Иммунореактивность при гепатите в

Гепатит В (ГВ) – острое или хроническое заболевание печени, вызываемое вирусом гепатита В (ВГВ), протекающее в различных клинико-морфологических вариантах: от бессимптомных форм до злокачественных (цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома). На долю ГВ приходится около 15% всех регистрируемых в РФ острых гепатитов и не менее 50% хронических. При анализе заболеваемости практически учитываются только острые формы ГВ. Безжелтушные, субклинические формы инфекции, в основном, остаются нераспознанными (до 95% случаев).

Вирус гепатита В отличается чрезвычайно высокой устойчивостью к различным физическим и химическим факторам: низким и высоким температурам, многократному замораживанию и оттаиванию, длительному воздействию кислой среды. Он инактивируется при автоклавировании ром (180°С) – 1 ч, при комнатной температуре со- храняется в течение 3 мес., в замороженном виде – 15–20 лет.

ВГВ имеет сродство к различным тканям: чаще всего он поражает печень, однако, ДНК и белки вируса обнаруживаются также в почках, селезенке, поджелудочной железе, коже, костном мозге и мононуклеарах периферической крови.

Этиология гепатита В

Возбудитель гепатита В – ДНК-содержащий вирус, относится к семейству Hepadnaviridae наряду с вирусами гепатита некоторых видов теплокровных животных. Геном ВГВ представляет собой релаксированную кольцевую частично двухцепочечную молекулу ДНК, содержащую около 3 200 пар нуклеиновых оснований.

Современная классификация включает 8 генотипов вируса гепатита В: A, B, C, D, E, F, G, H. На территории России преобладает вирус геноти- па D. Структура ВГВ – инфекционные частицы Дейна – приведена на рис.1.

В нуклеокапсиде – сердцевине ВГВ – расположены основные белки-антигены, детерминирующие репликативную активность ВГВ. Это внутренний или сердцевинный антиген HBcoreAg и близкий к нему HBprecoreAg, или HBeAg. HBeAg представляет собой конформационно измененный HBсоrеAg. HBcoreAg и HBeAg обладают структурным родством и имеют общие эпитопы. Установлено, что HBeAg циркулирует в крови инфицированных лиц, тогда как HBcoreAg обнаруживается исключительно в биоптатах печени в ядрах гепатоцитов.

Рис.1. Структура вируса гепатита В.

Белок внешней оболочки ВГВ является его поверхностным антигеном – HBsAg. Это сложный антиген, включающий несколько антигенных детерминант, сочетание которых определяет субтип HBsAg. Десять субтипов HBsAg: ауw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adr, adw2, adw4, adrq+, adrq– относят к основным, а пять: awr, adrw, adyr и adywr – к более редким. На территории РФ преобладает HBsAg субтипа ауw (ayw2 – 57%; ayw3 – 37%), субтипы adw2 и adrq+ встречаются в 5 и 1% случаев, соответственно.

Концентрация HBsAg в крови больных варь- ирует в очень широком диапазоне – от 0,01 нг/мл до 500 мкг/мл. Столь высокое содержание HBsAg практически приближается к концентрации собственных сывороточных белков больного. Следует отметить, что только часть HBsAg, образующегося при репликации ВГВ, используется для построения новых вирусных частиц, основное же его количество поступает в кровь инфицированных лиц в форме сферических частиц диаметром 22 нм и палочковидных форм длиной до 200 нм. Количество таких частиц в крови превышает число инфекционных вирионов ВГВ в десятки и сотни тысяч раз.

Иммунный ответ

Иммунный ответ при ГВ имеет характерные особенности, обусловленные тем, что реакция со стороны иммунной системы на инфицирование ВГВ является не иммунопротективной, а иммунопатологической. Это означает, что сам вирус клетки печени не разрушает, а лизис (растворение, разрушение) инфицированных ВГВ гепатоцитов происходит за счет атаки цитотоксических Т-клеток иммунной системы. Таким образом, подавление репликативной активности вируса в организме человека достигается ценой гибели собственных инфицированных печеночных клеток.

Широко известна обратная зависимость угрозы хронизации инфекции от тяжести течения острой фазы ГВ. При адекватном иммунном ответе массивная гибель инфицированных клеток приводит к тяжелому течению болезни, но вместе с тем способствует более полной элиминации вируса, исключающей вероятность хронизации.

Установлено, что при длительном контакте вируса и клетки генетический аппарат ВГВ интегрируется в геном клеток. Это является одним из основных механизмов формирования хронического ГВ (ХГВ), поскольку вирус становится недосягаемым для иммунного контроля. В соответствии с современной классификацией при ХГВ выделяют два варианта развития инфекции: с высокой и низкой репликативной активностью вируса. Наличие HBeAg в крови пациента спустя 6 мес. и более от начала болезни и концентрация ВГВ-ДНК > 10 5 копий/мл – факторы, подтверждающие развитие у больного ХГВ с высокой репликативной активностью (HBeAg-позитивный хронический ГВ репликативного типа).

Прекращение свободной циркуляции HBeAg и выявление анти-НВе при длительном сохранении HBs-антигенемии характеризует развитие хронического ГВ с низкой репликативной активностью. При этом концентрация ВГВ-ДНК в крови, как правило, составляет 5 копий/мл (HBeAg-негативный хронический ГВ интегративного типа).

В настоящее время считают, что у лиц, переболевших ранее гепатитом В с выработкой антиHBs, возможна реактивация инфекции. Такие случаи наблюдаются, как правило, при иммунодефицитных состояниях, вызванных онкологическими заболеваниями, ВИЧ-инфекцией и др. Установлено, что у части больных ГВ после выздоровления в гепатоцитах может сохраняться интегрированная ВГВ-ДНК. Вирус при этом обнаруживается в клетках печени и других органах, но не в крови, где он находится под иммунным контролем.

Маркеры вируса гепатита В

В организме больного ГВ могут быть обнаружены вирусные антигены HBsAg и HBeAg, а также антитела к ним и HBcore-белку: анти-HBcore, анти-HBe, анти-HBs. Данные антигены и антитела в совокупности представляют комплекс специфических маркеров ВГВ, который находится в динамическом изменении и отражает вирусную репликацию и иммунную реакцию пациента (рис. 2). Комплексное определение маркеров позволяет правильно установить стадию инфекции ВГВ и прогнозировать ее дальнейшее развитие.

Рис. 2. Динамика серологических маркеров при остром гепатите В.

HBsAg

HBsAg – основной серологический маркер ГВ. При остром гепатите HBsAg может быть выявлен в крови обследуемых в инкубационный период ГВ и в первые 4–6 недель клинического периода. Присутствие HBsAg более 6 мес. (по мнению некоторых авторов, более 1 года) рассматривается как фактор перехода болезни в хроническую стадию.

Контроль донорской крови на наличие HBsAg является обязательным практически во всех странах мира. Однако, использование большинства иммуноферментных тестов для определения этого маркера не позволяет со 100%-й вероятностью выявить ВГВ-инфекцию у обследуемых лиц. Ложноотрицательные результаты могут быть обусловлены тем, что:

Анти-HBs

Для оценки течения инфекционного процесса и его исхода важное клиническое значение имеет динамический контроль за системой HBsAg – анти-HBs. В большинстве случаев у больных острым ГВ анти-HBs начинают обнаруживаться спустя длительное время после исчезновения HBsAg.

Факт появления анти-HBs рассматривается как надежный критерий развития постинфекционного иммунитета, т.е. выздоровления после ГВ.

Раннее появление анти-HBs, обнаружение их в острую стадию ГВ, сразу после исчезновения HBsAg, должно насторожить лечащего врача. Такая динамика системы HBsAg – анти-HBs рассматривается как прогностически неблагоприятная, предвещающая угрозу фульминантного течения ГВ.

При хроническом ГВ маркеры HBsAg и анти-HBs иногда обнаруживаются одновременно.

Анти-HBs могут сохраняться пожизненно. В некоторых случаях в течение последующих нескольких лет после перенесенного острого гепатита В концентрация анти-HBs может постепенно снижаться.

Анти-HBs обладают протективными (защитными) свойствами. Этот факт лежит в основе вакцинопрофилактики. В настоящее время в качестве вакцины против ГВ, в основном, применяют препараты рекомбинантного HBsAg. Эффективность иммунизации оценивают по концентрации антител к HBsAg у вакцинированных лиц. Согласно данным ВОЗ, общепринятым критерием успешной вакцинации считается концентрация антител, превышающая 10 мМЕ/мл.

Вакцинирование лиц, перенесших ВГВ-инфекцию, не только экономически нецелесообразно, но и означает неоправданную антигенную нагрузку на иммунную систему человека. Поэтому перед началом вакцинации необходимо провести скрининг лиц, подлежащих иммунизации, на наличие в крови HBsAg, анти-HBs и HBcorе-антител. Присутствие хотя бы одного из перечисленных маркеров является отводом от вакцинации против ГВ. К сожалению, перед вакцинацией крайне редко проводится предварительное обследование пациентов на наличие маркеров ГВ, а распространенность их достаточно велика, особенно среди лиц, отнесенных к группам риска.

Несмотря на то, что современные вакцины характеризуются высокой иммуногенностью, проведение вакцинации не всегда обеспечивает защиту организма человека от возможного инфицирования ВГВ. По литературным данным, протективный уровень антител после окончания курса вакцинации не достигается в 2–30% случаев.

Помимо качества вакцины, на эффективность иммунного ответа влияют многие факторы, определяющим из них является возраст привитых. Максимальный иммунный ответ у человека наблюдается в возрасте от 2 до 19 лет. По силе иммунного ответа новорожденные уступают детям и взрослым. Наиболее слабый иммунный ответ на вакцинацию характерен для пожилых людей в возрасте 60 лет и старше, у которых сероконверсия наблюдается лишь в 65–70% случаев. Возрастное снижение иммунного ответа более выражено у мужчин, чем у женщин.

Резистентность к прививке может наблюдаться среди иммунонекомпетентных лиц: ВИЧ-инфицированных, больных, страдающих хроническими заболеваниями и др. Кроме того, имеются данные о влиянии веса вакцинируемого на величину иммунного ответа. Рекомендуемая доза вакцинного препарата (20 мкг HBsAg) оптимальна лишь для лиц весом до 70 кг. Возможно, что для достижения адекватных результатов вакцинации для лиц с весом более 70 кг дозы вакцины следует увеличить.

Установлено, что после перенесенного гепатита В анти-HBe могут сохраняться в крови человека от 5 мес. до 3–5 лет.

Анти-НВсоrе

HBсoreAg можно обнаружить только в биоптатах печени в ядрах гепатоцитов инфицированного ВГВ человека, а в его крови он в свободном виде не циркулирует. Сердцевинное положение HBсoreAg в вирионе определяет его высокую иммуногенность и обуславливает раннее появление антител к этому антигену (анти-НВсоrе).

Иммуноглобулины класса М к HBсoreAg (HBcore-IgM) обнаруживаются в крови уже в инкубационном периоде болезни, еще до пика повышения АлАТ и клинических проявлений гепатита. HBcore-IgМ – основной серологический маркер острого ГВ, который обычно циркулирует в крови больных в течение 6–12 мес. и исчезает после выздоровления. При хронических формах ГВ HBcore-IgМ определяются в крови в фазе обострения.

Иммуноглобулины класса G (HBcore-IgG) появляются практически в те же сроки, что и HBcore-IgМ, сохраняются после перенесенного гепатита В пожизненно, являясь надежным маркером пастинфекции.

У 10% анти-HBcore-позитивных лиц другие серологические маркеры ГВ не выявляются, что чаще всего характерно для:

• ВГВ-инфекции с низкой экспрессией HBsAg (часто это микст-гепатиты),
• серонегативного периода – после исчезновения HBsAg и до появления анти-HBs,
• паст-инфекции ГВ с концентрацией антиНВs ниже уровня, определяемого тестом, с помощью которого проводились исследования.

В этих случаях для верификации диагноза ГВ целесообразно использовать определение вирусной ДНК методом ПЦР.

Во многих странах мира обязательным является контроль донорской крови не только на содержание HBsAg, но и анти-HBcore (США, Канада, Германия и др.). В РФ такая практика пока не получила широкого распространения из-за отсутствия соответствующего федерального закона, поскольку проведение теста на анти-HBcorе увеличивает стоимость обследования и количество отбракованной донорской крови (распространенность этого маркера среди первичных доноров составляет 20–30%, в общей популяции – 15–20%).

• при анализе сывороток крови, содержащих ревматоидный фактор класса М и HBcore-IgG, возможны ложноположительные результаты;
• высокая концентрация HBcore-IgG в анализируемом образце может приводить к недовыявлению специфических IgM.

Комплексное использование серологических маркеров ВГВ-инфекции в лабораторной диагностике

Определение комплекса маркеров ГВ с помощью соответствующих иммуноферментных наборов реагентов (см. табл.2), позволяет оценить так называемый серологический профиль больного и наиболее полно и надежно охарактеризовать фазу течения инфекционного процесса (табл. 1, схема).

Таблица 1. Интерпретация результатов серологического обследования на гепатит В

Серологический диагноз	HBsAg	Анти-HBs	анти-НВсоrе суммарные		HBеAg	Анти-HBе	ДНК ВГВ, копий/мл
			HBcore- IgМ	HBcore- IgG
Острый гепатит В	+/–	–/+	+	+	+/–	–/+	+/–
Хронический интегративный ГВ (носительство HBsAg)	+	–	–	+	–	+	5
Хронический репликативный ГВ	+	–	+/–	+	+/–*	–/+*	>10 5
Иммунитет после вакцинации	–	+	–	–	–	–	–
Иммунитет после перенесенного ГВ	–	+	–	+	–	+/–	–

Рис.3. Алгоритм серологического обследования на гепатит В

Цена:

Авторы работы:

Научный журнал:

Год выхода:

FUNCTIONAL ACTIVITY OF TH17-LYMPHOCYTES AND REGULATORY T-CELLS IN CHILDREN WITH INFLAMMATORY BOWEL DISEASE

Miroshkina L. V., Petrichuk S. V., Tsimbalova E. G., Potapov A. S., Samokhina I. V., Venediktova M. M., Kurbatova O. V., Semenova G. F., Izmajlova T. D., Kapustina E. Yu.

Scientific Center of Children's Health RAMS, Moscow, Russia

The results of Th17-lymphocytes and regulatory T-cells mitochondrial activity investigation in children with inflammatory bowel disease, treated by anti-TNF-a therapy, are presented in the article. Elevated Th17-lymphocytes number, increasing during the first year of biological therapy, along with decreased mitochondrial activity in this subsets, were revealed in patients with nonsustained effect of infliximab. These patients also had features of mitochondrial dysfunction in regulatory T-lymphocytes. Children with sustained effect of biological therapy were characterized with increased mitochondrial activity and elevated number of regulatory T-lymphocytes before the treatment, with following increaseof this subset size during the first year.

Key words: Crohn's disease, ulcerative colitis, lymphocytes, mitochondria, children

ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ И АУТОИММУННАЯ РЕАКТИВНОСТЬ ОРГАНИЗМА ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ С В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ГЕНОТИПА ВИРУСА

Институт иммунологии Академии Наук, Ташкент, Узбекистан

Целью нашего исследования было изучение характера иммунологической реактивности и аутоиммунных нарушений при хроническом вирусном гепатите С в зависимости от иммуногенетических характеристик вируса. Анализ полученных результатов показал, что при хроническом вирусном гепатите С наблюдается выраженный дисбаланс клеточного и гуморального звеньев иммунной системы, более выраженный при 1 генотипе вируса. Очевидно, при хронических вирусных поражениях печени Т-клеточный ответ существенно более слабый и направлен против меньшего числа эпитопов, что позволяет предполагать клональное истощение Т-лимфоцитов. Следовательно, выявленные изменения в состоянии иммунореактивности пациентов свидетельствуют о влиянии иммуноге-нетических характеристик вируса на формирование иммунного ответа и течение инфекционного процесса при хроническом вирусном гепатите С. Персистенция вируса гепатита С в мононуклеарах является прогностически неблагоприятным фактором для развития аутоиммунных нарушений при ХВГС.

Ключевые слова: вирусный гепатит С, мононуклеары, Т-клеточный ответ

высокий уровень виремии в крови больного а также устойчивость к противовирусному воздействию при лечении хронического вирусного гепатита С [3, 4]. В патогенезе вирусных поражений печени особое место отводится аутоиммунным нарушениям, т.к. высокая частота внепечёночных проявлений

при хроническом вирусном гепатите С в сочетании с выявлением широкого спектра ау-тоантител позволяет предположить роль ге-патотропных вирусов в этиологии некоторых аутоиммунных заболеваний [2, 3, 7]. В тоже время остаётся открытым вопрос о значении и месте аутоиммунных нарушений в патогенезе вирусных поражений печени.

Целью нашего исследования явилось - изучение характера иммунологической реактивности и аутоиммунных нарушений при хроническом вирусном гепатите С (ХВГС), в зависимости от иммуногенетических характеристик вируса.

Материал и методы. Нами были обследованы 162 больных ХВГС со средним возрастом 35,6±2,8 лет. Комплекс первичного обследования включал традиционный набор клинических и биохимических лабораторных показателей, УЗИ, исследование серологических маркеров (анти-HCV-IgG). Среди обследованных больных у 74% был определен 1 генотип (1а или 1в), у 6% - 2 генотип (2а или 2в), и у 21% - 3 генотип вируса гепатита С, то есть наиболее часто встречающимся генотипом в нашем исследовании явился 1 генотип.

Иммунологические и вирусологические исследования проводились в лабораториях Института иммунологии АН РУз с использованием современных и высокоточных тест-систем (ИФА и ПЦР).

Наличие аутоиммунных нарушений при естественном течении хронического вирусного гепатита С определяли выявлением аутоан-тител к одноцепочечной (денатурированной) ДНК и интерферону-альфа методом ИФА. Ни один из обследованных больных не получал в процессе лечения препараты интерферона и/или какие-либо индукторы интерферона, что позволяет обсуждать естественное течение хронического вирусного гепатита С у обследованных пациентов.

ВЕНЕДИКТОВА М.М., ИЗМАЙЛОВА Т.Д., КАПУСТИНА Е.Ю., КУРБАТОВА О.В., МИРОШКИНА Л.В., ПЕТРИЧУК С.В., ПОТАПОВ А.С., САМОХИНА И.В., СЕМЕНОВА Г.Ф., ЦИМБАЛОВА Е.Г. — 2014 г.

ЖУКОВА О.Б., ЗИМА А.П., НОВИЦКИЙ В.В., РЯЗАНЦЕВА Н.В. — 2010 г.

АРСЕНТЬЕВА Н.А., БАСИНА В.В., ЖДАНОВ К.В., КОЗЛОВ К.В., ЛЮБИМОВА Н.Е., СЕМЕНОВ А.В., ТОТОЛЯН АРЕГ АРТЕМОВИЧ, ЭСАУЛЕНКО Е.В. — 2015 г.

АДЫЛОВ А.Г., ИСМАИЛОВА А.А., НАБИЕВА У.П., ПЕТРОВА Т.А. — 2014 г.

Т. И. УЛАНОВА, В. Ф. ПУЗЫРЕВ, А. Н. БУРКОВ, А. П. ОБРЯДИНА

ВЛИЯНИЕ ГЕТЕРОГЕННОСТИ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НА ИММУНОРЕАКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСА АНТИГЕННЫХ ЭПИТОПОВ, ЛОКАЛИЗОВАННОГО В ПРЕДЕЛАХ aa БЕЛКА NS3 ВИРУСА ГЕПАТИТА С

Используя рекомбинантные белки изучали влияние гетерогенности первичной структуры на иммунореактивность комплекса антигенных эпитопов, локализованного в пределах аа неструктурного белка NS3 вируса гепатита С (HCV). Шесть генов, кодирующих указанный фрагмент NS3 из вирусов гепатита С разных генотипов, были собраны с помощью ПЦР из синтетических олигонуклеотидов и экспрессированы в клетках E.coli. Процент гомологии аминокислотных последовательностей антигенов варьировал от 78,4% до 92,2%. Все антигены демострировали более высокий коэффициент реактивности с антителами в образцах сывороток больных, инфицированных вирусом гепатита С аналогичного генотипа, однако строгой генотипо-специфичности в иммунореактивности не наблюдалось.

Полученные данные позволяют сделать вывод о влиянии первичной структуры на иммунореактивность антигенов. Селекция вариантов первичных структур антигенов является ключевым моментом при создании диагностического теста.

Ключевые слова: вирус гепатита С, NS3-белок, первичная структура, иммунореактивность.

Recombinant proteins were used to study the effect of heterogenicity of the primary structure of NS3 protein of hepatitis C (HCV) on the immunoreactivity of a complex of antigenic epitopes located within the amino acid sequences . Six genes encoding for the above fragment NS3 from different genotypes were collected from synthetic oligonucleotides and expressed in E. coli cells, by using the polymerase chain reaction. The homology of amino acid sequences of antigens ranged from 78.4 to 92.2%. All the antigens showed a higher coefficient of their reactivity with antibodies in the sera samples from patients infected by HCV of a respective genotype; however, there was no strong genotype-specific immunoreactivity. The findings lead to the conclusion that the primary structure of antigens has an impact on their immunoreactivity. Selection of variants of the primary structures of antigens is essential in developing a diagnostic test.

Единый HCV полипротеин в результате процессинга разделяется на 10 вирусных белков: core, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a и NS5b. Антигенная структура некоторых белков вируса гепатита С хорошо изучена при помощи синтетических пептидов и рекомбинантных белков [3,8,12,13]. Белок NS3 является одним из главных антигенов вируса гепатита С (HCV). Сильные антигенные эпитопы были найдены в пределах аа[7] и аа [2]. Антигенные эпитопы белка NS3 являются конформационнозависимыми и эффективно моделируются лишь рекомбинантными белками длиной более 100 аминокислот. [8,11].

Геном вируса гепатита С является довольно вариабельным. Выделяют 6 основных генотипов вируса и множество его субтипов. Нуклеотидные последовательности вирусов разных генотипов имеют гомологию около 66-69%, разных субтипов одного генотипа - около 77-80%. Идентичность нуклеотидной последовательности внутри одного субтипа составляет около 91-98% [15,16].

Гетерогенность внутри полипротеина вируса гепатита С распределена не равномерно. Е1,Е2,NS4a и NS5a являются наиболее вариабельными областями, тогда как core и NS3 являются наиболее консервативными.

Целью нашего исследования было изучение влияния гетерогенности аминокислотной последовательности рекомбинантных антигенов на их иммунореактивность. Полученные результаты являются важными для создания высокочувствительных диагностических тестов новых поколений, позволяющих детектировать антитела в сыворотках с одинаковой чувствительностью, не зависимо от генотипа вируса.

Материалы и методы.

Синтез и экспрессия генов, очистка рекомбинантных белков.

Шесть вариантов аминокислотных последовательностей белка NS3 (HCV) с 1192-

1456 аа, полученные из GenBank, были использованы для получения нуклеотидных последовательностей и дизайна синтетических олигонуклеотидов. Рекомбинантные гены были собраны с помощью PCR из синтетических олигонуклеотидов, клонированы в вектор pGEX4T-2 и экспрессированы в клетках E.coli в виде гибридных белков с глютатион-S-трансферазой. Трансформацию клеток E.coli штамма JM109 и экспрессию генов проводили согласно методике, описанной ранее [14]. Рекомбинантные белки чистили при помощи аффинной хроматографии на глютатион сефарозе 4В (Pharmacia) [6].

Анализ нуклеиновых последовательностей проводили с использованием автоматического сиквенатора (373 DNA sequencer; Applied Biosystem) согласно протоколу производителя. Анализ аминокислотных последовательностей проводили с использованием программы DNAStar (Madison, Wis.)

124 образца сывороток доноров были предварительно проанализированы при помощи теста RIBA-HCV 3,0 SIA (Chiron Corporation, USA). Все сыворотки также были тестированы на наличие РНК вируса гепатита С (Amplicor, Roche Inc.). Дополнительно была использова панель, состоящая 101 образца сывороток, полученного от больных, инфицированных вирусами гепатита С из разных генотипов. Для подсчета уровня

Результаты. Все рекомбинантные белки показали разный уровень иммунореактивности с использоваными образцами сывороток доноров (Таблица 1). Самым иммунореактивным был антиген Са, полученный на основе последовательности вируса 6-го генотипа. Этот белок детектировал специфические антитела у 94,8% анти-HCV положительных образцов сывороток доноров. Антиген С33-40-2с, полученный на основе последовательности вируса субтипа 2с, также демонстрировал высокий уровень иммунореактивности. Остальные рекомбинантные антигены имели более низкий уровень иммунореактивности. Интересно отметить, что два рекомбинантных антигена Са и Са, полученные на основе двух, незначительно различающихся между собой последовательностей вируса 6-го генотипа, демонстрируют очень разный уровень иммунореактивности с анти-HCV положительными сыворотками. Два рекомбинантных антигена С33-40-2с и С33-23-2b, полученных на основе последовательностей вирусов субтипов 2с и 2b, выявляли специфические антитела к NS3 области вируса гепатита С в анти-HCV положительном образце, реагирующий только с С100 и С22 антигенами RIBA-HCV 3,0 SIA. Как показали результаты генотипирования, эта сыворотка была получена от донора, инфицированного вирусом гепатита С 2-го генотипа.

Наибольшую иммунореактивность с образцами сывороток второй панели также демострировали Са (Таблица 2). Этот белок выявлял специфические антитела у 100% образцов сывороток от больных, инфицированных вирусами гепатита С генотипов 1а, 2b и 6. Антиген С33-40-2с (субтип 2с) детектировал антитела в 100% позитивных образцов, содержащих РНК вируса генотипов 2а/с и 2b. Интересно отметить, что хотя для синтеза С33-23-2b была использована последовательность вируса гепатита С субтипа 2b, этот антиген реагировал с 100% позитивных образцов от больных, инфицированных вирусом генотипа 2а/с и только с 92,3% положительных образцов сывороток, содержащих РНК вируса генотипа 2b. Два наших рекомбинантных антигена, полученных на основе последовательности вируса 6-го генотипа, вновь демонстрировали разный уровень иммунореактивности с анти-HCV положительными сыворотками (Таблица 2).

При тестировании образцов сывороток на наличие антител к белкам вируса гепатита С иммуноферментными тестами различных производителей, могут наблюдаться серьезные разногласия в полученных результатах (4,5). Чувствительность и специфичность диагностических тестов во многом зависит от используемых антигенов. Существует ряд примеров более низкой реактивности серологических тестов, базирующихся на антигенах вируса 1-го генотипа, с сыворотками, от больных, инфицированных вирусами гепатита С других генотипов [10,13]. Процент гомологии аминокислотных последовательностей антигенов, проанализированных в нашей работе, варьировал от 92,2% до 78,4%. Причем, как показывают наши данные, антигены, полученные на основе аминокислотных последовательностей NS3 белка вирусов гепатита С разных генотипов, демонстрируют сходный или различный уровень иммунореактивности, независимо от степени гомологии первичной структуры. Различия в иммунореактивности антигенов проявляются со всеми категориями сывороток.

Наши данные, полученные при использовании коллекции ПЦР-положительных образцов сывороток с определенным генотипом вируса, показывают, что, несмотря на то, что все антигены демонстрируют наибольшую реактивность при взаимодействии с сыворотками, содержащими РНК вируса аналогичного генотипа, строгой генотипоспецифичности в иммунореактивности антигенов мы не выявили (Таблица 2). Определенный ранее как наиболее иммунореактивный С33-946 антиген демонстрирует одинаковый коэффициент позитивности с образцами сывороток, содержащими вирусную РНК разных генотипов. Это является очень важной характеристикой антигена. Основная причина различий в иммунореактивности антигенов с антителами в образцах сывороток, на наш взгляд, связана с первичной структурой антигена.

При изучении аминокислотной последовательности всех использованных в нашей работе антигенов, мы обнаружили, что существуют как консервативные области, имеющие 100% гомологию у всех исследованных белков, так и вариабельные участки, в пределах которых располагаются аминокислотные композиции, уникальные для каждого белка.

В заключение мы можем сказать, что тщательный анализ и подбор первичных структур антигенов является важным моментом в процессе создания высокочувствительного диагностического теста.

1. Barrera, J. M., Francis, B., Ercilla, G, et al. 1995. Improved detection of anti‑HCV in post‑transfusion hepatitis by a third‑generation ELISA. Vox Sang, 68, 15‑18.

2.Claeys, H., Volckaerts, A., Mertens, W., Liang, Z., Fiten, P., Opdenakker, G. 1995. Localization and reactivity of an immunodominant domain in the NS3 region of the hepatitis C virus. Journal of Medical Virology 45, 273-281.

3.Chang, J. C., Seidel, C., Ofenloch, B., Jue, D. L., Fields H. A., and Khudyakov, Y. E. 1999. Antugenic heterogeneity of the hepatitis C virus NS4 protein as Modeled with synthetic peptides. Virology 257,177-190.

4.Courouce, A. M., Barin, F., Botte, C., Lunel, F., Maisonneuve, P., Maniez, M., Trepo, C. 1995. A comparative evaluation of the sensitivity of seven anti-hepatitis C virus screening tests. Vox Sang, 69(3), 213-216.

5. Courouce, A. M., Noel, L., Barin, F., Elghouzzi, M. H., Lunel, F., North, M. L., Smilovici, W. 1998. A comparative evaluation of the sensitivity of the five anti‑hepatitis C virus immunoiblot assays. Vox Sang, 74(4), 217‑224.

6. Frangioni JV, Neel BG. Solubilization and purification of enzymatically active glutathione S-transferase (pGEX) fusion proteins. Anal Biochem. 1993 Apr; 210(1): 179-87

7. Hwang, L., Yang, P. L.M., Chiang, B., Kao, J., Wang, J., Lee, S., Chian, H., Chi, W., Chu, Y., Chen, P., and Chen, D. 1996. Identification of humoral antigenic determinants in the hepatitis C virus NS3 protein. J. Infect. Dis. 174, 173-176.

8. Khudyakov, Y. E., Khudyakova, N. S., Jue, D. L., Lambert S. B., Fang, S., and Fields, H. A. 1995. Linear B-cell epitopes of the NS3-NS4-NS5 proteins of the hepatitis C virus as modeled with synthetic peptides. Virology 206, 666-672.

9. Lefrere, J. J., Guiramand, S., Lefrere, F, et al. 1997. Full or partial seroconversion in patients infected by hepatitis C virys. J. Infect. Dis., 175, 316‑322.

10. McOmish, F., Chan, S. W., Dow, B. C., Gillon, J., Frame, W. D., Crawford, R. J., Yap, P. L., Follett, A. C., and Simmonds.1993. Detection of three types of hepatitis C virus in blood donors: investigation of type-specific differences in serologic reactivity and rate of alanine aminotransferase abnormalities. Transfusion. 1993 Jan; 33(1): 7-13

11. Pawlotsky, J. M., Roudot-Thoraval, F., Pellet, C.,Aumont, P., Darthuy, F., Remire, J., Duval, J., and Dhumeaux, D. 1995. Influance of hepatitis C virus (HCV) genotypes on HCV recombinant immunoblot assay patterns. J. Clin. Microbiol., 33, .

12. Pereboeva, L. A., Pereboev, A. V., and Morris G. E. 1998. Identification of antigenic sites on three hepatitis C virus proteins using phage-displaed peptide libraries. J. Med. Virol. 56, 105-111.

13. Rodrigues-Lopez, M., Riezu-Boj, J. I., Ruiz, M., Berasain, C., Civeira, M. P., Prierto, J., and Borras-Cuesta F. 1999. Immunogenicity of variable regions of hepatitis C virus proteins: selection and modification of pepetide epitopes to assess hepatitis C virus genotypes by ELISA. J. of General Virology.80, 727-738.

14. Sambrook J., Fritsch EF., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

15. Simmonds, P., Alberti, A., Alter, H. J., Bonino, F., Bradley, D. W., et al. 1994. A proposed system for the nomenclature of hepatitis C viral genotypes. Hepatology.

16. Smith, D. B., Pathirana, S., Davidson, F., Lawlor, E., Power, J., Yap, P. L., and Simmonds, P. 1997. The origin of hepatitis C virus genotypes. J. of General Virology 78, 321-328.

Иммунореактивность рекомбинантных антигенов, содержащих комплекс антигенных эпитопов,

локализованных в пределах аа NS3 белка вируса гепатита С с образцами сывороток доноров