Иммунобиологические препараты для профилактики гриппа и

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЯ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ЧИТИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

Кафедра микробиологии с вирусологией и иммунологией

тема: Иммунобиологические препараты для диагностики, лечения, профилактики инфекционных заболеваний

Выполнила: Иванцова Е.С.

факультет ВСО, заочного

обучения, курс 2, группа 252

1. Иммунобиологические препараты

2. Иммунобиологические препараты для профилактики инфекционных заболеваний

3. Иммунобиологические препараты для лечения

5. Лечебные препараты обще клинического значения

6. Иммунобиологические препараты для диагностики

Иммунология (от иммунитет и logos — слово, учение), наука о защитных свойствах организма, его иммунитете. Изучает общебиологические основы иммунитета, его происхождение и эволюцию (иммунобиология), генетическая обусловленность его факторов, внутривидовое разнообразие и наследование тканевых антигенов (иммуногенетика), химическое строение и свойства антител и антигенов и закономерности их взаимодействия (иммунохимия). Практическая (клиническая) иммунология использует иммунологические реакции для профилактики, диагностики и лечения ряда заболеваний. Возникновение иммунологии как самостоятельной науки связано с именами Л. Пастера, П. Эрлиха, И. И. Мечникова.

Иммунитет (от лат. immunitas — освобождение, избавление), способность живых существ противостоять действию повреждающих агентов, сохраняя свою целостность и биологическую индивидуальность; защитная реакция организма. Наследственный иммунитет обусловлен врожденными особенностями организма (фагоцитоз, защитные свойства кожи и слизистых оболочек, система комплемента, пропердин и др.). У позвоночных животных и человека имеется также способность к приобретению активного иммунитета в ответ на инфекцию или введение вакцин. Она обусловлена функциями клеток иммунной системы (иммуноцитами), центральное место, среди которых занимают лимфоциты (происходящие от них плазматические клетки вырабатывают антитела). Приобретенный пассивный иммунитет развивается при передаче антител ребенку с молоком матери или при искусственном введении антител

Иммунопатология (клиническая иммунология), раздел иммунологии, изучающий патологические процессы, которые обусловлены качественно или количественно измененными реакциями иммунитета.

Иммунопрофилактика, предупреждение инфекционных заболеваний человека и животных путем иммунизации вакцинами (напр., против дифтерии, сибирской язвы) или сыворотками (серопрофилактика).

Иммунотерапия, лечение инфекционных и некоторых других заболеваний с помощью вакцин, анатоксинов, сывороток и гамма-глобулинов.

1. Иммунобиологические препараты

Все средства, применяемые для воздействия на иммунную систему, известны как иммунобиологические препараты.

Иммунопрофилактика - метод индивидуальной или массовой защиты населения от инфекционных заболеваний путем создания или усиления искусственного иммунитета.

Иммунопрофилактика инфекционных болезней регламентируется законами РФ (см. выше).

Вакцинация - это самое эффективное и экономически выгодное средство защиты против инфекционных болезней, известное современной медицине.

Вакцинация - это введение в организм человека, ослабленный или убитый болезнетворный агент (или искусственно синтезированный белок, который идентичен белку агента) для того, чтобы стимулировать выработку антител для борьбы с возбудителем заболевания.

Среди микроорганизмов, против которых успешно борются при помощи прививок, могут быть вирусы (например возбудители кори, краснухи, свинки, полиомиелита, гепатита А и В и др.) или бактерии (возбудители туберкулеза, дифтерии, коклюша, столбняка и др.).

Чем больше людей имеют иммунитет к той или иной болезни, тем меньше вероятность у остальных (неиммунных) заболеть, тем меньше вероятность возникновения эпидемии.

Выработка специфического иммунитета до протективного (защитного) уровня может быть достигнута при однократной вакцинации (корь, паротит, туберкулез) или при многократной (полиомиелит, АКДС).

Ревакцинация (повторное введение вакцины) направлена на поддержание иммунитета, выработанного предыдущими вакцинациями. К сожалению, вакцинам свойственны те или иные отрицательные побочные действия на организм вакцинируемого.

Следует иметь в виду, что вакцинация не всегда бывает эффективной. Нередко вакцины теряют свои качества при неправильном их хранении. Кроме того, иногда введение вакцины не приводит к выработке достаточного уровня иммунитета, который бы защитил пациента от болезнетворного агента.

· профилактические и лечебные препараты микробного происхождения (вакцины, бактериофаги, эубиотики, анатоксины);

· лечебные иммунные препараты (цитокины);

· диагностические иммунные препараты (антисыворотки), а также диагностические бактериофаги и аллергены;

· иммуномодуляторы (различные синтетические препараты, биостимуляторы природного происхождения).

Иммунобиологические препараты могут проявлять активное или пассивное, специфическое или неспецифическое действие:

· Активное действие состоит в индуцировании препаратами иммунных реакций. Такими эффектами обладают вакцинные препараты, изготавливаемые на основе живых ослабленных или убитых микроорганизмов, а также продуктов их жизнедеятельности.

· Пассивное действие – эффекты препаратов, представляющих собой эффекторные продукты иммунокомпетентных клеток. Такими эффектами обладают цитокины и другие иммунобиологические препараты.

· Специфическое действие проявляют препараты, обеспечивающие защиту от конкретного возбудителя (противокоревая вакцина, столбнячный анатоксин).

· Неспецифическое действие оказывают препараты, неизбирательно стимулирующие функции иммунокомпетентных клеток. Такой эффект оказывают иммуномодуляторы, многие биостимуляторы и другие препараты.

2. Иммунобиологические препараты для профилактики инфекционных заболеваний

1. Живые вакцины содержат ослабленный живой микроорганизм. Примером могут служить вакцины против полиомиелита, кори, свинки, краснухи или туберкулеза. Они способны размножаться в организме и вызывать выработку защитных факторов, которые обеспечивают невосприимчивость человека к патогену. Утрата вирулентности у таких штаммов закреплена генетически, однако у лиц с иммунодефицитами могут возникнуть серьезные проблемы.

2. Инактивированные (убитые) вакцины (например цельноклеточная вакцина против коклюша, инактивированная вакцина против бешенства), представляют собой патогенные микроорганизмы, инактивированные (убитые) высокой температурой, радиацией, ультрафиолетовым излучением, спиртом, формальдегидом и т.д. Такие вакцины реактогенны и в настоящее время применяются редко (коклюшная, против гепатита А).

3. Химические вакцины содержат компоненты клеточной стенки или других частей возбудителя.

4. Анатоксины - это вакцины, состоящие из инактивированного токсина продуцируемого бактериями. В результате специальной обработки токсические свойства его утрачиваются, но остаются иммуногенные. Примером анатоксинов могут служить вакцины против дифтерии и столбняка.

5. Рекомбинантные вакцины получают методами генной инженерии. Суть метода: гены болезнетворного микроорганизма, отвечающие за синтез определенных белков, встраивают в геном какого - либо безвредного микроорганизма (например кишечная палочка). При их культивировании продуцируется и накапливается белок, который затем выделяется, очищается и используется в качестве вакцина. Примером таких вакцин могут служить рекомбинантная вакцина против вирусного гепатита B, вакцина против ротавирусной инфекции.

6. Синтетические вакцины представляют собой искусственно созданные антигенные детерминанты (белки) микроорганизмов.

7. Ассоциированные вакцины. Вакцины различных типов, содержащие несколько компонентов (например, АКДС).

Вакцины – иммунобиологические препараты, предназначенные для активной иммунопрофилактики, т.е. для создания активной специфической невосприимчивости организма к конкретному возбудителю.

1. Активные и иммунизированные антигены (Ar);

2. Жидкая основа;

3. Консерванты, стабилизаторы, антибиотики;

4. Вспомогательные средства.

АКДС, АДС, АДС-м, ИНВ, гриппозные вакцины;

АКДС + Хиб, АКДС + ВГВ, АКДС + Хиб + ВГВ, АКДС + ИПВ + Хиб;

АКДС +Хиб + ВГВ + ИНВ;

ВГА + ВГВ, ВГА + Тиф;

Менингит А+С, Менингит А+С+W+Y, Пневмо 23

Живые вакцины: ОПВ (полиомиелит), ММR (корь, паротит, краснуха), MR, MMR+V (ветряная оспа)

3. Иммунобиологические препараты для лечения

Иммуноглобулин G (IgG) является преобладающим иммуноглобулином сыворотки, составляя около 75 % общих иммуноглобулинов и 10-20 % общего белка сыворотки. IgG представляет собой двойную, зеркально-отраженную молекулу, каждая сторона которой содержит одну тяжелую гамма-цепь и одну легкую цепь класса лямбда, либо каппа. В нормальной сыворотке содержится 4 подкласса IgG, при наивысшем содержании IgGI.

IgG особенно важен для долговременной защиты организма от инфекции; дефицит IgG сопровождается возвратной и часто тяжелой пиогенной инфекцией. Дефицит индивидуальных подклассов, особенно IgGI, также способен ослаблять сопротивляемость организма к инфекции. Синтез IgG и его сывороточный уровень возрастают в ответ на хроническую или возвратную инфекцию или аутоиммунное заболевание. Многие клинически важные аутоантитела относятся к классу IgG, включая антиядерные, некоторые антиэритроцитарные антитела и антитела против основной мембраны. Самой частой формой множественной миеломы является миелома типа IgG: в 77 % случаев обнаруживают подкласс IgGI .

Главным средством защиты организма человека от вирусных и бактериальных инфекций является иммунная система. Но из-за неправильного образа жизни она у современных людей часто не выполняет своих функций. Поэтому все больше сейчас создается лекарств, которые воздействуют на иммунитет человека, стимулируя его. Такие иммунобиологические препараты начали применяться более 100 лет назад. Сначала они создавались из веществ биологического происхождения, сейчас научились производить их синтетические заменители. Существует много разных их видов, и только некоторые поступают в свободную продажу.

Характеристика иммунобиологических препаратов

В основном такие средства производятся из крови и тканей человека или животных. Используется также выращивание микроорганизмов в специальной питательной среде. В последнее время иммунобиологические препараты производятся путем создания рекомбинантной ДНК. Такие синтетические средства по эффективности не уступают натуральным. Эти лекарства могут сильно отличаться не только по способу производства, но и по особенностям применения. Их объединяет только то, что они воздействуют на организм человека через его иммунную систему. Выпускаются в виде таблеток, растворов для инъекций, свечей, аэрозолей или суспензий.

Что же такое иммунобиологические препараты? Это различные вакцины, анатоксины, противомикробные сыворотки, иммуноглобулины, интерфероны, ферменты и бактериофаги. Среди более распространенных средств, воздействующих на иммунитет человека, можно выделить эубиотики, пробиотики, иммуномодуляторы и адаптогены. Сейчас популярным стало принимать разные биологически активные добавки, многие из которых тоже относятся к этой группе средств.

Классификация

О снижении иммунитета человека и необходимости воздействовать на него говорят уже много лет. И те, кто заботится о своем здоровье и хочет защитить себя и близких от инфекций, интересуются, какие бывают иммунобиологические препараты. Список их сейчас довольно большой, создаются все новые лекарства. Но все их можно поделить на 5 групп по особенностям состава и характеру воздействия на организм:

Первая группа – это иммунобиологические препараты, получаемые из живых или мертвых микроорганизмов. В основном это различные вакцины, анатоксины и сыворотки, применяемые для профилактики и лечения тяжелых инфекционных заболеваний. К этой группе относятся также бактериофаги, представляющие собой вирусы, уничтожающие бактерии, и пробиотики – средства на основе непатогенных микроорганизмов.

Есть еще иммунобиологические препараты, созданные из особых антител, которые вырабатываются организмом в ответ на атаку бактерий и вирусов. Это различные иммуноглобулины, сыворотки и ферменты. Они входят во вторую группу.
Третья группа препаратов – это средства для стимуляции иммунной системы человека. Их называют иммуномодуляторами, и применяются они для лечения и профилактики вирусных и бактериальных инфекций. В основном это различные интерфероны.
К иммунобиологическим средствам четвертой группы относят адаптогены – вещества чаще всего растительного происхождения: экстракты трав, биологически активные добавки и витамины.
К последней группе относятся иммунобиологические препараты для диагностики различных инфекционных заболеваний и определения аллергенов.

Интерферон альфа

Что такое бактериофаг

Инструкция к таким препаратам рекомендует применять их только после обследования и назначения врача. Ведь бактериофаги – это вирусы, которые уничтожают бактериальные клетки. Но живут они только в определенных микроорганизмах. Поэтому неправильно выбранный препарат может навредить. В зависимости от заболевания назначаются стрептококковый, дизентерийный, псевдомонадный или стафилококковый бактериофаг. Инструкция к таким препаратам рекомендует применять их внутрь или наружно при различных бактериальных инфекциях. Уже доказано, что бактериофаги имеют много преимуществ перед антибиотиками:

не уничтожают полезные бактерии;
не вызывают привыкания;
не нарушают иммунную систему человека;
микроорганизмы не могут стать к ним невосприимчивыми;
не имеют противопоказаний и побочных действий.

Другие часто используемые препараты

В последние годы все чаще и врачи, и пациенты обращаются для лечения не к антибиотикам, а к средствам для стимуляции иммунитета. Хотя многие считают эти лекарства бесполезными. Но для профилактики и в комплексном лечении бактериальных и вирусных инфекций они назначаются и взрослым, и детям. Есть несколько групп распространенных и известных многим иммунобиологических препаратов:

Особенности применения таких лекарств

Несмотря на то что эти препараты считаются безопасными и редко вызывают побочные действия, принимать их можно только по рекомендации врача. Кроме того, есть и другие особенности использования таких средств:

в большинстве случаев хранение иммунобиологических препаратов должно производиться в холодильнике;
необходимо строго соблюдать инструкцию при приеме этих лекарств;
чаще всего они применяются в комплексном лечении, так как действие их может проявиться не сразу.

Многие иммунобиологические препараты применяются только в медицинском учреждении, например, вакцины, сыворотки и некоторые иммуноглобулины. Другие же используются для укрепления и стимуляции иммунной системы. Ведь именно иммунитет – это то, что защищает человека от инфекций.

Сегодня производство вакцин представляет собой крайне необходимое направление в фармацевтике, которое позволяет создавать иммунобиологические препараты для профилактики опасных инфекционных заболеваний. В процессе создания современных вакцинных средств задействованы передовые технологии, последние открытия генной инженерии и научные изобретения в сфере иммунопрофилактики инфекций.

Разные вакцины в настоящий момент используются по всему земному шару. Прививки с их помощью включены в Национальные календари вакцинации во всех цивилизованных странах мира.

Они позволяют предупреждать эпидемиологические процессы на территориях с неблагоприятной обстановкой и даже искоренять смертельно опасные недуги (к примеру, благодаря вакцинам человечеству удалось победить бубонную чуму и черную оспу). Что собой представляют вакцины? Где целесообразно применять иммунобиологические препараты, а когда от их употребления лучше отказаться?

Что такое МИБП: расшифровка и область применения

МИБП или медицинские иммунобиологические препараты – специальные лекарственные средства биологического происхождения, которые предназначены для профилактики, диагностики и лечения заболеваний инфекционной и аллергической природы.

МИБП получают путем сложных микробиологических приемов, включая:

культивирование штаммов патогенных микроорганизмов;
размножение в лабораторных условиях клеток эукариот;
экстракция биологических веществ их жидких сред и тканей живых организмов (человека, животных, растений);
репродукция микробных агентов в эмбрионах;
использование технологии рекомбинантной РНК.

Как правило, производство таких препаратов находится под строгим контролем государственных органов, а для их приобретения необходим рецепт от врача. МИБП используются для специфической иммунопрофилактики инфекционных заболеваний, а также в процессе их лечения, который носит название иммунотерапии.

Лекарственные средства из микроорганизмов или содержащие антигены применяются в процессе диагностики инфекционных патологий или аллергий. К примеру, иммунобиологический препарат Туберкулин предназначен для быстрого определения инфицирования пациента туберкулезной палочкой.

Какие лекарственные препараты относятся к иммунобиологическим?

МИБП предназначены для создания активного или пассивного иммунного ответа, определения наличия иммунной протекции, диагностики присутствия в организме приобретенного специфического изменения иммунитета на аллергены.

вакцины – иммунобиологические препараты, введение которых позволяет сформировать иммунитет к определенным инфекционным заболеваниям;
анатоксины – лекарственные средства, которые происходят из токсинов и не имеют токсических свойств, а, наоборот, стимулируют выработку антител к исходному токсическому веществу;
сыворотки – иммунобиологический препарат крови, полученной от человека или животного, который содержит готовые антитела к определенному антигену;
иммуноглобулины – высокоочищенные и концентрированные лекарственные препараты гамма-глобулиновой фракции белков сыворотки крови, которые содержат высокие титры антител, расположенных на их оболочках;
аллергены – лекарственные средства с противоаллергической активностью.

Вакцины как иммунобиологические препараты

Вакцины представляют собой сложные медикаментозные иммунобиологические препараты, в состав которых входят специфические антигены, а также определенные стабилизаторы, адъюванты, консерванты, необходимые для нормального хранения и продления срока годности средств.

Вакцины предназначены для специфической профилактики инфекционных заболеваний. Большинство из них вводятся в детском возрасте в качестве иммунопрофилактики опасных инфекционных патологий.

С помощью вакцин человечеству удалось победить смертельно опасные инфекции, которые веками уносили тысячи жизней по всему земному шару.

Действительно, изобретение этих иммунобиологических профилактических средств дало возможность навсегда забыть о таких грозных инфекционных недугах, как чума и черная оспа, ликвидировать эпидемические процессы в странах третьего мира и на территориях, неблагоприятных в эпидемиологическом плане, а также научило человечество искусственно создавать активный иммунитет, защищающий от большинства известных сегодня патогенных микроорганизмов.

Виды МИБП-вакцин

Препараты для вакцинации населения против инфекционных болезней по основным качественным характеристикам делятся на три основных вида:

живые вакцины, основу которых составляют ослабленные патогенные агенты, не способные спровоцировать развитие заболевания, а только стимулирующие выработку иммунитета в ответ на введение в организм чужеродного материала (к живым вакцинным препаратам относятся иммунные средства против полиомиелита, ротавирусной инфекции, гриппа, а также кори, краснухи и эпидемического паротита);
инактивированные вакцины – иммунобиологические препараты, которые содержат убитые микроорганизмы или их фрагменты (среди самых известных инактивированных вакцин выделяют прививочные средства против гриппозных инфекций, брюшного тифа, клещевого энцефалита, а также бешенства, гепатита А, менингококковой инфекции);
вакцины-анатоксины, которые представляют собой очищенные токсины возбудителей заболеваний (вакцины против столбняка, дифтерии, коклюшной инфекции).

Видео по теме

Доктор биологических наук о том, что такое иммунопрофилактика и зачем существует атлас прививок:

Современная медицина не стоит на месте. Несколько лет назад общественность всколыхнула информация о появлении нового вида вакцин, название которым молекулярные.

Главным материалом для создания таких препаратов являются рекомбинантные белковые единицы или их фрагменты, синтезированные путем использования передовых достижений генной инженерии. Яркий пример молекулярной вакцины – прививка против гепатита В, которую применяют, начиная с первых дней жизни ребенка.

Настоящие методические указания устанавливают методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа с целью установления их эффективности и безопасности.

Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы и организаций, осуществляющих определение показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа.

Целью введения настоящих методических указаний является регламентация методов определения показателей качества противогриппозных препаратов на их соответствие требованиям нормативных документов.

Методические указания содержат описание общих методов определения показателей качества противогриппозных препаратов. Особенности методов оценки качества противогриппозных препаратов, не охватываемые настоящим документом, описаны в документах на эти препараты.

Задачей проведения контроля является установление эффективности и безопасности противогриппозных препаратов.

3.1 . Метод постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с вирусом гриппа (макрометод)

Реакцию торможения гемагглютинации применяют для установления типа и подтипа вируса, т.е. специфичности, а также для определения нарастания титров специфических антител.

Постановка РТГА включает следующие этапы работы: приготовление взвеси эритроцитов, определение гемагглютинирующего титра антигена в РГА и рабочей дозы вируса, постановка самой реакции.

Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты:

• антиген (вакцина, вируссодержащая жидкость - аллантоисная или культуральная);

• иммунные сыворотки к различным вирусам гриппа;

• буферно-солевой раствор рН 7,2 ± 0,2 (Na -фосфатный буфер 0,01 М с 0,16 M NaCl );

• взвесь куриных эритроцитов, 1 %.

3.1.1 . Приготовление взвеси куриных эритроцитов

Для постановки РТГА используют эритроциты петухов. Кровь у петухов берут из сердца или подкрыльцовой вены.

Свежеполученную от 3 - 5 петухов кровь помещают во флакон со стеклянными бусами или же с одним из антикоагулянтов (раствор Альсевера, 5 %-ный раствор лимонно-кислого натрия). Дефибринирование крови проводят немедленно путем интенсивного встряхивания флакона в течение 5 - 7 мин при температуре (20 ± 2) °C до выпадения волокон фибрина.

Дефибринированную кровь фильтруют через 4 слоя марли, затем трехкратно отмывают буферно-солевым раствором (на 1 объем крови - 4 объема буферно-солевого раствора) путем центрифугирования при (800 ± 200) об/мин в течение (15 ± 5) мин. Надосадочную жидкость удаляют. Из осадка, принимаемого за 100 %, готовят 1 %-ную суспензию куриных эритроцитов с помощью фотоколориметрирования на ФЭК-56.

3.1.2 . Приготовление 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов с помощью фотоколориметрирования

Для получения стандартных концентраций эритроцитарных суспензий рекомендуется использовать фотометрический метод, позволяющий определять их концентрацию по величине оптической плотности. Основанием для этого служит наличие линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией эритроцитов в определенном интервале концентраций - от 0,15 до 1,00 %.

Величину оптической плотности для 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов определяют экспериментально, в ряду нескольких (

20) параллельных проб с последующим вычислением среднеарифметической величины, принимаемой за исходный показатель оптической плотности.

3.1.3 . Определение показателя оптической плотности 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов

Для приготовления одной пробы отбирают градуированной пипеткой 0,2 мл осадка эритроцитов в емкость, содержащую 19,8 мл буферно-солевого раствора; содержимое тщательно перемешивают, заполняют им объем прямоугольной кюветы фотоколориметра (толщина слоя = 1 мм) и немедленно измеряют оптическую плотность суспензии при длине волны λ = 540 нм.

В качестве контрольного раствора используют дистиллированную воду, предварительно заполняя ею объем второй такой же кюветы ФЭК.

3.1.4 . Приготовление 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов по показателю оптической плотности

Готовят требуемое количество суспензии куриных эритроцитов несколько большей, чем 1 %-ной концентрации. Добавлением буферно-солевого раствора рН 7,2 ± 0,2 к полученной суспензии и измерением оптической плотности ее на ФЭК доводят концентрацию суспензии до такой, показатель оптической плотности которой равен величине, определенной ранее (п. 3.1.2).

Примечание. Поскольку значение оптической плотности суспензии эритроцитов может изменяться в зависимости от качества эритроцитов (на что влияет сезон года, климатические условия, состояние и возраст животных и т.п.), а также зависит от технических характеристик измерительного прибора (ФЭК), величину оптической плотности 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов следует определять периодически (1 раз в 3 - 4 месяца) и на одном и том же приборе.

3.1.5 . Определение гемагглютинирующего титра антигена

В лунках плексигласовой планшеты готовят двукратные разведения антигена в объеме 0,4 мл на буферно-солевом растворе, начиная с 1:10 до 1:1280. В каждую лунку вносят по 0,4 мл 1 %-ной суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием планшеты и оставляют при температуре (20 ± 2) °C на 40 - 45 мин (до оседания эритроцитов в контроле, см. ниже).

Реакцию оценивают по четырехкрестовой системе. За титр антигена, или одну агглютинирующую единицу (1 АЕ), принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов (3 или 4 креста).

Определение титра антигена сопровождается отрицательным контролем на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. С этой целью в контрольную лунку той же плексигласовой доски вносят 0,4 мл буферно-солевого раствора и 0,4 мл 1 %-ной суспензии эритроцитов. При отсутствии спонтанной агглютинации на дне лунки выпадает гомогенный с ровными краями осадок эритроцитов (отрицательная реакция).

В РТГА рабочей дозой является то разведение антигена, в 0,2 мл которого содержится 4 агглютинирующие единицы (4 АЕ). Для вычисления ее следует установленную величину титра антигена разделить на 8. Полученная от деления цифра указывает, во сколько раз нужно развести антиген, чтобы в 0,2 мл его содержалось 4 АЕ (рабочая доза).

Перед постановкой основного опыта проверяют точность приготовления рабочей дозы (4 АЕ). Для этого в пять лунок горизонтального ряда плексигласовой доски, начиная со второй, вносят по 0,2 мл буферно-солевого раствора. В 1-ю и 2-ю лунки добавляют по 0,2 мл приготовленной рабочей дозы антигена. После перемешивания переносят 0,2 мл смеси из 2-й лунки в 3-ю, из 3-й - в 4-ю, из 4-й - в 5-ю, из 5-й лунки 0,2 мл удаляют. Затем в каждую лунку добавляют по 0,2 мл буферно-солевого раствора и по 0,4 мл 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов. В 6-й лунке ставят контроль на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов (см. выше). После встряхивания смесь оставляют при температуре (20 ± 2) °C на 40 - 45 мин (до оседания эритроцитов в контроле).

При правильном выборе рабочей дозы полная (++++) агглютинация эритроцитов должна наблюдаться только в первых трех лунках. В 4-й и 5-й лунках агглютинация должна отсутствовать. В случае отклонения от указанного выше разведение антигена должно быть изменено путем добавления соответствующего количества антигена или буферно-солевого раствора для получения необходимой рабочей дозы. При этом необходимо повторно проверить правильность приготовления рабочей дозы.

3.1. 7 . Постановка реакции торможения гемагглютинации

Сыворотки, используемые в РТГА, могут содержать неспецифические ингибиторы гемагглютинации. Поэтому для их удаления перед постановкой РТГА сыворотки необходимо обработать нейраминидазой холерных вибрионов (см. примеч.).

После удаления неспецифических ингибиторов готовят двукратные разведения сывороток в лунках плексигласовой доски, начиная с 1:10 до 1:640 и выше в объеме 0,2 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют по 0,2 мл рабочей дозы антигена (4 АЕ). Смесь встряхивают, оставляют при температуре (20 ± 2) °C на 30 мин, затем в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов. Смесь повторно встряхивают, оставляют при температуре (20 ± 2) ° C в течение 40 - 45 мин (до оседания эритроцитов в контроле), после чего производят учет результатов реакции (п. 4.1.6).

При наличии специфических антител в сыворотке наступает задержка агглютинации эритроцитов. За титр сыворотки принимают предельное разведение, вызывающее полную задержку гемагглютинации.

Задержка гемагглютинации указывает на соответствие типа антигена и взятой сыворотки; отсутствие задержки гемагглютинации свидетельствует о несоответствии типа взятой сыворотки.

Препарат считают специфичным, если он не реагирует в РТГА с гетерологичной сывороткой.

Удаление неспецифических ингибиторов гемагглютинации из иммунных сывороток с помощью нейраминидазы холерных вибрионов.

При наличии инструкции по применению нейраминидазы необходимо следовать требованиям, изложенным в данном документе.

Метод основан на способности нейраминидазы холерных вибрионов, не действуя на специфические антитела, разрушать ингибиторы гемагглютинации к вирусам гриппа A и B в сыворотках крови человека, кур, крыс, кролика.

Содержимое ампулы (1 мл лиофилизированного препарата нейраминидазы холерных вибрионов) растворяют в 1 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

Готовят рабочее разведение препарата в буферно-солевом растворе, равное 1:50. В разведенном виде препарат хранят в холодильнике при температуре (4 ± 20) °C не более 3 суток.

К 0,1 мл цельной сыворотки добавляют 0,5 мл нейраминидазы в рабочем разведении 1:50.

Смесь ставят на 18 ч в термостат при (36 ± 0,5) °C.

Смесь прогревают при (56 ± 10) °C в водяной бане в течение 1 ч.

К смеси (сыворотка плюс нейраминидаза) добавляют 0,4 мл буферно-солевого раствора, чтобы получить разведение сыворотки 1:10.

Сыворотка, обработанная нейраминидазой, может быть использована для РТГА в течение 2 недель при условии хранения ее при температуре (5 ± 1) °C.

Приготовление буферно-солевого раствора рН 7,2 ± 0,2 (0,01 М Na-фосфатный буфер, содержащий 0,15 M NaCl):

• 26,8 г двузамещенного натрия Na ₂ HPO ₄ · 7 H ₂ O растворяют в дистиллированной воде и объем в мерной колбе доводят до 1 л (0,1 М Na ₂ HPO ₄ );

• 13,8 г однозамещенного натрия NaH ₂ PO ₄ · Н₂О растворяют в дистиллированной воде и объем в мерной колбе доводят до 1 л (0,1 М NaH ₂ PO ₄ );

• к 720 мл 0,1 М раствора Na ₂ HPO ₄ добавляют 280 мл 0,1 М раствора NaH ₂ PO ₄ ; pH такого раствора должен быть равным 7,2 ± 0,05;

• 100 мл полученного 0,1 М Na-фосфатного буфера разбавляют дистиллированной водой до 1 л и добавляют 8,5 г хлористого натрия (NaCl); pH полученного раствора - 7,2 ± 0,05. Если рН выше или ниже требуемого, добавляют 1 N раствор НСl или 1 N раствор NaOH, соответственно.

Приготовление раствора Альсевера

• 0,42 % натрия хлорида;

• 0,8 % натрия цитрата;

• 100,0 мл бидистиллированной воды.

Реакцию среды раствора доводят с помощью 5 %-ной лимонной кислоты до рН от 6,15 до 5,60 (примерно 10 мл кислоты на 1 л раствора). Стерилизуют фильтрацией или автоклавированием в течение 3 последовательных дней при 100 ° C и 0,7 атм. Для консервирования добавляют на 1 мл крови 1,2 мл раствора Альсевера.

В этом виде эритроциты можно хранить при (4 ± 2) °C в течение 1 - 2 недель. Перед употреблением их необходимо трехкратно отмыть буферно-солевым раствором с помощью центрифугирования при (800 ± 200) об./мин в течение 10 мин.

Приготовление консервирующего раствора 5 %-ного натрия цитрата

Перед употреблением 5 %-ный раствор цитрата натрия на дистиллированной воде разводят в 2 раза буферно-солевым раствором и к одной части полученного раствора натрия цитрата добавляют 2 части крови. В этом консерванте эритроциты можно хранить при (4 ± 2) °C в течение 3 - 5 суток.

3.2 . Метод постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с вирусом гриппа (микрометод)

Принцип метода, его учет и ингредиенты для реакции, проводимой микрометодом, те же, что и для проведения РТГА макрометодом. Изменяются только концентрации и объемы ингредиентов.

3.2.1 . Приготовление 0,5 %-ной взвеси эритроцитов петуха

Взвесь готовят из 1 %-ной суспензии эритроцитов (см. макрометод) разведением ее в 2 раза (т.е. в соотношении 1:1) буферно-солевым раствором.

3.2.2 . Определение гемагглютинирующего титра антигена

В каждую лунку микропанели вносят буферно-солевой раствор в объеме 50 мкл. Затем в первую лунку вносят 50 мкл антигена в разведении 1:10 и далее проводят титрование по принципу двукратного разведения. Из последней лунки удаляют 50 мкл. Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл 0,5 %-ной суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре (20 ± 2) °C на 40 - 45 мин до оседания эритроцитов в контроле (см. ниже).

Реакцию оценивают по четырехкрестовой системе. За титр антигена или одну агглютинирующую единицу (1 АЕ) принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов на 3 или 4 креста.

Определение титра антигена сопровождается постановкой отрицательного контроля на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. В качестве отрицательного контроля служат несколько лунок панели, в которые вместо антигена внесен буферно-солевой раствор.

Рабочая доза антигена при постановке РТГА микрометодом равна 8 ГАЕ. Для ее приготовления гемагглютинирующий титр делят на 16. Полученная цифра означает, во сколько раз необходимо развести антиген.

Пример. Титр антигена равен 1:160. Разделив 160 на 16, получаем цифру 10, указывающую, что антиген необходимо развести в 10 раз.

Перед постановкой основного опыта проверяют точность приготовления рабочей дозы (8 АЕ). Для этого в шесть лунок микропанели, начиная со второй, вносят по 25 мкл буферно-солевого раствора. В 1-ю и 2-ю лунки добавляют по 25 мкл приготовленной рабочей дозы антигена. После перемешивания смеси 25 мкл ее объема переносят из 2-й лунки в 3-ю, из 3-й - в 4-ю и т.д. Из последней лунки панели 25 мкл удаляют. Затем во все лунки добавляют по 25 мкл буферно-солевого раствора и по 50 мкл 0,5 %-ной суспензии эритроцитов. После встряхивания смесь оставляют при температуре (20 ± 2) °C на 40 - 45 мин до оседания эритроцитов в контроле.

При правильном выборе рабочей дозы агглютинация эритроцитов должна наблюдаться только в четырех лунках панели. В остальных лунках агглютинация должна отсутствовать. В случае отклонения от указанного результата добавляют антиген или буферно-солевой раствор для получения необходимой рабочей дозы.

3.2.4 . Постановка реакции торможения гемагглютинации

Постановка реакции микрометодом соответствует описанному для макрометода, за исключением объемов используемых ингредиентов реакции.

Готовят двукратные разведения сыворотки в объеме 25 мкл, вносят рабочую дозу антигена (8 АЕ) в объеме 25 мкл и после контакта антигена и сыворотки (от 30 мин до 1 ч) при температуре (20 ± 2) °C в каждую лунку панели вносят по 50 мкл 0,5 %-ной взвеси эритроцитов. После оседания эритроцитов в контроле (как правило, через 40 - 45 мин) проводят учет результатов.

За титр активности принимают разведение сыворотки, при котором отсутствует агглютинация эритроцитов.

Определение проводят на развивающихся куриных эмбрионах 10 - 12-дневного возраста.

Десятикратные разведения вируса (вакцины) готовят в 4,5 мл буферно-солевого раствора рН от 7,4 до 7,0, меняя при каждом разведении пипетку.

Вводят в аллантоисную полость 0,2 мл вируссодержащей жидкости из разведений от 10 -5 до 10 -7 (разведения могут меняться в зависимости от целей исследования и предполагаемой инфекционной активности вируса), используя на каждое разведение по 4 эмбриона. Для заражения эмбрионов используют разные шприцы или проводят заражение одним шприцем, начиная с большего разведения.

Эмбрионы инкубируют при температуре 35 °C в течение 48 ч для вируса гриппа (вакцины) типа A и 72 ч для вируса гриппа (вакцины) типа В. По истечении срока инкубации отдельно из каждого эмбриона отбирают по 0,4 - 0,5 мл аллантоисной жидкости, которую помещают в 4 отдельные лунки плексигласовой доски. Затем в каждую лунку добавляют по 0,4 - 0,5 мл 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов. Через 30 - 40 мин контакта при температуре (20 ± 2) °C, после оседания эритроцитов в контроле, проводят учет гемагглютинации.

Контроль проводят, как описано выше, но вместо аллантоисной жидкости из куриного эмбриона в свободные 4 лунки панели вносят по 0,4 - 0,5 мл буферно-солевого раствора рН 7,2 ± 0,2.

Вычисление биологического титра проводят по методу Рида и Менча.

Метод основан на логической предпосылке, что тканевая культура или животное, погибшие при заражении их каким-либо разведением вируса, погибнут и при заражении любым более низким разведением.

Пример подсчета показан ниже.

Подсчет 50 %-ной дозы (ТЦД₅₀) по методу Рида и Менча

Читайте также: