом, раствор железосинеродистого калия после обработки алкамоном и пр.);
• высокие нормы расхода препарата дезинфектанта (15–90 мл/м 3 или 100–200 мл/м 2 при обработке поверхностей).

Грипп представляет собой наиболее тяжелое и опасное заболевание из группы острых респираторных вирусных инфекций. Список химических дезинфицирующих агентов [14], активных в отношении вируса гриппа птиц H5N1, на 13 марта 2008 г. включает более 100 зарегистрированных коммерческих препаратов, содержащих химические соединения нескольких классов. Активные компоненты дезинфектантов могут быть подразделены на несколько типов по механизму действия.

К примеру, одним из основных средств деконтаминации против гриппа птиц за рубежом является препарат Виркон (Virkon®S) производства DupontAnimalHealthSolutions или KRKA, представляющий собой смесь соединений перекиси, поверхностно-активных веществ, органических кислот и неорганических буферных систем [13]. Главным компонентом состава является калия персульфат 50%. Препарат обладает антимикробной активностью в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий (кроме микобактерий туберкулеза), вирусов (включая ВИЧ, гепатит В, герпес, грипп, полиомиелит, ротавирус, энтеровирусы и др.), грибов рода Candida, дерматофитов. В отношении спор бактерий препарат не проявляет активности.

С целью оценки дезинфицирующих свойств персонального обеззараживателя воздуха нового типа (генератора диоксида хлора) как средства инактивации возбудителей воздушно-капельных вирусных инфекций было проведено исследование его вирулицидного действия в аэрозольной камере с распыленным вируссодержащим аэрозолем, содержащим вирус гриппа А. После активации средства (извлечения кассеты из герметичной алюминиевой упаковки) запускается медленное испарение активного компонента (диоксида хлора), который уничтожает болезнетворные вирусы и бактерии в окружающем воздухе.

Подготовка обеззараживателя воздуха для тестирования

Обеззараживатель воздуха индивидуальный (генератор диоксида хлора производства Global Product Planning Co., Ltd.) извлекали из защитного пакета, выдерживали в течение 1 часа в открытом состоянии и помещали в аэрозольную камеру в воздухонепроницаемый пакет. Момент открывания пакета считали нулевой временной точкой эксперимента.

Исследование защитных свойств обеззараживателя воздуха индивидуального (генератора диоксида хлора) 3,0 мл суспензии вируса (5 × 10 7 EID₅₀/мл) распыляли в течение 10 минут в камере объемом 0,4 м 3 с помощью вихревого пневматического генератора аэрозоля типа ВАГ-2, расположенного в центре камеры и обеспечивающего получение аэрозоля с расчетной концентрацией 3,8 × 10 4 EID₅₀/л с массовым медианным диаметром частиц 3,6 мкм. Для равномерного распределения аэрозоля в объеме камеры использовали постоянно работающий вентилятор. Система для отбора проб воздуха включала насос, измеритель скорости потока и микроциклон для улавливания частиц аэрозоля, содержащий 10 мл физиологического раствора.

Отбор проб воздуха в микроциклоны для определения концентрации вируса, находящегося в воздушной фазе объема камеры, проводили в течение 2 минут при скорости потока 7,2 л/мин, что приблизительно соответствует режиму дыхания человека. Забор материала проводили в периоды 1–3, 3–5 и 10–12 мин после начала экспозиции обеззараживателя воздуха индивидуального (генератора диоксида хлора).

В контрольной серии экспериментов те же манипуляции проводили в отсутствие изучаемого обеззараживателя воздуха индивидуального (генератора диоксида хлора).

Вирус

В работе использовали вирус гриппа A/California/07/09 (H1N1)pdm09. Вирус культивировали в течение 48 часов при 36 °С в аллантоисной полости 10–12-дневных куриных эмбрионов. В качестве исходного инфекционного материала использовалась аллантоисная жидкость.

Подготовка инфекционного материала

Вируссодержащую аллантоисную жидкость центрифугировали в течение 30 минут при 4 °С и 4000 об./мин. После осаждения фрагментов мембран и крупных контаминирующих частиц надосадок центрифугировали при 36 000 g и 4 °С в течение 1 часа. Осажденные вирионы ресуспендировали в физиологическом растворе, равном по объему исходному количеству аллантоисной жидкости. Полученная вирусная суспензия имела физические характеристики, близкие к таковым для воды. Это позволило использовать ее для создания аэрозоля, что было затруднительно при использовании аллантоисной жидкости с высоким содержанием белков и, как следствие, большой вязкостью. Для замедления высыхания частиц аэрозоля, приводящего к быстрой потере инфекционной активности, к вирусной суспензии добавляли глицерин до конечной концентрации 5%.

Титрование инфекционной активности вируса

Аликвоты физиологического раствора отбирали из микроциклонов и готовили из них серию десятикратных разведений на фосфатном буфере. 10–12-дневные куриные эмбрионы заражали серийными десятикратными разведениями вирусного материала от 100 до 10–6 по 0,2 мл на эмбрион и инкубировали в термостате при 36 °C в течение 48 часов. По окончании срока инкубации эмбрионы охлаждали, вскрывали и переносили аллантоисную жидкость (0,1 мл) в лунки планшета для иммунологических реакций, после чего добавляли равный объем 1% куриных эритроцитов в физиологическом растворе.

Уровень репродукции вируса в эмбрионах оценивали по реакции гемагглютинации эритроцитов. За титр вируса принимали величину, обратную наибольшему разведению вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации, и выражали в логарифмах 50% инфекционной дозы вируса (lgID₅₀). На основании полученных результатов на каждом сроке эксперимента оценивали эффективность инактивации — снижение титра вируса в% от контроля.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов оценки активности проводили с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Различия считали значимыми при р

В. В. Зарубаев* , 1 , кандидат биологических наук
А. А. Штро*, кандидат биологических наук
Е. Н. Свентицкий**, доктор технических наук, профессор

* ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург
** ГосНИИ ОЧБ ФМБА России, Санкт-Петербург

Ознакомление с методикой титрования вирусов.

Оборудование и материалы

Задачи на определение титра вируса в ЭД₅₀ по фактическим данным, выписанным на карточки (на каждого студента по одной карточке, всего не менее 10 вариантов задач); аллантоисная жидкость куриных эмбрионов, зараженных вирусом ньюкаслской болезни; 1- процентная суспензия отмытых эритроцитов кур; физиологический раствор (изотонический раствор NaCl); плексигласовые панели с лунками; градуированные пипетки на 1 мл; резиновые груши; сосуды с дезраствором; карандаши для записи по стеклу, калькуляторы, логарифмические таблицы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме.

В лабораторных работах с вирусами, биофабричном производстве и в ветеринарной практике постоянно возникает необходимость определения количества вирусов в том или ином материале. Без такого определения невозможны экспериментальное заражение вирусами живых лабораторных систем, производство живых и инактивированных противовирусных вакцин и диагностических препаратов, оценка активности живых противовирусных вакцин, получение иммунных сывороток и многие другие работы.

Количество вируса в каком-либо материале определяют по титру вируса в этом материале. Под титром вируса понимают выражение его концентрации в материале.

Титр вируса - это количество вируса, содержащееся в единице объема материала

Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. и.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие.

Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й - инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й - инфекционные единицы 50-процентного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й - гемагглютинирующие единицы.

Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами. В случаях такого проявления инфекционной активности вирусов количество вируса может быть измерено в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ - одной оспины.

Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50-процентного инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД₅₀ - эффективная 50-процентная доза.

Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале.

Таблица 6 - Виды единиц количества вирусов при определении _ по 50-процентному инфекционному действию_

Виды инфекционного действия вирусов

Единицы количества вирусов

50-процентная летальная доза

Клинические симптомы или патологоанатомические изменения

50-процентная эмбриональная летальная доза

В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопа- тическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест- объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД50 принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6.

• 1 ЛД50 - это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);
• 1 ИД₅₀ — доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;
• 1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;
• 1 ЭИД₅о — доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;
• 1 ЦПД50 — доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).

Количество ЭД₅₀ (ЛД₅₀, ИД ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀ или ЦПД₅₀) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=10 3,4 ЦПД₅о/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 10 3 ’ 48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 10 3 ’ 48 = 3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.

Названные единицы 50-процентного инфекционного действия вируса (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию.

Титрование вирусов по 50-процентному инфекционному действию - наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов.

Задача определения титра вируса в единицах 50-процентного инфекционного действия (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.

Чтобы решить эту задачу, сначала из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. 10-кратные разведения берут по двум причинам:

во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 36), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД₅о, на значительном отрезке приближается к прямой.

Рисунок 36 - График зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса

Это означает, что в определенных пределах, центр которых в точке ЭД₅₀, между логарифмом дозы (разведения) вируса и инфекционным эффектом существует прямолинейная зависимость, т. е. величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведения), в области малых и особенно больших доз эта зависимость нарушается;

во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.

Одинаковыми объемами каждого из 10-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (мышей, куриных эмбрионов или культур клеток). При этом в каждой группе должно быть не менее 4-6 тест-объектов, так как при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).

После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50-процентный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50-процентному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД₅₀. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД₅о) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД50. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50-процентного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале.

• 1 Рассчитать титр вируса в единицах 50-процентного инфекционного действия по предложенным фактическим данным.
• 20пределить титр вируса ньюкаслской болезни в аллантоисной жидкости в единицах гемагглютинирующего действия.

Самостоятельная работа студентов

• а) подготовка панелей, пипеток и материала;
• б) получение последовательных 2-кратных разведений вируса по 0,5 мл или по 0,2 мл;
• в) добавление 1-процентной суспензии эритроцитов;
• г) учет результатов и их интерпретация. Во время экспозиции переписывание в тетрадь (с доски или таблицы) схемы титрования антител к вирусу ньюкаслской болезни в РТГА.

Подведение итогов занятия Задание к следующему занятию Контрольные вопросы

• 1 Что такое титр вируса?
• 2 Каковы единицы измерения количества вируса?
• 3 Каков принцип определения титра вируса в БОЕ и ООЕ?
• 4 В чем принцип определения титра вируса в единицах 50- процентного инфекционного действия?
• 5 Какова методика расчета титра вируса в единицах 50- процентного инфекционного действия?
• 6 В чем принцип определения титра вируса в ГАЕ?
• 7 Каковы достоинства и недостатки разных методов титрования вирусов?