Диагностика вирусных инфекций экспресс метод

Инфекционные болезни — это заболевания, вызванные проникновением в организм бактерий, грибков или вирусов. Самая важная часть диагностики инфекций — это определение возбудителя и его концентрации. Для этих целей используются разнообразные лабораторные методы, которые позволяют выяснить, чем именно и как давно атакован организм, а в некоторых случаях — спрогнозировать эффективность лечения тем или иным препаратом.

Особенности диагностики инфекционных заболеваний

В клинической практике данный тип заболеваний встречается очень часто. Именно они, по данным Всемирной организации здравоохранения, становятся причиной 26% всех смертей. В список самых распространенных инфекционных заболеваний входят инфекционная пневмония и другие воспалительные заболевания дыхательных путей, гепатит, ВИЧ, туберкулез, малярия, воспаления органов половой системы и мочевыводящих путей, гистоплазмоз, ротавирусные инфекционные заболевания, ветряная оспа, герпес, вирус папилломы человека и еще несколько десятков болезней. Хотя бы раз в жизни каждый из нас сталкивается с инфекционными заболеваниями и необходимостью быстрой постановки диагноза.

Все инфекционные болезни делятся на пять типов — прионные, вирусные, бактериальные, протозойные и грибковые поражения. Далее будут рассмотрены последние четыре типа как наиболее распространенные. Разные возбудители иногда могут вызывать одно и то же заболевание. В частности, пневмония может быть результатом как вирусной, так и бактериальной инфекции. Лечение зависит не от проявлений, а от возбудителя болезни. Противовирусные препараты бесполезны в борьбе с бактериями и грибками, антибиотики не действуют на вирусы. Поэтому основная задача лабораторной диагностики инфекционных заболеваний — выявление типа возбудителя.

Способы лабораторной диагностики инфекционных болезней можно разделить на два типа: неспецифические и специфические методы.

К неспецифическим относятся общий анализ крови и исследование соотношения ее белковых фракций, печеночные пробы, общий анализ мочи и кала. Эти методы не дают информации о виде возбудителя, но позволяют узнать, в какой мере болезнь затронула органы и системы организма, что именно в их работе нарушено и насколько далеко зашел процесс.

Специфические — вирусологический и бактериологический методы, микроскопическое исследование возбудителей, анализы на антигены и антитела — направлены непосредственно на обнаружение возбудителя.

Современная медицина располагает множеством методов выделения возбудителей бактериальной инфекции:

Бактериоскопический . Исследуется окрашенный специальным образом мазок.

Бактериологический . Биоматериал высеивается в питательную среду, и через некоторое время специалист исследует колонию бактерий, выросшую в ней.

Биологический . Направлен на определение патогенности микроорганизмов.

Серологический . Выявляет антитела и антигены в сыворотке крови — особые вещества, которые вырабатываются организмом при контакте с возбудителем определенной болезни.

Чаще всего для исследований используют кровь или сыворотку крови, реже — слюну, мочу, кал, клетки эпителия (мазок и соскоб) и другой биоматериал.

В лабораторной диагностике вирусных заболеваний используются:

Вирусологическое исследование . Световая и электронная микроскопия дает возможность выявить наличие вирусных включений и сами вирусы и идентифицировать их.

Серологическое исследование для обнаружения антител и антигенов. Этот метод дает возможность быстро выявить агрессора, как и в случае с бактериальными инфекциями. Для диагностики используются разнообразные способы исследования материала — реакции гемадсорбции, гемагглютинации или метод непрямой иммунофлюоресценции. Имунноблоттинг, в частности, позволяет выявлять антитела сразу к нескольким инфекциям и считается современным и точным диагностическим методом.

Молекулярно-генетические методы . Последнее слово в лабораторной диагностике. Позволяют обнаружить вирус даже тогда, когда его концентрация ничтожно мала — то есть на самых ранних стадиях. Самым известным из этих методов является ПЦР, при которой фрагмент вируса многократно копируется до тех пор, пока специалист не получит достаточно материала для определения типа вируса и его изначальной концентрации.

Для выявления вирусов обычно требуется сделать анализ крови.

Так называют инфекции, вызванные простейшими паразитами, например, амебами. Малярия, амёбиаз, токсоплазмоз, лямблиоз, трихомониаз, сонная болезнь — вот неполный список самых распространенных протозойных инфекций. Лабораторная диагностика таких заболеваний включает в себя следующие методы:

Микроскопический . Простейшие паразиты выявляются путем исследования под микроскопом окрашенных образцов биоматериала. Самый простой и надежный метод для многих возбудителей.

Культуральный . Посев биоматериала в питательную следу для дальнейшего исследования размножившихся простейших. У этого метода есть существенный недостаток: результатов нужно ждать долго, сам процесс может занять не менее 5-6-ти дней.

Серологический . Используют редко ввиду малой информативности.

Аллергический . Также не является распространенным. Кожные аллергопробы делают для того, чтобы подтвердить лейшманиоз и токсоплазмоз. Это вспомогательный диагностический метод.

В качестве биоматериала для исследований в основном используется кровь, иногда — – кал или моча.

Микроскопическое исследование . Препарат окрашивается и рассматривается под мощным микроскопом. Посредством иммунофлюоресцентной микроскопии исследуется проба, помеченная флюоресцеинами — специальным красителем. Наиболее быстрый способ выявления грибка по сравнению с другими методами.

Культуральный . Происходит посев пробы на питательную среду и дальнейшее исследование полученной в результате колонии грибков.

Серологический . Используется для выявления грибковых поражений, однако для микозов он считается не особенно точным.

Гибридизация нуклеиновых кислот . Самый современный способ выявления грибковых инфекций, его применяют для идентификации основных возбудителей системных микозов. Из культуры извлекается РНК и вносится особым способом помеченная молекула ДНК. Если в пробе наличествует один из основных патогенных грибков, ДНК объединится с его РНК, создав легко различимую структуру. Несомненным преимуществом метода является возможность определить инфекцию на самых ранних стадиях.

Биоматериалом для исследований являются клетки кожи, волос и ногтей, клетки слизистых оболочек (мазок или соскоб), мокрота, моча, секрет простаты, сперма, грудное молоко.

Современные методики диагностики инфекций позволяет выявить их на начальном этапе, Чем раньше болезнь будет обнаружена, тем проще ее вылечить. Поэтому сдавать анализы на инфекции желательно регулярно, даже если вы ни на что не жалуетесь и не замечаете никаких перемен в самочувствии.

Перед сдачей биоматериала для исследований иногда требуется определенная подготовка. Так, кровь обычно сдают с утра, натощак, а перед забором мазка не рекомендуется принимать душ. Эти требования очень важны: они обеспечивают точность результата, поэтому узнайте у врача заранее о подготовительных мерах и точно следуйте всем его рекомендациям.

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций подразделяются на несколько больших групп.

- Прямые методы, состоящие в выявлении непосредственно в биологическом материале самого вируса или антител к нему.

- Непрямые методы-заключаются в искусственной наработке вируса в значительных количествах, и его дальнейшем анализе.

К наиболее актуальным в повседневной практике методам диагностики относятся:

Серологические методы диагностики - выявление в сыворотке крови пациента определенных антител или антигенов в результате реакции антиген-антитело(АГ-АТ). То есть, при поиске у пациента определенного антигена используется соответствующее искусственно синтезированное антитело, и, соответственно, наоборот-при выявлении антител используют синтезированные антигены.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Основана на использовании меченых красителями антител. При наличии вирусного антигена он связывается с мечеными антителами, и под микроскопом наблюдается специфическая окраска, которая говорит о положительном результате. При этом методе, к сожалению, невозможна количественная интерпретация результата, а только лишь качественная.

Возможность количественного определения дает иммуноферментный анализ(ИФА). Он похож на РИФ, однако в качестве маркеров используют не красители, а ферменты, превращающие бесцветные субстраты в окрашенные продукты, что и дает возможность количественной оценки содержания как антигенов, так и антител.

- Отмывают не связавшиеся антитела и антигены.

- Добавляют бесцветный субстрат, и в лунках с антигеном, который мы определяем, произойдет окрашивание, т.к. там будет связанный с антигеном фермент, после чего на специальном приборе оценивают интенсивность свечения окрашенного продукта.

По похожей схеме происходит и выявление антител.

Реакция непрямой(пассивной) гемаглютинации (РПГА).

Метод основан на способности вирусов связывать эритроциты. В норме эритроциты падают на дно планшета, образуя так называемую пуговку. Однако если в исследуемом биологическом материале находится вирус, он свяжет эритроциты в так называемый зонтик, который не упадет на дно лунки.

Теперь остановимся на методах диагностики непосредственно нуклеиновых кислот исследуемых вирусов, и прежде всего о ПЦР ( Полимеразная Цепная Реакция) .

Суть этого метода заключается в обнаружении специфического фрагмента ДНК или РНК вируса путём его многократного копирования в искусственных условиях. ПЦР можно проводить только с ДНК, то есть для РНК-вирусов предварительно необходимо произвести реакцию обратной транскрипции.

Непосредственно ПЦР проводят в специальном приборе, под названием амплификатор, или термоциклер, который поддерживает необходимый температурный режим. ПЦР-смесь состоит из добавленной ДНК, которая содержит интересующий нас фрагмент, праймеров (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, комплиментарный ДНК-мишени, служит затравкой для синтеза комплиментарной цепи), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.

Стадии цикла ПЦР:

- Деннатурация-первая стадия. Температура повышается до 95 градусов, цепочки ДНК расходятся друг относительно друга.

- Отжиг праймеров. Температуру понижают до 50-60 градусов. Праймеры находят комплиментарный участок цепи и связываются с ним.

- Синтез. Температуру вновь повышают до 72, это рабочая температура для ДНК-полимеразы, которая, отталкиваясь от праймеров, строит дочерние цепи.

Цикл многократно повторяется. Через 40 циклов из одной молекулы ДНК получается 10*12 степени копий копий искомого фрагмента.

При проведении ПЦР в режиме реального времени синтезируемые копии фрагмента ДНК метятся красителем. Прибор регистрирует интенсивность свечения и по ходу реакции строит графики накопления искомого фрагмента.

Современные методы лабораторной диагностики с высокой достоверностью позволяют выявить присутствие вируса - возбудителя в организме, нередко, задолго до появления первых симптомов заболевания.

Вирусы	Инфекция	Материал для исследования	Сроки забора материала	Методы экспресс- диагностики
Аденовирусы	Аденовирусная инфекция	Отделяемое носоглотки, конъюнктивы, кровь, кал, моча	Первые 7 дней болезни	РИФ, молекулярная гибридизация (МГ), ЭМ, ИФА, РИА, ПЦР
Парагриппа, РС-вирус	ОРВИ	Отделяемое носоглотки	Первые 3-5 дней болезни	РИФ, ИФА, МГ, ПЦР
Гриппа	Грипп	Отделяемое носоглотки	Первые 3-5 дней болезни	РИФ, ИФА, РИА, ЭМ, МГ, ПЦР, ИБ
Риновирусы	ОРВИ	Отделяемое носоглотки	Первые 3-5 дней болезни	РИФ, МГ, ПЦР
Простого герпеса	Herpes simplex	Содержимое везикулы	Первые 12 дней после появления сыпи	РИФ, ИЭМ, ИФА, РИА, МГ, ПЦР, ИБ
Ветряной оспы и опоясывающего герпеса	Ветряная оспа, опоясывающий герпес	Содержимое везикулы	Первые 7 дней после появления сыпи	ИФА, ИФ, ИЭМ, РИА, МГ, ПЦР

Окончание табл. 4

Вирусы	Инфекция	Материал для исследования	Сроки забора материала	Методы экспресс- диагностики
Цитомегалии	Цитомегаловирусная инфекция	Моча, слюна, кровь	Весь период заболевания	ЭМ, микроскопия мазков-отпечатков, МГ, РИФ, выявление IgM, РИА, ПЦР
Ротавирусы	Острый гастроэнтерит	Фекалии	Первые 3-5 дней болезни	ЭМ, ИЭМ, ИФА, РИА, МГ, ПЦР, электрофорез РНК в ПААГ
Энтеровирусы	Серозный менингит, ОРВИ, ОКИ, полиомиелит	Фекалии, кровь, отделяемое носоглотки	Весь период заболевания	РИФ, РИА, МГ, ПЦР
Гепатита А	Гепатит А	Фекалии, кровь	Первые 7-10 дней болезни	ИЭМ, ИФА, РИА, выявление IgM
Гепатита В	Гепатит В	Кровь, биопсийный материал	Весь период заболевания	ИФА, РИА, РОПГА, МГ, ПЦР, ВИЭФ
Гепатита С	Гепатит С	Кровь, биопсийный материал	Весь период заболевания	ИФА, МГ, ПЦР
ВИЧ	ВИЧ-инфекция	Кровь	Весь период заболевания	ИФА, ИБ, ПЦР

2 группа— выделение вируса из клинического материала, его индикация и идентификация (вирусологическая диагностика).

В большинстве случаев концентрация вируса в клиническом материале недостаточна для быстрого обнаружения вируса или его антигенов. В этих случаях используют вирусологическую диагностику. Эта группа методов требует продолжительного времени, трудоемка, часто является ретроспективной. Однако вирусологическая диагностика является необходимой для инфекций, вызванных новыми типами вируса, или когда невозможно провести диагностику другими методами.

Для вирусологической диагностики врач должен обеспечить взятие необходимых проб материала в соответствующую фазу заболевания, доставку их в лабораторию, снабдив диагностические лаборатории необходимой клинической информацией.

Материалом для вирусологического исследования при заболеваниях, сопровождающихся диареей или другими желудочно-кишечными расстройствами, предполагающими вирусную этиологию (гепатит А, рота- и энтеровирусные инфекции), являются свежие порции фекалий. При заболеваниях дыхательной системы (грипп, парагрипп, РС-инфекция, аденовирусная инфекция и др.) материал для исследования лучше всего получать путем аспирации слизи, смывов. Мазки из носоглотки менее информативны. При наличии везикулярной сыпи (герпетическая инфекция) материалом для исследования является жидкость, аспирированная иглой из везикул. При петехиальной и макуло-папулёзной сыпи — как пробы слизи из носоглотки, так и фекалии. При подозрении на нейровирусные инфекции (полиомиелит, арбовирусные инфекции) для вирусологического исследования следует забирать слизь из носоглотки, фекалии и спинномозговую жидкость. Для диагностики эпидемического паротита и бешенства материалом служит слюна. При подозрении на цитомегало- и паповавирусные инфекции материалом может быть моча. Попытку выделить вирус из крови можно предпринять при подозрении на инфекции, вызванные некоторыми арбовирусами, вирусами герпеса. Биопсия мозга может быть проведена при диагностике герпетического энцефалита, ПСПЭ, прогрессирующего краснушного панэнцефалита, болезни Крейтцфельдта-Якоба, лейкоспонгиоза и др.

Препараты слизи из носоглотки или фекалии помещаются в среду для транспортировки, состоящую из физиологического раствора с добавлением антибиотиков и небольшого количества белка или сыворотки животных. Материалы могут храниться при температуре 4°С не боле 48 часов. Более длительное хранение требует температуры –70°С.

Выделение вируса из клинического материала осуществляется путем его инокуляции в культуру клеток, куриные эмбрионы или заражения им лабораторных животных (см. Культивирование вирусов).

Вирус гриппа следует выделять путем инокуляции вируссодержащего материала в амниотическую или аллантоисную полость куриного эмбриона. Для выделения вируса Коксаки А, вируса бешенства, многих арбовирусов, аренавирусов рекомендуется интраперитонеальная и интрацеребральная инокуляция материала новорожденным мышам.

Индикация вирусов в культуре клеток проводится по ЦПД, РИФ, РГА, РГАдс. Многие энтеровирусы вызывают раннее ЦПД (через несколько часов). Цитомегаловирусы, аденовирусы, вирус краснухи вызывают ЦПД через несколько недель, а иногда необходимо прибегать к получению субкультуры. Присутствие синцития свидетельствует о наличии таких вирусов, как РС, кори, эпидемического паротита, герпесвирусов.

Идентификация вирусов, выделенных в этих системах, проводится с помощью серологических методов. Такие серологические реакции, как РТГА, РН, РТГАдс, используются только при вирусных инфекциях. РСК, РПГА, ИФА, РИА, ИФ, РП и др. используются для диагностики как вирусных инфекций, так и инфекций, вызванных другими возбудителями. В настоящее время широко используются методы молекулярной диагностики: МГ, ПЦР.

На схемах 2 и 3 представлена вирусологическая диагностика ОРВИ и кишечных инфекций.

3 группа— серологическая диагностика вирусных инфекций.

Однократно проведенное серологическое исследование лишь в редких случаях позволяет диагностировать вирусное заболевание (например, при ВИЧ-инфекции). В большинстве случаев для серологической диагностики требуются парные сыворотки, взятые в острой фазе заболевания и спустя 2-4 недели. Обнаружение четырехкратного и более повышения титра антител принято рассматривать в качестве диагностического признака острой вирусной инфекции.

Слизь из носоглотки, обработанная антибиотиками
Заражение куриных эмбрионов	Заражение мышей-сосунков
РГА	гибель, специфические поражения ХАО	параличи, гибель
РСК, РТГА	РИФ, РН	Вирусы Коксаки, герпеса
Вирусы гриппа	Вирусы герпеса
Заражение культур клеток
ЦПД может отсутствовать	Образование синцития	Аденовирусный тип ЦПД	Пикорнавирусный тип ЦПД	Герпетичес-кий тип ЦПД
интерференция	РТГАдс	РИФ, РН, РСК, МГ, ПЦР	РИФ, РН, РСК, РТГА, МГ, ПЦР	РСК, РН по цветной пробе, МГ, ПЦР	РИФ, РН, МГ, ПЦР
РИФ, ПЦР	РИФ, РН, РТГА, РТГАдс, ПЦР
Вирус краснухи	Вирусы гриппа, парагриппа, эпидпаротита	РС-вирус, кори, парагриппа	Аденовирусы	Энтеровирусы, риновирусы	Вирусы простого герпеса, цитомегалии

Схема 2. Выделение вирусов из отделяемого носоглотки, их индикация и идентификация при респираторных вирусных инфекциях

Суспензия фекалий, обработанная антибиотиками, осветленная центрифугированием
Заражение культур клеток	Заражение мышей
Пикорнавирусный тип ЦПД	Реовирусный тип ЦПД	Аденовирусный тип ЦПД	Параличи, гибель
РСК, РН по цветной пробе, ПЦР	РИФ, РН, РТГА, МГ, ПЦР	РТГА, РСК, РН, МГ, ПЦР	РН, РСК, МГ, ПЦР
Энтеровирусы	Ротавирусы	Аденовирусы	Коксаки А, В, Ротавирусы

Схема 3. Выделение вирусов из фекалий, их индикация и идентификация
при кишечных вирусных инфекциях

4 группа — молекулярно-биологические методы индикации, идентификации и клонирования вирусов. Проводятся с целью выявления вирусспецифических фрагментов генома вирусов в материале.

Молекулярно-биологическая индикация вирусов в биологическом материале (дот блоттинг, in sinu гибридизация, сэндвич гибридизация):

– Методы молекулярной гибридизации (метод микрогенов). Проводятся с целью выявления вирусспецифических фрагментов генома вируса в материале. Характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью. Используются для выявления цитомегаловирусов, вирусов герпеса, вирусов гепатита.

– Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и количественная ПЦР.

– Вестерн-блоттинг — основан на выявлении циркулирующих в крови специфических антител к антигенам вируса.

– Определение инфицированных вирусом клеток методом проточной цитофлюориметрии. Используется при ВИЧ-инфекции, инфекционном мононулеозе, гепатите С, цитомегаловирусной инфекции.

Методом ПЦР возможно проведение индикации вирусов в материале, идентификации, дифференциации с родственными инфекционными агентами, генотипирование изолятов вирусов и клонирование фрагментов их генома без необходимости культивирования в культуре клеток.

Общие свойства вирусов.

Вирусы – микроскопические неклеточные формы жизни, обладающие свойством генетического паразитизма, содержащие один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и размножающиеся путем дезинтеграции. Вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной – вирион и внутриклеточной – вирус. Вирусы человека и животных, в основном, сферической формы, могут быть правильной многогранной формы. Вирусы растений, как правило, палочковидной формы, а вирусы бактерий (бактриофаги) чаще всего имеют форму сперматозоидов. Размеры вирусов колеблются от 20 до 300 нм.

В зависимости от размеров вирусы делятся на:

1. Мелкие – от 20 до 60-70 нм (пикорнавирусы, арбовирусы, реовирусы)

2. Средние – 80-150 нм (миксовирусы)

3. Крупные – 150 нм и более (герпесвирусы, оспенные вирусы).

Определенные связи с размером имеет структура и химический состав вируса. Наиболее просто устроены мелкие вирусы, наиболее сложно – крупные. Мелкие вирусы состоят только из нуклеиновой кислоты и белка – это нуклеопротеиды и нуклеокапсиды. Капсид состоит из белковых субъединиц – капсомеров, уложенных компактно, правильными образованиями на поверхности нуклеотида в виде спирали (миксовирусы) или по кубическому типу симметрии (энтеро-, адено-, герпесвирусы). Каждый вирус имеет определенное число капсомеров (адено – 252, полио – 60, герпес – 162 и т.д.). У средних и крупных вирусов, кроме нуклеокапсида, есть внешняя оболочка, содержащая белки, жиры, углеводы, - супрекапсид. Вся эта структура – вирион. В состав вириона входят неорганические ионы.

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

I. Экспресс-диагностика – обнаружение вируса или его антигенов в исследуемом материале:

1. Обнаружение внутриклеточных включений (бешенство, герпетическая инфекция, натуральная и ветряная оспа) и элементарных телец (натуральная оспа) с помощью специальных методов окраски и обычной световой микроскопии.

2. РИФ, ИФА, РИА, ЭМ, ИЭМ.

3. Обнаружение нуклеиновой кислоты вируса метод ПЦР.

II. Вирусологический метод – выделение вируса из исследуемого материала и его идентификация:

1-ый этап – накопление вирусов:

а) в культурах клеток и тканей

б) в куриных или утиных эмбрионах

в) организме чувствительного лабораторного животного

2-ой этап – обнаружение (индикация) вирусов:

а) в культуре клеток: по обнаружению цитоплазматических и внутриядерных включений, по ЦПД вируса, по цветной пробе Солка, по РГА и РГАдс.

б) в курином эмбрионе: по образованию бляшек на поверхности ХАО, по помутнению амниотической жидкости, по РГА.

в) в организме лабораторного животного: по клиническим и патологоанатомическим изменениям тканей и органов.

3-ий этап – идентификация вирусов:

б) РН с учетом по: цветной пробе Солка, РТГАдс, нейтрализации ЦПД или инфекционной активности вируса.

III. Серологический метод (серодиагностика) – обнаружение антител к антигенам вирусов в сыворотке крови пациента:

1. РТГА, РСК, ИФА, непрямая РИФ, РИА.

2. РН с живыми лабораторными штаммами вируса.

Пояснения по методам лабораторной диагностики вирусных инфекций.

I. Экспресс-диагностика – обнаружение вируса или его антигенов в исследуемом материале:

a) Элементарные тельца – это отдельные крупные вирионы, имеющие размеры до 200 нм и видимые при особых методах окраски (по Морозову, Романовскому-Гимзе) в световой микроскоп: элементарные тельца Пашена при натуральной оспе в содержимом везикул и пустул.

б) В клетках, пораженных некоторыми вирусами, можно наблюдать образование вирусных включений, локализующихся в цитоплазме (тельца Бабеша-Негри при бешенстве, тельца Гварниери при натуральной оспе), или в ядре (при инфекции, вызванной аденовирусами, герпесвирусами). Природа не всех вирусных внутриклеточных включений ясна. Тельца Бабеша-Негри при бешенстве, по данным японских ученых, являются местом продукции вирионов, т.е. колониями элементарных частиц. При герпесе включения на ранней стадии формирования представляют собой скопления вирионов. Включения окрашиваются по Романовскому-Гимзе, Туревичу, Муромцеву (при бешенстве).

2. РИФ, ИФА, РИА, ЭМ, ИЭМ.

а) ЭМ (электронная микроскопия) – позволяет обнаружить возбудителя в клиническом материале при негативном контрастировании. Этот метод требует достаточно высокой концентрации возбудителя в материале (10 4 -10 5 частиц/мл).

б) Обнаружение антигенов вирусов:

- РИФ (с использованием диагностических люминесцирующих сывороток)

- ИФА (иммуноферментный анализ) – это высокочувствительный, быстрый метод, технически простой и доступный. Применяется для быстрой диагностики гепатитов, респираторных инфекций, гастроэнтеритов (ротавирусных инфекций). Чаще всего для обнаружения антигенов вирусов используется сэндвич-вариант постановки ИФА. Для его постановки используют плоскодонный полистирольный иммунологический планшет, на дне лунок которого фиксированны антитела к антигенам вируса (первые антитела). В лунки вносят образец исследуемого материала, инкубируют при определенной температуре, затем промывают лунки специальными буферными растворами. После отмывки вносят вторые антитела, конъюгированные с ферментом (чаще всего – пероксидаза хрена), инкубируют. По окончании инкубации лунки снова тщательно промывают и заполняют субстрат-индикаторной смесью – перекись водорода и тетраметилбензидин (ТМБ) или ортофенилендиамин (ОФД) – и инкубируют при комнатной температуре в темном месте, после чего реакцию необходимо остановить добавлением стоп-реагента (раствор серной или соляной кислоты). Индикатор (хромоген) в присутствии активных радикалов кислорода, образующихся в процессе ферментации перекиси водорода пероксидазой, изменяет свой цвет с бесцветного на синий (ТМБ) или желто-коричневый (ОФД). После остановки реакции при использовании ТМБ цвет раствора изменяется на желтый, а при использовании ОФД становится темнее. Учет реакции ведется в фотоколориметре с вертикальным направлением освещения при длине волны 450 нм для ТМБ и 492 нм для ОФД против контрольных положительной и отрицательной проб.

- РИА (радиоиммунный анализ), разновидность твердофазного иммунологического анализа, когда один из известных компонентов имеет радиоактивную метку. Результаты учитываются с помощью счетчика или авторадиографии, используя рентгеновскую пленку. Для выявления АГ исследуемый материал смешивают со специфической сывороткой, а затем через определенное время вносят гомологичный АГ, меченый радиоактивным изотопом. При этом между анигеном исследуемого материала и меченным антигеном возникает конкуренция за связывание со специфической сывороткой. Если меченый АГ остается свободным, реакция считается положительной, поскольку исследуемый АГ связался с диагностической сывороткой. Такой вариант иммуноанализа называется конкурентным.

- ИЭМ (иммунная электронная микроскопия) – отличается от обычной ЭМ предварительной обработкой исследуемого материала специфическими антителами, мечеными атомом металла. Подобная обработка приводит к тому, что при просмотре электронограммы интересуемые объекты (вирусные частицы) проявляются более четко благодаря большей электронопоглощающей способности металла. Это позволяет выявить возбудителя и одновременно его идентифицировать.

3. Обнаружение нуклеиновой кислоты вируса метод ПЦР.

II. Вирусологический метод – выделение вируса из исследуемого материала и его идентификация:

1-ый этап – накопление вирусов:

- накопление в культуре клеток и тканей

Культуры тканей стали активно использоваться с 50-х годов, когда в практику вошли антибиотики (прекратились бактериальные проросты ткани), были разработаны синтетические питательные среды, а главным стимулом послужило выявление ЦПД у вирусов. С 1954 года стали использовать метод однослойных культур тканей. Существует 3 типа тканевых культур:

Первично-трипсинизированные культуры получают из различных тканей: кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, куриных, мышиных, из почек различных эмбрионов, из легких, из роговицы глаза кролика и т. д. Ткань измельчают, обрабатывают трипсином, освобождают от детрита, стандартизуют число клеток, взвешенных в питательной среде с антибиотиками, разливают в пробирки или флаконы. Полуперевиваемые культуры – это культуры из диплоидных клеток, способные вне организма выдерживать 40-50 пассажей благодаря двойному набору хромосом, после чего отмирают. Перевиваемые культуры существуют вне организма очень долго. Они получены из нормальных тканей, из злокачественных, эмбриональных. Перевиваемые линии культур тканей: Нер-2 (злокачественные клетки из опухоли гортани человека), НеLа (злокачественные клетки из раковой опухоли шейки матки), Детройт-6 (злокачественные клетки из опухоли мозга), A-1 (клетки амниона человека), МК-2 – из почек обезьяны – всего около 400 видов. Для культур клеток необходимы питательные среды. Наиболее универсальная – 199 среда, содержащая 66 компонентов. Игл установил 28 крайне необходимых компонентов: глютамин, 12 незаменимых аминокислот, 8 витаминов комплекса В, 6 неорганических ионов, углевод, сыворотка. Основу всех сред составляют солевые растворы: Эрла, Хенкса. рН среды должна быть строго определена и постоянна – 7,0-7,4.

- культивирование вирусов в куриных, реже утиных, эмбрионах

Эмбрионы для выделения вирусов применяют с 1930 года. Преимущества: это закрытая полость, свободная от микрофлоры и вирусов. У эмбрионов не образуются антитела, как в организме лабораторных животных, они доступны и дешевы. Используются эмбрионы разного возраста (от 5-7-дневного до 11-13-дневных) и разные методы заражения: в амнион, на хорион-аллантоисную оболочку – ХАО, в хорион-аллантоисную полость, в желточный мешок.

- накопление вируса в организме чувствительных лабораторных животных

В основном используются белые мыши разного возраста, обезьяны (для вируса кори). При накоплении вирусов в организме животных можно оценить этапы развития клинической картины заболевания, патоморфологические и патогистологические изменения в органах и тканях.

2-ой этап – обнаружение (индикация) вирусов:

а) В культуре ткани:

¨ Обнаружение внутриклеточных включений, элементарных телец (см. Экспресс-диагностику)

¨ Обнаружение ЦПД разных вирусов в культуре ткани:

При размножении вируса в культуре ткани происходят различные изменения, которые в конечном итоге приводят к гибели клетки. Сморщивание клеток, пикноз ядер, скручивание их, образование небольших очагов этих изменений наблюдается при энтеровирусной инфекции, полиовирусы тоже дают очень быстро ЦПД. Вирус может размножаться и не вызывать заметных изменений в клетке, тогда прибегают к окрашиванию монослоя гематоксилин-эозином или другим гистохимическим методом и изучают тонкие изменения в ядрах и цитоплазме и т.д.

¨ РГАдс. – реакция гемадсорбции:

Данный способ индикации используется только для вирусов, содержащих гемагглютинины (ГА). Если к культуре клеток, зараженной вирусом с ГА, добавить эритроциты, то они могут адсорбироваться на клетках, пораженных вирусом. Данный феномен наблюдается с вирусами клещевого энцефалита, гриппа, парагриппа, кори, паротита и т. д. Учёт реакции проводится с помощью световой микроскопии.

¨ РГА – реакция гемагглютинации:

Данный способ индикации используется только для вирусов, содержащих гемагглютинины (ГА). Вирусы, обладающие ГА, способны вызывать склеивание эритроцитов. В отличие от гемадсорбции, для РГА берется вируссодержащая жидкость (ВСЖ) (культуральная среда, амниотическая или аллантоисная жидкость и т.д.), помещается в лунку планшета и добавляется взвесь эритроцитов (куриных, бараньих, человеческих и др.). При наличии в ВСЖ вируса с ГА происходит агглютинация эритроцитов, и они образуют осадок в виде зонтика (РГА положительная); при отсутствии вируса образуется осадок из эритроцитов в виде пуговки (РГА отрицательная).

¨ Цветная проба Солка:

Самый простой метод индикации вирусов в культуре клеток. Сущность его заключается в визуальной оценке окраски питательной культуральной среды. Большинство питательных сред для культур тканей содержит индикатор – феноловый красный. В нейтральной стерильной среде индикатор имеет красный цвет. В кислой среде феноловый красный становится желтым. Жизнеспособные клетки выделяют в питательную среду кислые продукты своего метаболизма, вызывая изменение цвета индикатора с красного на желтый уже на третьи сутки. При накоплении вируса в культуре клеток он нарушает функционирование клеток вплоть до их гибели. При этом отмечается задержка изменения цвета среды более 6 дней, что и позволяет сделать заключение о присутствии вируса в культуре.

б) В куриных эмбрионах:

¨ Образование бляшек на хорион-аллантоисной оболочке

¨ Помутнение амниотической жидкости.

в) В организме лабораторного животного:

¨ Оценка клинических проявлений инфекции

¨ Оценка патоморфологических и патогистологических изменений

3-ий этап – идентификация вирусов:

Идентификация вируса производится по инактивации его или его свойств специфическими противовирусными сыворотками. Для этого вируссодержащую жидкость (в РТГА, РН, РСК, ИФА) или культуру инфицированных клеток (в РИФ) инкубируют с диагностическими сыворотками, после чего:

¨ добавляется взвесь эритроцитов (курицы, человека, барана и др.). При связывании антителами диагностической сыворотки гемагглютининов вируса агглютинации эритроцитов не происходит (образуется осадок эритроцитов в виде пуговки – РТГА положительная). Если сыворотка не подходит к данному вирусу, эритроциты агглютинируются, образуя осадок в виде зонтика.

б) РН с учетом по:

¨ цветной пробе Солка:

если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не может инфицировать и разрушать клетки культуры, что приводит к пожелтению питательной среды (РН положительная). Если сыворотка не подходит к данному вирусу, он поражает клетки культуры, они погибают, и цвет питательной среды остается красным.

если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не оказывает ЦПД на клетки культуры (РН положительная). Учет проводят микроскопически.

¨ нейтрализации инфекционной активности вируса:

если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не вызывает заболевание у инфицированного лабораторного животного (РН положительная).

если вирус связался с антителами дигностической сыворотки, он не вызывает адсорбции (фиксации) эритроцитов на поверхности культуры клеток (РН положительная). Учет проводят микроскопически.

можно использовать сэндвич-вариант постановки ИФА (см. экспресс-диагностику, только вместо исследуемого материала используют вируссодержащую жидкость).

культуру клеток, инфицированных вирусом, обрабатывают дигностической люминесцирующей сывороткой и учитывают результат реакции с помощью люминесцентного микроскопа. Если вирус связывается с антителами диагностической сыворотки, наблюдается свечение клеток (РИФ положительна).

Для серодиагностики вирусных инфекций используют парные сыворотки, взятые с интервалом 10-14 дней. Диагностически значимым является не менее чем 4-х-кратное нарастание титра AT.

1. РТГА, РСК, ИФА, непрямая РИФ (с антиглобулиновой люминесцирующей сывороткой), РИА с антигенами вирусов или инактивированными вирусными частицами.

2. РН с живыми лабораторными штаммами вируса с учетом по: цветной пробе Солка, РТГАдс, нейтрализации ЦПД или инфекционной активности вируса.

Читайте также: