Хранение и консервация вирусов

Требования по безопасности ужесточаются в связи с необходимостью во многих случаях приготовления концентратов вирусных антигенов. Следует отметить, что инактивация должна быть не только эффективной, но и максимально щадящей (селективной). Иными словами, сопутствующие изменения в структуре вирусных частиц и их компонентов должны быть минимальными. Однако механизм инактивирующих воздействий во многих отношениях недостаточно выяснен и их использование зачастую носит эмпирический характер.

Так как вирионы в центре агрегатов, образованных клеточными и сывороточными компонентами, могут быть защищены от инактивации, разрушение и удаление агрегатов различными методами очистки вирусной суспензии является важным этапом перед инактивацией. При изготовлении цельновирионных не-реплицирующихся вакцин используют химические и физические методы инактивации вирусов.

Химические методы инактивации вирусов

Из химических соединений наиболее часто используют два главных типа инактиваторов: ретикулирующие (разрыхляющие) агенты и алкилирующие агенты.

К ретикулирующим агентам относятся альдегиды, в том числе формальдегид, глютаральдегид и глицидальдегид, из которых наиболее часто используют формальдегид. К алкирующим агентам относятся бетапропиолактон, этиленимин и другие азиридины.

Механизм действия инактивирующих агентов, вероятно, заключается в следующем: 1) взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами, они делают невозможной их репликацию; 2) вызывают ретикуляцию белков.

Механизм действия инактивирующих агентов лучше изучен применительно к белкам, чем к нуклеиновым кислотам, хотя в целом остается не полностью выясненным. Инактивация вирусов, кажется, основывается на двойном действии ретикуляции белков, взаимодействующих с клеточными рецепторами, и блокаде репликации нуклеиновых кислот. Необходимая концентрация инактивирующих агентов зависит, главным образом, от относительной концентрации белков и нуклеиновых кислот в инактивируемой среде. Температура и гомогенность инактивируемого субстрата также играют ключевую роль в кинетике инактивации вируса.

Возможность обратимости изменений реактивных групп (аминогруппа лизина, фенольные ядра тирозина) необходимо учитывать, особенно в случае использования формальдегида.

Полнота инактивации вируса должна определяться сразу после изготовления вакцины.

Наиболее общепринятыми инактивирующими агентами являются формальдегид, бета-пропиолактон и этиленимин. Одним из преимуществ бета-пропиолактона, используемого для изготовления вакцины против бешенства, и этиленимина, применяемого в изготовлении вакцины против ящура, является то, что они полностью гидролизуются в течение нескольких часов с образованием нетоксичных продуктов.

Формальдегид инактивирует вирусы благодаря высокой реакционной способности в отношении белков и нуклеиновых кислот. Он вступает в соединение не только с вирусными частицами, но и с многочисленными компонентами среды, в которую его добавляют.

Механизм инактивации вирусов формальдегидом сложен и характеризуется двумя типами реакций. Взаимодействие формальдегида с нуклеиновой кислотой и белками вируса протекает, соответственно, по типу реакции первого и второго порядка. Наиболее существенна для инактивации первая, которая, однако, в значительной мере зависит от второй.

Взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами и белками, формальдегид реагирует в основном с аминогруппами. Присоединение формальдегида к аминогруппам пуринов и пиримидинов уничтожает матричную и информационную активность нуклеиновых кислот.

Формальдегид с большей скоростью взаимодействует с аминогруппами аминокислот и белков с образованием метилольных производных, чем с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот. Сложилось представление, что с белками и нуклеиновыми кислотами вирусов формальдегид реагирует в две стадии. Вначале, в результате взаимодействия формальдегида с амино- или иминогруппами, быстро образуются весьма нестабильные метилольные производные, а затем, в результате вторичных реакций — бисметиленовые производные.

Продукты взаимодействия формальдегида с аминокислотами способны вступать в реакцию с нуклеиновыми кислотами значительно быстрее, чем сам формальдегид.

Во второй стадии происходит медленное взаимодействие первичных продуктов реакции с другими группами белков, в результате чего образуются ковалентно связанные димеры полипептидов. При этом уплотняется белковая оболочка и уменьшается ее проницаемость. Вследствие этого снижается скорость инактивации вируса. Под влиянием формальдегида в вирионах клещевого энцефалита образовывались гликопротеиновые димеры и комплекс РНК с белками нуклеокапсида. Последний отличался высокой стабильностью и разрушался только РНКазой. Предполагается, что образование этого комплекса — основной механизм инактивации вируса. Гликопротеин, экстрагированный из инактивированного вируса, обладал нормальной антигенной и иммуногенной активностью.

Следует отметить, что реакция формальдегида с аминогруппами обратима, то есть при удалении избытка реагента или разбавлении раствора активность нуклеиновой кислоты может быть восстановлена. Процесс взаимодействия вируса с формальдегидом зависит от таких факторов, как концентрация реагента, температура, рН среды.

При оптимальных условиях инактивации взаимодействие формальдегида с белками многих вирусов не оказывает значительного влияния на их антигенные свойства. Однако ряд вирусов теряет значительную часть антигенной активности при инактивации формалином. Это особенно касается оболочечных вирусов и, прежде всего, вирусов кори и респираторно-синцитиального (PC) вируса. Например, инактивирован-ная формалином вакцина против PC-вируса вызывала образование антител к белку F, которые не подавляли его инфекционную и симпластообразующую активность. Более того, вакцинация приводила к осложнению течения болезни при последующем ее возникновении. Вероятно, под действием формалина изменяются эпитопы гликопротеина, ответственные за индукцию вируснейтрализующих антител.

Это касается, прежде всего, поверхностного F белка, ответственного за протективный иммунитет. Однако многие из вирусов, которые относительно хорошо переносят инактивацию формалином, оказываются весьма чувствительными к изменениям ее условий. Повышение концентрации формальдегида в десять и более раз по сравнению с оптимальной (0,1%-ной) приводило к морфологическим изменениям поверхностного антигена вируса гепатита В и снижению его активности, а увеличение продолжительности обработки очищенного полиовируса сопровождалось значительным повреждением капсида некоторых вирионов. С целью смягчения повреждающего действия формальдегида на антигенность и иммуногенность вирусов стали применять стабилизирующие вещества. Установлено, например, что добавление арилдона (5,4 М) не влияет на инактивацию аттенуированных и вирулентных штаммов полиовируса формалином (1:4000, 37°С) и, в то же время, способствует сохранению иммуногенности за счет стабилизации D-антигена.

Применяют следующие методы консервации вирусов:

1) при хранении вирусного материала (кусочки органов или тканей) часто используют глицерин (50%-ный раствор на ИХН), который обладает бактериостатическим действием и в то же время защищает вирусы. При этом можно хранить несколько месяцев при 4С.

2) чаще всего хранят вирусы в холодильниках, обеспечивающих температуру -20, -30, -70С. При этой температуре некоторые вирусы без добавки защитных веществ сравнительно быстро теряют инфекционность. Хорошее защитное действие при замораживании и хранении вирусов оказывает добавка: инактивированной сыворотки крови или обезжиренного молока или 0,5-1,5% желатина.

3) Быстрая заморозка до минус 196С жидким азотом. Вирусы, чувствительные к низким значениям рН, следует замораживать в жидкостях, не содержащих однозамещенных фосфатов.

4) Лиофилизация – высушивание в замороженном состояние в условиях вакуума – очень хороший способ консервирования. В лиофилизированном виде вирусы могут храниться несколько лет.

Читайте также: IV. Требования к условиям реализации основной образовательной программы начального общего образования IV. Условия проведения Конкурса V. Условия конкурса. V. Условия проведения конкурса концертных направлений. V. Условия участия в фестивале и конкурсах VI. ПРОГРАММА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ КОНКУРСНЫХ ПРОСМОТРОВ VI. Условия участия в фестивале-конкурсе. АБВГД и ПП- агрессия бактерий, вирусов, грибов, дрожжей и простейших паразитов. Актуальность логистики в условиях экономики России Актуальность работы социального педагога в школе в современных условиях Анализ условия. Ареалы распространения вирусов.

Материал помещают в прочный стеклянный стерильный флакон объемом 20 - 40 мл с навинчивающимся металлическим колпачком с плотной резиновой прокладкой, в котором до 1/3 объема налита консервирующая жидкость, состоящая из смеси равных частей химически чистого глицерина и фосфатно-буферного раствора pH 7,4 - 7,6.

Цикл репродукции вирусов при продуктивной инфекции представляет собой специфическую последовательность событий, приводящих к образованию нового потомства вирионов. Его можно разделить на несколько стадий: адсорбция вирионов на поверхности клетки, проникновение вируса или вирусного нуклеопротеида внутрь клетки, депротеинизация генома, синтез вирусных компонентов, формирование и выход из клетки зрелых вирионов. Иногда не все стадии протекают последовательно и полностью даже при продуктивной инфекции. При заражении вирусной нуклеиновой кислотой отсутствует стадия депротеинизации. Цикл репродукции вируса может прерываться на какой-либо промежуточной стадии, и в этом случае инфекционные вирионы не образуются (абортивная инфекция).. Прикрепление (адсорбция) вирионов к поверхности клетки - первая стадия вирусной инфекции. Наиболее важным механизмом прикрепления вируса является специфическое взаимодействие рецепторов вируса с комплементарными рецепторами клетки. Прикрепление происходит за счет связи между вирионными прикрепительными белками на поверхности вирионов и рецепторами на плазматической мембране клеток.

Диагностика-комплексная. 1.Эпизотологический 2.клинический метод 3.патологоанатомический метод.Гистологический метод4.Лабораторный метод диагностики(вирусологический метод и серологический метод-поиск антител в сыворотке крови. Схема:1)Вирусологический(вирусосодержащий патматериал) 1.Обнаружение вируса:А).микроскопия мазков:обычная,люминесцентная:МФ и МФА,электронная Б).ИФА В).индикация в РГА,РГАд,ПЦР,ИФА. 2.Выделение.3.идентификация,типизация и дифференциация по диагностическим сывороткам РН,РСК,РИД,РИЭОФ,МФА,ИФА,РЗГА(РТГА),РЗГАд. 2).серологический-исследуемые сыворотки с диагностическим антигеном в РН,РСК,РИД,РИЭОФ,МФА,ИФА,РЗГА(РТГА),РЗГАд.

Противовирусный иммунитете. Его особенности. Виды иммунитета.ПИ-состояние невосприимчивости к вирусам. силы организма направлены на две формы существования вирусов: внеклеточную (покоящуюся) и внутриклеточная (вегетативная) на то, чтобы восстановить постоянство внутренней среды организма. Особенности:На вирус, находящийся вне клетки, действуют все факторы-спецические и неспецифические. Внутри клетки-ИФН. Ат не действуют внутри клетки и не после депротеинизации. Фагоцитоз незавершенный. Вирусы не обезвреживаются,могут размножаться в фагоците и транспортироваться по всему организму.Ингибиторы действуют на внеклеточный вирус. Блокируют их как антитела. ИФН. Защищает клетку изнутри. Защита на 3 уровнях: Молекулярном, клеточном и организменном. Врожденный иммунитет (естественный, не специфический, наследственный). Подразделяется на:Видовой Групповой Индивидуальный.Приобретенный иммунитет (специфический не наследственный):Естественно приобретенныйАктивный или постинфекционный Пассивный или плацентарный. Передается потомству. Может быть молозивным (через молоко)Трансовариальный. Передается через яйцо.Искусственно приобретенный после вакцинации. Создается через 2-3 недели.Пассивный (сывороточных)- образуется сразу.Стерильный Не стерильный

Миллиарды бактерий и вирусов окружают каждого человека. Многие из них вполне безобидны, и если у человека выработан хороший иммунитет, они не могут вызывать заболевания. Другие крайне агрессивны, могут повлечь за собой возникновение аллергии, раздражения, заболеваний. Поэтому врачи говорят, что необходимо соблюдать правила гигиены - проводить уборки, бороться с засорениями комнат и т.п.

К сожалению, простая уборка не может на 100% избавить человека от негативного влияния бактерий и вирусов. Эффективным подходом к гигиене считается дезинфекция - процесс уничтожения вредных микроорганизмов, который проводится целенаправленно.

Вирусы - это сложные структуры, так как избавиться от бактерий намного проще. Штаммы вирусов быстро адаптируются к новым условиям, “эволюционируют” в устойчивые виды. Поэтому не каждый способ дезинфекции способен защитить от всех напастей.

Виды дезинфекций против вирусов и бактерий

• текущая;
• профилактическая;
• заключительная.

Текущее обеззараживание - это очистка помещений от выявленного источника заражения. В больницах очистка палат проводится ежедневно, что позволяет удержать распространение инфекции.

Профилактический процесс проводится регулярно, он снижает риски распространения микроорганизмов. Это влажная уборка, мытье рук, стирка.

Заключительная дезинфекция проводится после текущего обеззараживания. Она проходит в помещениях, где раньше находился больной человек, так как микроорганизмы могут оставаться на поверхностях, с которыми он контактировал, и являться источником инфекции.

Методы уничтожения вирусов или бактерий

Конкретный способ обеззараживания следует выбирать индивидуально с учетом сложившихся обстоятельств.

• Механический способ - это избавление от предметов, на которых находится вирус (одежда больного, почва и т.д.).
• Физический способ - ошпаривание кипятком, применение УФ-ламп или автоклавов. Популярен в медицине.
• Биологический - в среду запускаются "полезные" бактерии, которые в процессе своей жизнедеятельности убивают вредных “собратьев”. Данный способ требует тщательного изучения среды для выявления места микроогранизмов в пищевой цепочке. Способ применяется в очистных сооружениях.
• Химический - самый распространенный способ очистки. Используются специальные вещества, которые приводят к неминуемой гибели вредных вирусов и бактерий.

Химическая обработка зарекомендовала себя в качестве универсального и эффективного варианта. Чаще всего при борьбе с микробами применяются хлорсодержащие, спиртосодержащие препараты, химия на основе активного кислорода, ПАВ, гуанидов, а также фенольные ядохимикаты и альдегидные.

Издавна хлоросодержашие средства используются для эффективной очистки поверхностей. Их разрушающая сила эффективно уничтожает многие виды бактерий, но не всегда может бороться с вирусами. Недостаток препаратов – явный вред для людей и окружающей среды.

Средства на основе активного кислорода - это перекись водорода, перманганат калия.

ПАВ – хорошие средства для уборки помещений, при этом вреда для здоровья и поверхностей не наблюдается. К сожалению, они уничтожают только некоторые виды бактерий.

Растворы с третичными аминами хорошо справляются с микроорганизмами, почти не токсичны для людей.

Спиртосодержащие вещества активно применяются для очистки поверхностей и их обеззараживания. Но они взрывоопасны, что является их главным недостатком, это влечет за собой неудобство в использовании.

Глутарал, бианол, лизоформин - альдегидные средства, которые убивают большинство микробов, но они очень токсичны. Гуанидовые дезинфектанты образовывают защитную пленку, при этом отличаются долгосрочным эффектом. Фенольные средства также удерживают продолжительный эффект, но они более токсичны.

Если вам требуется дезинфекция, но спецоборудования или дезвеществ в вашем арсенале нет - обратитесь за помощью в компанию "Здоровье нации" (г. Ханты-Мансийск). В работе мы используем только нетоксичные методы, которые эффективно избавляют от бактерий и вирусов.

Издревле люди пытались найти способ не дать пище испортиться в краткосрочный период. А если учесть, что периоды изобилия чередовались с временами неурожая, то навык сохранения продуктов на долгие месяцы был еще и навыком выживания в трудные времена. Так в кулинарных традициях разных народов появилось консервирование.

Для нас консервация в большей степени ассоциируется с солеными огурцами и помидорами в банках, с вареньем и компотом. Но на самом деле этот термин куда более емкий. Это любая обработка продуктов с целью их длительного хранения. Более того, консервированные продукты можно встретить в кухнях преимущественно северных народов, где в связи с климатическими условиями пищу приходилось заготавливать с лета на долгие осенние и зимние месяцы. Но даже сегодня, когда доступ к свежим продуктам имеется во всех развитых странах, наша любовь к заготовкам ничуть не ослабевает. Кто-то предпочитает покупать консервации в магазине. А кому-то в радость делать заготовки здоровыми способами без помощи химических добавок для себя и своих близких. Итак, давайте разберемся, какое консервирование существует.

1. Квашение

Эта методика по праву считается традицией русской кухни, о чем свидетельствуют источники 12 века. К тому же оно применяется чаще всего при заготовке растительной продукции. О квашеной капусте, наверняка, слышали все. Но кроме нее квасить можно огурцы, томаты, яблоки и даже арбузы.

Суть способа заключается в том, что в сладкой среде постепенно начинаются процессы брожения. Они тормозят размножение микроорганизмов. Так что продукт сохраняется в съедобном виде длительный период времени. Но при этом следует помнить: чтобы обеспечить более длительный срок хранения квашеных овощей и фруктов, хранить их надлежит в прохладном помещении. Об этом знали и наши предшественники, приспосабливая для этих целей погреба.

2. Соление

Этот вид консервации хорош тем, что может эффективно применяться для продуктов как растительного, так и животного происхождения. Кстати, засолку также часто и охотно использовали предыдущие поколения.

Здесь работает основополагающий принцип – при концентрации соли в продукте, превышающей 10% от его общей массы, гнилостные процессы замирают и останавливаются. Так что соленая пища хранится долго и при этом сохраняет значительную часть своих вкусовых качеств.

3. Высушивание

Для размножения микроорганизмов, как правило, необходима влажная среда. Высушивая мясо, рыбу, овощи или фрукты естественным путем на солнце или с помощью специальной сушилки, мы создаем неблагоприятные для условия для бактерий. Так что это консервирование сохраняет съедобность продукта на долгие месяцы.

4. Стерилизация и пастеризация

Это самый популярный в наши дни метод консервирования. Он осуществляется в нагревании продукта в герметичной таре при определенной температуре. Это также провоцирует гибель потенциально опасной бактериальной среды.

Стерилизация осуществляется при температуре кипения – это 100 градусов по Цельсию, а пастеризация – от 85 до 90. Цель пастеризации – сохранить как можно больше содержащихся в продукте полезных веществ. Ведь они разрушаются при воздействии экстремального температурного фона. Но здесь есть и недостаток – потенциал длительности хранения пастеризованных консерв будет меньше, чем стерилизованных.

Поделитесь постом с друзьями!

Коллекционирование вирусов патогенных или условно-патогенных для человека имеет целью сохранение генофонда вирусов XX и XXI столетий для настоящих и будущих поколений исследователей. Собрать типовые штаммы, международные стандарты, производственные и селекционированные, в лабораториях или выделить от больных людей, животных и переносчиков - это лишь часть коллекционной задачи. Необходимо сохранить оригинальные штаммы вирусов на многие десятилетия без изменений их первоначальных свойств - биологии, антигенной и генетической структуры, иммуногенной потенции. Лучше всего хранить штаммы без пассажей многие десятилетия. Такие методы консервации разработаны в ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН в Государственной Коллекции вирусов РФ (ГКВ) .

Согласно международной классификации 2005 г., насчитывается 30 семейств вирусов I-IV групп патогенности для человека, но из них только 20 семейств относятся к II-IV группам патогенности, с которыми можно работать в институтах, биопроизводствах и лабораториях вирусологического профиля в больших городах с многомиллионным населением. Поэтому в ГКВ, функционирующей на базе ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (г. Москва), хранятся коллекционные штаммы вирусов II-IV групп, всего 18 семейств вирусов около 3000 штаммов.

Кроме того, ГКВ содержит 9 штаммов прионов и 59 штаммов 7 видов хламидий двух родов: Chlamydia и Chlamydophilia семейства Chlamydiaceae .

ГКВ ведет коллекционирование и сохраняет в активном состоянии типовые штаммы вирусов, выделенные в нашей стране и за рубежом, с учетом их потенциальной ценности для развития теоретических основ медицинской и биологической наук, для изучения этиологии и эпидемиологии заболеваний человека, разработки диагностических и профилактических препаратов. ГКВ выполняет функции коллекционного центра вирусов.

Нужно подчеркнуть, что многие учреждения вирусологического профиля имеют свои рабочие коллекции, а лучшие, изученные, оригинальные штаммы депонируют в ГКВ с целью патентной процедуры, чтобы получить удостоверение о депонировании оригинального авторского штамма и номер ГКВ. Это удостоверение необходимо для последующего патентования созданных авторами препаратов из этого производственного штамма, а также при защите диссертационной работы. Но, самое главное, ГКВ обеспечивает длительное хранение штамма без пассажей, штамм становится достоянием государства - Российской Федерации. Хранение штамма без пассажей обеспечивает чистоту штамма, сохраняет его от возможных контаминации при пассажах.

В настоящее время наилучшими методами длительного хранения большинства вирусов, хламидий и прионов признаны хранение в жидком азоте (-196*С) и консервация с помощью лиофилизации, т.е. высушивание под вакуумом из замороженного состояния.

В этом разделе обобщены результаты многолетнего (до 60 лет) опыта работы ГКВ по депонированию, коллекционированию и консервации вирусов, прионов и хламидий для длительного хранения с помощью лиофильного высушивания. Все исследования проводились на десятках депонированных штаммах каждого вируса из 18 семейств. Методы консервации штаммов на основе лиофильного высушивания и подбора эффективных температур хранения, разработанных в ГКВ, позволили сохранить без пассажей жизнеспособными все патогенные для человека вирусы из 18 семейств, 59 штаммов хламидий из семейства Chlamydiaceae и 9 штаммов прионов . Этот феномен является самым существенным для коллекционной работы, т.к. позволяет сохранять многие десятилетия неизменной первичную биологию штамма.

Необходимо отметить, что все национальные и государственные коллекции многих стран в настоящее время хранят вирусы, прионы и хламидий в жидком азоте (-196*С) или в виде лиофилизированных сухих суспензий при температуре -20, -40 или -60*С.

Как показали исследования, можно зафиксировать исходные свойства, структуру и характеристики штамма на многие десятилетия путем лиофилизации с оптимальными наполнителями, с определением постоянной эффективной температуры последующего хранения (-20, -40 или -60*С).

Отработаны режимы лиофилизации и длительного хранения лиофилизированных штаммов вирусов, прионов и хламидий без изменений их исходной биологии и генетической структуры. Это дает возможность не только сохранить генофонд штаммов XX и начала XXI в., но и обеспечить стандартными производственными и типовыми штаммами производства и НИИ вирусологического профиля в масштабах Российской Федерации и стран СНГ, а также стран дальнего зарубежья по их запросам.

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к культивированию и долгосрочной стабилизации биологических свойств вирусов, и может быть использовано в биологической промышленности, медицине и ветеринарии. Целью изобретения является повышение сохранности вируса. Для этого замораживание осуществляют со скоростью 0,2 0,8°С/мин, после чего погружают в жидкий азот и замораживают до -196°С.

РЕСПУБЛИК (51)-5 С 12 N 7/00

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4675353/13 (22) 06.04.89 (46) 15.06.91. БюлЛФ22 (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (72) А.А.Цуцаева, М.Ю.Стегний и Т.Ф.Петренко (53) 66.099.4 (088.8) (56) Лярски 3. Хранение вируса в замороженном состоянии. Диагностика вирусных болезней животных, М.: Колос, 1980, 139—

Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание вирусосодержащих препаратов. — В кн.:

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к культивированию и долгосрочной стабилизации биологических свойств вирусов, и может быть использовано в биологической промышленности, медицине и ветеринарии.

Целью изобретения является повышение сохранности вируса.

Для этого в способе консервирования вируса, включающем замораживание до

70 С с последующим хранением, замораживание осуществляют со скоростью 0;2—

0,8 С/мин, после чего погружают в жидкий азот и эамораживают до - 196 С.

Замораживание осуществляют в два этапа: сначала со скоростью 0,2—

0,8 C /ì и н до -70 С, а затем путем погружения в жидкий азот до -196 С и хранят при этой температуре.

Пример 1. Монослойную перевиваемую клеточную культуру почки теленка (ПТ) инфицируют вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, штамм

"Молдавский" по общепринятой методике.

В качествероддерживающей среды испольЯЛ 1655984 А1

Замораживание и высушивание биологических препаратов, M,: Колос, 1971. c,65 — 69. (54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА. (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к культивированию и долгосрочной стабилизации биологических свойств вирусов, и может быть использовано в биологической промышленности, медицине и ветеринарии. Целью изобретения является повышение сохранности вируса.

Для этого замораживание осуществляют со скоростью 0,2 -- 0,8 С/мин, после чего погружают в жидкий азот и замораживают до

-1960C. зуют среду 199. После полной дегенерации монослоя клеток полученную вирусосодержащую суспензию очищают от клеточного детрига центрифугированием при

16000 об/мин. После этого вирусную суспензию расфасовывают в контейнеры из нержа веющей стали и с помощью поограммного замораживателя охлаждают от+6 до -70 С со скоростью 0,2 С/мин, после чего погружают в жидкий азот и замораживают до -196 С и хранят в течение 1,5 лет.

Размораживают на водяной бане при +40 С

Контролем служит вирус, не подвергнутый замораживанию. О сохранности размороженного вируса судят по его инфекционному титру, который определяют по цитопатическому действию (ЦПД) на перевиваемую клеточную культуру ПТ. Вычисление титра проводят методом РИДА и

МЕН4А. Инфекционный титр размороженного вируса соответствует контролю и равен

Ig 5,32 0,22 ЦПД 50/мл, Пример 2. Вирус инфекционного

9инотрахеита консервируют способом, описанным в примере 1, охлаждение от +6 до

Составитель И. Агафонова

Редактор Т. Лазоренко Техред М.Моргентал Корректор Т. Палий

Заказ 2030 Тираж 366 Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, уп.Гагарина, 101

-70 С осуществляют со скоростью

Инфекционный титр размороженного вируса равен Ig 5,32 +é 0,22 ЦТД 50/мл и соответствует контролю.

Способ консервирования вируса инфекционного ринотрахеита, включающий замораживание его до -70 С с последующим хранением, отличающийся тем, что, с целью повышения сохранности вируса, замораживание до -70 С осуществляют со ско5 ростью 0,2 — 0,8 С/мин, далее замораживают до -196 С и хранят при этой же температуре.

Лекция №4 Вирусология 1.Сохранность вирусов в природе. 2.Устойчивость вирусов к физическим и химическим факторам. 3.Инактивация вирусов полная или частичная. 4.Генетика и изменчивость вирусов.

Наиболее полно изучена устойчивость внеклеточных вирусов при воздействии ряда физических и химических факторов: A) t, ионизирующего, рентгеновского, УФ и светового излучения, ультразвука, давления, высушивания;

Б) рН среды, гниению, высушиванию, к жирорастворимым растворителям - эфиру, хлороформу; B) к химическим препаратам – фенолу, щелочам, формалину. B) к химическим препаратам – фенолу, щелочи, формалину.

Rotavirus_TEM_B82-0337_lores.jpg An electron micrograph of multiple polyomavirus virions

Устойчивость Vir во многом зависит от вида Vir, строения (липидсодержащие-чувствительны к эфиру, хлороформу), от дозы, среды, экспозиции и концентрации препарата.

Избирательная устойчивость передаётся по наследству, генетически закреплена и учитывается при классификации, при изготовлении вакцин, при проведении дезинфекции, стерилизации, хранении и консервации.

В зависимости от того на что действует фактор инактивация Vir может быть полная или частичная. Полная инактивация-потеря всех биологических свойств вируса, т.е. изменение вирусной NK и белка. Полная инактивация при дезинфекции, стерилизации.

• Палочковидная частица вируса табачной мозаики. Цифрами обозначены: (1) РНК-геном вируса, (2) капсомер, состоящий всего из одного протомера, (3) зрелый участок капсида.

Если фактор действует только на белковую оболочку вирусов теряются антигенные свойства. Если только на NK, не задевая свойств белка, то теряется инфекционная активность, а свойства белка сохраняются. Неполная инактивация используется при изготовлении убитых вакцин.

Первой страдает белковая оболочка-капсид. Может быть расслаивание, расщепление (гидролиз) с последующим распадом на отдельные морфологические единицы, или коагуляция и уплотнение белков с сохранением общей структуры оболочки.

Расщепление или распад м.б. в кислой или щелочной среде, или при продолжительном, но слабом нагревании-t до +50°С. При t до +50°С вирусная НК обнажается и подвергается разрушительному действию слабой t. Это используется при изготовлении термических вакцин.

При воздействии более высоких t, воздействии формалина или фенола в высоких концентрациях идёт коагуляция или уплотнение белковой оболочки. Во внутрь вирионов фактор не проникает. Формальдегид в низких концентрациях действует как на NK, так и на белок.

Инактиваторы, применяемые для изготовления вакцин: слабое нагревание, формалин, УФЛ, ультразвук, -пропиолактон, гидроксиламин, солнечные и рентгеновские лучи. Оптимальным условием хранения - быстрое замораживание в жидком азоте - 196°С. При наличии в среде белков-устойчивость Vir при замораживании повышается (0,5-1% желатина, или сухое обезжиренное молоко 20-30%, сыворотка крови здоровых животных 10-50%, 1-5% пептона.

Идеальный способ хранения-высушивание из замороженного состояния под вакуумом (лиофильное высушивание) вирусы высушенные таким образом можно хранить годами. К УФ лучам-Vir более устойчивы чем бактерии. Очень устойчивы к ионизирующему облучению, УЗ. Для Vir оптимален рН среды 7,2-7,4. С целью проведения дезинфекции очень эффективно применять хлорсодержащие препараты, растворы щелочей, формалина 2-3%, фенола 3-5%. В этих случаях Vir теряют

активность, обезвреживаются. При длительном хранении в лабораториях Vir нужно периодически освежать, т.е. пропускать через чувствительную модель-лабораторных животных, К.Э., КТ.

2. Генетика и изменчивость Vir. Вирусы, как все живые существа обладают свойством наследственности и подвержены изменчивости. У вирусов, как и у других организмов различают: Генотип определяется структурой наследственного материала, ДНК или РНК, т.е. последовательностью нуклеотидов в их молекулах. Это постоянное свойство вируса и меняется в результате мутаций, происходящих в геноме; Фенотип - совокупность всех

признаков и функций данного вируса. Может изменяться под влиянием внешних условий и в результате мутаций. Внутри вирусной популяции вирусы имеют генетическую неоднородность. Иногда различия м.б. значительные.

Генофонд-генетический состав вирусной популяции, т. е. Совокупность всех генов которые имеются у вирусов составляющих данную популяцию. Обеспечивает выживаемость и приспосабливаемость данного Vir.

Генофонд у вирусной популяции создаётся и пополняется за счёт 4-х источников: 1)мутации; 2) рекомбинации; 3) включение в вирусный геном генетического материала хозяина; 4)притока генов из генофонда других вирусных популяций.

Ген-структурная единица в НК, материальная основа наследственности, у вирусов это участок ДНК или РНК. Геном у вирусов представлен различными формами НК (линейная, сигментированная или фрагментированная) и состоит из генов.

Каждый ген кодирует свой определённый белок. 3 нуклеотида (триплеты или кодоны) в односпиральных молекулах или три пары нуклеотидов в двуспиральных молекулах кодируют одну аминокислоту. По наследству у Vir передаётся тип НК, форма Vir, тропизм, размер, устойчивость к физ. и хим. факторам, антигенная структура, патогенность к кругу хозяев, культуральные свойства. Передаются не сами признаки и свойства, а способность к их развитию ч/з гены. Реализация этой способности зависит от условий среды.