Что такое титр вируса и как его определить

Этот метод более универсален. Количество вируса (титр вируса) при этом измеряется в эффективной 50% дозе – ЭД50.

1 ЭД50 = доза вируса, способная вызывать инфекционный эффект у 50% зараженных тест-объектов.

Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект - лабораторные животные (обычно белые мыши), куриные эмбрионы или культура клеток. Инфекционный эффект или действие вируса на разных тест-системах может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. У лабораторных животных и куриных эмбрионов действие вируса оценивается в летальной и инфекционной дозах:

1 ЛД50 - доза вируса, убивающая 50% лабораторных животных;

I ЭЛД50 - доза вируса, убивающая 50% куриных эмбрионов;

1 ИД50 - доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50% зараженных лабораторных животных;

1 ЭИД50 - доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50% зараженных куриных эмбрионов.

В культуре клеток действие вируса оценивается по цитопатическому эффекту или действию (ЦПД):

1 ЦПД50 - доза вируса, вызывающая цитопатический эффект в 50% пробирок с зараженной культурой клеток.

Количество ЭД50 (ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, будет выражением титра вируса в этом материале. Так, запись Т = 103.48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждом 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103.48 доз, каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50% пробирок с культурой клеток.

Метод титрования вирусов по 50% инфекционному действию пригоден для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую тест-систему. Недостатком является трудоемкость, длительность и необходимость статистического расчета.

Методика определения титра вируса в единицах 50% инфекционного действия (ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50) заключается в том, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала. Это и будет титр вируса. Для этого:

1) из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. Количество разведений необходимо делать больше (т.е. столько, чтобы последнее наиболее высокое уже не давало инфекционного эффекта совсем). Для 10 последовательных разведений в каждую из 10 стерильных пробирок наливают по 9 мл стерильного физиологического раствора, а затем в первую вносят ровно 1 мл исследуемой суспензии. Перемешивают содержимое первой пробирки, набирают 1 мл смеси и вносят во вторую пробирку, перемешивают содержимое и 1 мл из второй пробирки - в третью, и т. д,

2) одинаковыми объемами каждого разведения вируссодержащего материала заражают чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов. В каждой их группе требуется не менее 4-6 тест-объектов (для статистической достоверности);

3) по истечении времени учитывают результат действия вируса на зараженные объекты (гибель, заболевание, патологоанатомические изменения или цитопатический эффект). Гибель лабораторных животных, КЭ впервые 48 часов считают неспецифической. Учет заканчивают через 2 -3 суток после прекращения падежа;

4) определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Действие вируса определяют в ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50. Считают, что доза в этом разведении соответствует 1 ЭД50. Дозу вируса подсчитывают различными методами (по Риду и Менчу, Керберу).

Для проведения титрования из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных десятикратных разведений от 1:10, т.е. 10 -1 до 1:10.000.000, т. е. 10 -7 , и более (10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 и т.д.). Количество разведений зависит от предполагаемого титра вируса, их нужно готовить столько, чтобы последнее (наиболее высокое) разведение уже не давало бы инфекционного эффекта. Инфекционное действие вируса (величина инфекционного эффекта) с каждым разведением убывает пропорционально логарифму разведения (или дозы). То есть при разведении 1:100 (10 -2 ) инфекционное действие уменьшается в два раза, если 1:1000 (10 -3 ) в три раза и т. д.

Каждым разведением исследуемого вируссодержащего материала в определенном одинаковом объеме заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (лабораторных животных, куриные эмбрионы, культуры тканей). При этом учитывают тропизм и дозы вируса, общепринятые для данного способа введения материала. В каждой группе должно быть не менее 4-6 тест-объектов, т. к. при меньшем количестве статистическая обработка материала будет иметь слишком большую погрешность.

Однако, при определении титра вируса очень трудно подобрать такие разведения, чтобы одно из них в точности вызывало бы гибель 50% зараженных животных. Часто при титровании количество живых и павших животных бывает неравным. В этом случае для более точного определения титра широко используют в вирусологии метод, предложенный Ридом и Менчем. Они рекомендуют при титровании брать в опыт большое количество групп по 4-6 чувствительных моделей в каждой группе. Отклонение от истинной величины ЛД50, обусловленное применением малого количества подопытных животных в группе, исправляется тем, что при исчислении процента летальности оперируют данными кумулятивной летальности (кумуляция - накопление).

Метод Рида и Менча основан на логической предпосылке о том, что животные (и другие модели), погибшие при заражении каким-либо разведением вируса, например 10 -5 , погибнут и при заражении более низким разведением (10 -4 , 10 -3 ) вируса. Если же животное не пало при данном разведении, то останется живым и при заражении более высоким разведением (10 -6 , 10 -7 ). На этом основании полученные результаты подвергают интерполяции и выражают их в виде кумулятивных данных, на основании которых рассчитывают % летальности.

При вычислении кумулятивных данных мышей, павших от более высокого разведения, прибавляют к числу погибших от более низкого разведения. Мышей, оставшихся живыми от более низкого разведения, прибавляют к числу животных, не погибших от более высокого разведения (направление показано стрелкой). После получения кумулятивных данных определяют % летальности. Процент летальности для каждого разведения вычисляют по формуле:

%летальности = Кол-во павших (кумулятивные данные)/Кол-во зараженных (кумулятивные данные) х 100

Разведения, при которых % летальности приближаются к 50%, называют высшей и низшей критической дозой.

ЛД50 определяют по формуле:

где ЛД50 - искомое разведения вируса; В - разведение, вызывающее гибель более 50% животных; b - процент летальности, соответствующий разведению В; а - процент летальности, соответствующий разведению, дающему гибель менее 50% животных; d - коэффициент разведения.

Титр вируса, выраженный числом с дробным показателем степени, обычно в таком виде и оставляют. Его можно легко превратить и в абсолютную величину с помощью таблицы антилогарифмов (4-х значные математические таблицы Брадиса). По таблице антилогарифмов находят абсолютное значение разведения, соответствующее 1 ЛД50.

Дата добавления: 2014-12-17 ; просмотров: 8001 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Многие вирусы могут очень долго присутствовать в организме и циркулировать в крови, до поры до времени не вызывая никаких неприятностей. Однако это вовсе не значит, что они безопасны. Лабораторные анализы на вирусы позволяют выявить наличие последних, даже если никаких симптомов нет.

Анализы на вирусы: какие инфекции они выявляют

Для выявления вирусов лаборатории проводят исследования крови несколькими методами. Наибольшее распространение на сегодня получили ПЦР и иммуноферментный (ИФА) анализы.

Иммуноферментный анализ крови определяет наличие антител к вирусам (или антигенов к ним) в крови — иммуноглобулины (lgA, lgG, lgM) вырабатываются при заражении вирусами и являются своеобразными маркёрами инфекции.

Анализ на ДНК вируса, или ПЦР-исследование, позволяет выявить тип инфицирующего агента.

В качестве биоматериала для исследования обычно берут кровь. Анализ крови может подтвердить гепатит, герпес и вирус Эпштейна-Барра, аденовирус, различные половые инфекции (в том числе и сифилис), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и другие инфекции. Однако кровь не единственный биоматериал, пригодный для выявления вирусных поражений. В зависимости от заболевания и симптомов, для анализа на вирусы сдают соскоб слизистой оболочки, кал, мочу, мазок, слюну.

Как мы уже отмечали, исследование крови на вирусы можно проводить двумя разными способами. Расскажем о них подробнее.

Иммуноферментный метод анализа на вирусы позволяет установить форму болезни, вызванной вирусом (хроническая, острая или бессимптомная), а также оценить эффективность противовирусной терапии. Это один из самых распространенных и точных методов для выявления половых инфекций, в частности ВИЧ и ВПЧ, гепатита В.

Для анализа на вирусы чаще всего сдается кровь. Обязательно предупредите врача, если вы недавно проводили вакцинацию, — этот факт может отразиться на точности анализов. Рекомендуется не принимать пищу на протяжении 8-ми часов перед забором биоматериала, а также воздержаться от употребления алкоголя и от курения.

Время ожидания результатов зависит от типа вируса, на который проводится анализ, и от методики работы лаборатории. Обычно результаты готовы через 1–3 дня, но иногда приходится ждать и 2 недели.

Рассказать о том, каким образом следует трактовать результаты анализов на все виды вирусов, в рамках одной статьи невозможно. Далее мы поговорим лишь о наиболее известных заболеваниях и о часто назначаемых исследованиях.

В случае проведения анализа методом ИФА наличие IgG в крови на гепатит говорит о том, что этот вирус в организме присутствовал, но иммунная система выработала к нему антитела. Присутствие одновременно антител класса IgM и IgG говорит о заболевании в острой форме. Иммуноглобулины только класса IgM — признак первичного инфицирования.

При проведении исследования методом ПЦР определяется РНК вируса. Результаты могут быть приведены в следующем формате:

РНК вируса не выявлена.
РНК вируса выявлена в концентрации ниже предела количественного определения (менее15 МЕ/мл). Сомнительный результат.
РНК вируса гепатита С выявлена (от 15 и выше 100000000 МЕ/мл).

Для выявления этого вируса гепатита чаще всего назначается ИФА. Если в крови присутствуют антитела IgG и IgM, это значит, что вирус очень активен или же заражение произошло недавно.

В случае проведения ПЦР-анализа определяется концентрация фрагментов ДНК вируса гепатита В. Пациент получает результат с одной из приведенных трактовок:

Не обнаружено.
Сомнительный результат (результат положительный с концентрацией ДНК вируса гепатита В на границе точности метода).
Обнаружено.

Если говорить о трактовке ИФА, то наличие антител, обозначаемых как Anti-HSV-IgG, говорит не об иммунитете к вирусу, а о том, что вы уже были когда-то инфицированы. Этот маркёр наблюдается у большинства пациентов. Если показатель anti-HSV-IgG в пробах, взятых в динамике за 2-недельный период, заметно растет, это значит, что заражение произошло недавно. О рецидиве говорит высокий показатель IgG.

Расшифровка анализа крови на ВИЧ очень проста — если результат отрицательный, это значит, что вирус не обнаружен, если положительный — увы, вирус в крови есть. Но следует знать, что сегодня даже самые надежные методы точны лишь на 98–99%, то есть всегда остается шанс, что результат будет, например, ложноположительным.

При анализе на аденовирус, вызывающий респираторные заболевания, применяется в основном ИФА. В ходе анализа подсчитываются IgG-антитела. Если показатель менее 0,8 условных единиц — результат отрицательный, более 0,8 — положительный.

Не пренебрегайте профилактическими анализами на вирусы. Раннее выявление инфекции позволяет отсрочить или подавить развитие заболевания. В случае же беременности сдача биоматериала на анализ с целью выявления вирусных инфекций является обязательной процедурой. Поводом для прохождения исследования также может стать повышенный уровень лейкоцитов в крови, сдвиг лейкоцитарной формулы, увеличение количества нейтрофилов (палочкоядерных), миелоцитов и метамиелоцитов, снижение числа лимфоцитов при высокой СОЭ в результатах клинического анализа крови.

Ознакомление с методикой титрования вирусов.

Оборудование и материалы

Задачи на определение титра вируса в ЭД₅₀ по фактическим данным, выписанным на карточки (на каждого студента по одной карточке, всего не менее 10 вариантов задач); аллантоисная жидкость куриных эмбрионов, зараженных вирусом ньюкаслской болезни; 1- процентная суспензия отмытых эритроцитов кур; физиологический раствор (изотонический раствор NaCl); плексигласовые панели с лунками; градуированные пипетки на 1 мл; резиновые груши; сосуды с дезраствором; карандаши для записи по стеклу, калькуляторы, логарифмические таблицы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме.

В лабораторных работах с вирусами, биофабричном производстве и в ветеринарной практике постоянно возникает необходимость определения количества вирусов в том или ином материале. Без такого определения невозможны экспериментальное заражение вирусами живых лабораторных систем, производство живых и инактивированных противовирусных вакцин и диагностических препаратов, оценка активности живых противовирусных вакцин, получение иммунных сывороток и многие другие работы.

Количество вируса в каком-либо материале определяют по титру вируса в этом материале. Под титром вируса понимают выражение его концентрации в материале.

Титр вируса - это количество вируса, содержащееся в единице объема материала

Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. и.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие.

Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й - инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й - инфекционные единицы 50-процентного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й - гемагглютинирующие единицы.

Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами. В случаях такого проявления инфекционной активности вирусов количество вируса может быть измерено в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ - одной оспины.

Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50-процентного инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД₅₀ - эффективная 50-процентная доза.

Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале.

Таблица 6 - Виды единиц количества вирусов при определении _ по 50-процентному инфекционному действию_

Виды инфекционного действия вирусов

Единицы количества вирусов

50-процентная летальная доза

Клинические симптомы или патологоанатомические изменения

50-процентная эмбриональная летальная доза

В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопа- тическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест- объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД50 принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6.

1 ЛД50 - это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);
1 ИД₅₀ — доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;
1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;
1 ЭИД₅о — доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;
1 ЦПД50 — доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).

Количество ЭД₅₀ (ЛД₅₀, ИД ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀ или ЦПД₅₀) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=10 3,4 ЦПД₅о/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 10 3 ’ 48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 10 3 ’ 48 = 3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.

Названные единицы 50-процентного инфекционного действия вируса (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию.

Титрование вирусов по 50-процентному инфекционному действию - наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов.

Задача определения титра вируса в единицах 50-процентного инфекционного действия (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.

Чтобы решить эту задачу, сначала из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. 10-кратные разведения берут по двум причинам:

во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 36), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД₅о, на значительном отрезке приближается к прямой.

Рисунок 36 - График зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса

Это означает, что в определенных пределах, центр которых в точке ЭД₅₀, между логарифмом дозы (разведения) вируса и инфекционным эффектом существует прямолинейная зависимость, т. е. величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведения), в области малых и особенно больших доз эта зависимость нарушается;

во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.

После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50-процентный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50-процентному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД₅₀. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД₅о) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД50. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50-процентного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале.

1 Рассчитать титр вируса в единицах 50-процентного инфекционного действия по предложенным фактическим данным.
20пределить титр вируса ньюкаслской болезни в аллантоисной жидкости в единицах гемагглютинирующего действия.

Самостоятельная работа студентов

а) подготовка панелей, пипеток и материала;
б) получение последовательных 2-кратных разведений вируса по 0,5 мл или по 0,2 мл;
в) добавление 1-процентной суспензии эритроцитов;
г) учет результатов и их интерпретация. Во время экспозиции переписывание в тетрадь (с доски или таблицы) схемы титрования антител к вирусу ньюкаслской болезни в РТГА.

Подведение итогов занятия Задание к следующему занятию Контрольные вопросы

1 Что такое титр вируса?
2 Каковы единицы измерения количества вируса?
3 Каков принцип определения титра вируса в БОЕ и ООЕ?
4 В чем принцип определения титра вируса в единицах 50- процентного инфекционного действия?
5 Какова методика расчета титра вируса в единицах 50- процентного инфекционного действия?
6 В чем принцип определения титра вируса в ГАЕ?
7 Каковы достоинства и недостатки разных методов титрования вирусов?

Титр вируса — это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. п.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие.

Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й — инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й — инфекционные единицы 50%-ного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й — гемагглютинирующие единицы.

Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД50— эффективная 50%-ная доза. Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале.

В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест-объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД50 принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6.

1 ЛД50—это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);

1 ИД50—доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;

1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;

1 ЭИД50—доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;

1 ЦПД50— доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).

Количество ЭД50 (ЛД50, ИД ЭЛД50, ЭИД50 или ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=103,48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103'48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 103,48=3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.

Названные единицы 50%-ного инфекционного действия вируса (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию.

Титрование вирусов по 50%-ному инфекционному действию — наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов.

Задача определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.

во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 35), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД50, на значительном отрезке приближается к прямой.

Это означает, что в определенных пределах, центр которых в точке ЭД50, между логарифмом дозы (разведения) вируса и инфекционным эффектом существует прямолинейная зависимость, т. е. величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведения), в области малых и особенно больших доз эта зависимость нарушается;

во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.

Одинаковыми объемами каждого из 10-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (мышей, куриных эмбрионов или культур клеток). При этом в каждой группе должно быть не менее 4—6 тест-объектов, так как при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50%-ный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50%-ному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД50. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД50) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД50. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50%-ного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале

Титр – это количество вируса, содержащегося в единице объема материала. Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки и оспины на ХАО КЭ. Если имеются данные обратные то инфекционная активность вируса может быть измерена в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ) 1БОЕ = дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ – одной оспины. Методы: заражают несколько КК или КЭ на ХАО. Высчитывают среднеарифметическое количество оспин или бляшек. Оно = БОЕ или ООЕ вируса. Рассчитывают сколько БОЕ или ООЕ приходится на единицу объема вируссодержащего материала. Это и есть титр. Т=n/Va, где n-сред арифметическое бляшек или оспин, а –разведение материала, V – введенная доза. Метод 50%-ного инфекционного действия. За единицу количества вируса принимается доза, которая способна вызвать инфекционный эффект у 50% зараженных. Число таких доз в единице материала и будет выражать титр вируса в этом материале. Готовят 10 кратное разведение исследуемого материала, затем одинаковыми дозами заражают равные группы живых тест объектов. Учитывают результат действия и находят в каком разведение вирус проявил свое действие на 50%. Если сразу такое разведение не найдено то оно рассчитывается по формуле Т=lgB – (b-50)/(b-a) *lgd, где В – разведение дающие инфекционный эффект более 50%, b – процент дающий инфекционный эффект более 50%, а – менее 50% d – кратность разведения. За 1ГАЕ принимается такая доза вируса, которая способна агглютинировать примерно 50% эритроцитов содержащихся в том же, что и вирус объеме 1% суспензии отмытых эритроцитов. Готовят ряд последовательных кратных разведений материала и к каждому разведению добавляют 1% суспензию. Реакция оценивается в крестах. Реакция с 2 крестами содержит 1ГАЕ, которая умножается на кратность разведения.

Титр вируса — это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. п.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие.

Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й — инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й — инфекционные единицы 50%-ного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й — гемагглютинирующие единицы.

Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД₅₀— эффективная 50%-ная доза. Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале.

Виды единиц количества вирусов при определении по 50%-ному инфекционному действию

Тест-объекты	Виды инфекционного действия вирусов	Единицы количества вирусов
названия единиц	сокращение обозначения
Лабораторные	Гибель	50%-ная летальная	ЛД₅₀
животные	доза
То же	Клинические симп-	50%-ная инфекци-	ИД₅₀
томы или патоло-	онная доза
гоанатомические
изменения
Куриные эмбри-	Гибель	50%-ная эмбриональ-	элд₅₀
оны	ная летальная
доза
То же	Патологоанатоми-	50%-ная эмбриональ-	эид₅₀
ческие изменения	ная инфекционная
доза
Культуры клеток	Цитопатический	50%-ная цитопати-	ЦПД₅₀
эффект	ческая доза

В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест-объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД₅₀ принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6.

1 ЛД₅₀—это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);

1 ИД₅₀—доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;

1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;

1 ЭИД₅₀—доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;

1 ЦПД₅₀— доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).

Количество ЭД₅₀ (ЛД₅₀, ИД ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀ или ЦПД₅₀) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=10 3,48 ЦПД₅₀/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 10 3 ' 48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 10 3,48 =3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.

Названные единицы 50%-ного инфекционного действия вируса (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию.

Задача определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД₅₀, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.

во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 35), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД₅₀, на значительном отрезке приближается к прямой.

Рисунок 35. График зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса

во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.

После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50%-ный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50%-ному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД₅₀. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД₅₀) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД₅₀. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50%-ного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале.

Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ - конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Читайте также: