Инструкция по применению набора реагентов для выявления рнк энтеровирусов

по применению набора реагентов

для выявления РНК ротавирусов (Rotavirus) в объектах окружающей среды и клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле

Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский

город Москва, улица Новогиреевская, дом 3а

Набор реагентов выпускается в 5 формах комплектации:

Форма 5 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным реагентам, с маркировкой реагентов на их оптовой фасовке.

Прозрачная бесцветная жидкость*

Раствор для отмывки 1

Прозрачная бесцветная жидкость*

Раствор для отмывки 3

Прозрачная бесцветная жидкость

Раствор для отмывки 4

Прозрачная бесцветная жидкость

Суспензия белого цвета

Прозрачная бесцветная жидкость

Комплект реагентов рассчитан на экстракцию РНК из 50 проб, включая контроли.

Прозрачная бесцветная жидкость

Прозрачная бесцветная жидкость

Прозрачная бесцветная жидкость

Прозрачная бесцветная жидкость

Комплект реагентов рассчитан на проведение 60 реакций обратной транскрипции, включая контроли.

раскапана под воск

Прозрачная бесцветная жидкость

объемом 0,5 или 0,2 мл

Прозрачная жидкость синего цвета

Минеральное масло для ПЦР

Бесцветная вязкая жидкость

Прозрачная бесцветная жидкость

Прозрачная бесцветная жидкость

Комплект реагентов рассчитан на проведение 55 реакций амплификации, включая контроли.

Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:

Прозрачная бесцветная жидкость

Прозрачная бесцветная жидкость

Трис-боратный буфер (ТБЕ) концентрированный с бромидом этидия

Прозрачная жидкость оранжевого цвета

Агароза для электрофореза ДНК

Порошок белого цвета

Комплект реагентов рассчитан на электрофоретический анализ 240 образцов (из расчета
100 мл геля – 5 рядов по 24 лунки).

Формы комплектации 1 и 2 предназначены для полного анализа, включая экстракцию РНК из клинического материала, проведения реакции обратной транскрипции, ПЦР-амплификации и детекции продуктов ПЦР-амплификации методом электрофореза в агарозном геле.

Форма комплектации 5 предназначена для производственных целей для последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам.

ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 5 используется только в соответствии с регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной диагностике заболевания[1].

ВЗЯТИЕ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ПРОБ.

Для проведения анализа используется следующий материал:

- концентраты проб воды (сточный, из водоема, питьевой) 1,0 – 2,0 мл;

- фекалии 0,4–1,0 г. Пробу фекалий у грудных детей забирают из подгузника (памперса) у пациентов старшего возраста - из помещенного в горшок или подкладное судно одноразового полиэтиленового пакета или одноразовой пластиковой емкости (чашка Петри). Затем в количестве 1,0 г (примерно) переносят в специальный стерильный контейнер. Контейнер с материалом доставляется в лабораторию в емкости со льдом в течение 1 сут.

Контейнер с материалом доставляется в лабораторию в емкости со льдом в течение 1 сут. Хранить материал можно не более 1 сут при температуре от 2 до 8 °С и в течение 1 нед при температуре не выше минус 16 °С. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала.

Предварительная обработка материала:

Концентраты проб воды. Для выявления вирусных патогенов концентраты проб воды используются без предварительной обработки.

Получение осветленного фекального экстракта.

Приготовление 10-20 % фекальной суспензии (фекалии водянистой консистенции могут использоваться без приготовления суспензии).

1. Образцы проб фекалий объемом до 1,0 мл (по 0,4–1,0 г) отбирают стерильным шпателем и помещают в стерильный флакон.

2. К образцу фекалий добавляют 4,0 мл физраствора до образования 10-20 % суспензии.

3. Взвесь фекалий интенсивно встряхивают на вортексе до образования суспензии.

4. Осветляют полученную суспензию путем центрифугирования в течение 20 мин при
3 тыс об/мин.

5. Надосадочная жидкость (осветленный экстракт фекалий) используют для экстракции РНК. При необходимости хранения отбирают в одноразовую пробирку и замораживают.

Осветленный экстракт фекалий может храниться в течение 1 сут при температуре от 2 до
8 °С, при температуре не выше минус 16 °С – до 1 мес с глицерином, при температуре не выше минус 68 °С и с глицерином – длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

При работе всегда следует выполнять следующие требования:

- Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в трех отдельных помещениях (зонах). Запрещается перемещение персонала из помещения для электрофореза в другие рабочие помещения лаборатории. Смена рабочей верхней одежды, головных уборов, обуви и перчаток является обязательным условием при выходе из помещения для электрофореза. Работу следует начинать в Зоне Экстракции, продолжать в Зонах Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы, оборудование и реактивы в Зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса. Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается переносить их из одного помещения в другое.

ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов.

- Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических дозаторов с фильтром. Одноразовую пластиковую посуду необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для обеззараживания медицинских отходов.

- При работе с включенным трансиллюминатором пользоваться защитным экраном или защитной маской.

- Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо подвергать ультрафиолетовому облучению в течение 30 мин.

- Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции.

- Допускать к работе с набором только специально обученный персонал.

- Не использовать набор по истечении срока годности.

- Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во время работы с образцами и реактивами. Тщательно вымыть руки по окончании работы.

- Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за медицинской помощью.

- Листы безопасности материалов (MSDS – material safety data sheet) доступны по запросу.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ, ТРЕБУЕМЫЕ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР-АНАЛИЗА.

(с указанием фирм-производителей / поставщиков):

Для этапа экстракции РНК из проб требуются:

7. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки на 1,5 мл (например, Axygen, США).

9. Одноразовые наконечники для дозаторов с фильтром до 200 мкл и до 1000 мкл (например, Axygen, США).

10. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например, Axygen, США).

11. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 °С.

12. Отдельный халат, шапочка, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.

13. Емкость для сброса наконечников.

Для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации требуются:

6. Одноразовые наконечники с фильтром до 200 мкл (например, Axygen, США).

7. Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР на 0,5 (0,2) мл (например, Axygen, США).

9. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 °С.

10. Отдельный халат и одноразовые перчатки.

11. Емкость для сброса наконечников.

Для детекции продуктов ПЦР-амплификации методом электрофореза в агарозном геле требуются:

6. Холодильник от 2 до 8 °С.

7. Микроволновая печь для плавления агарозы.

8. Колба коническая из термостойкого стекла (ГОСТ ) для плавления агарозы на 250 мл.

9. Мерный цилиндр на 1 л (ГОСТ 1770-74).

12. Одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе (например, Axygen, США).

13. Пластиковая емкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид этидия.

14. Отдельный халат и одноразовые перчатки.

ЭТАП 1. Экстракция РНК из Проб.

Проводится в ЗОНЕ-1 - помещении для обработки исследуемого материала.

1. Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 (если они хранились при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при 60–65 оС до полного растворения кристаллов.

2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок (включая отрицательный контроль экстракции). Внести в каждую пробирку 5 мкл ВКО Rotavirus-rec. Затем по 450 мкл лизирующего раствора. Промаркировать пробирки.

3. Внести в каждую пробирку по 50 мкл ОКО. Промаркировать пробирки.

4. В пробирки с лизирующим раствором, ВКО Rotavirus-rec и ОКО внести по 50 мкл фекальных экстрактов, используя наконечники с фильтром. В пробирку отрицательного контроля (В–) экстракции внести 50 мкл ОКО.

5. Плотно закрытые пробы тщательно перемешать на вортексе и проценрифугировать в течение 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге для удаления капель со внутренней поверхности крышки пробирки.

6. Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 1 мин, еще раз перемешать и оставить на 5 мин.

7. Процентрифугировать пробирки для осаждения сорбента при 10 тыс об/мин в течение 30 с на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

8. Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 1. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

9. Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3. Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. Проценрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

10. Повторить отмывку раствором для отмывки 3, следуя пункту 9.

11. Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 4. Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге. Полностью удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсасыватель.

12. Поместить пробирки в термостат при температуре 60 ºС на 10-15 мин для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

13. В пробирки добавить по 50 мкл РНК-буфера, используя наконечник с фильтром, свободный от РНКаз. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат 60 ºС на 2-3 мин. Перемешать на вортексе и процентрифугировать пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги (12-13 тыс об/мин) в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенные РНК и ДНК. Пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции и ПЦР.

Реакцию обратной транскрипции следует проводить сразу после получения РНК/ДНК-пробы. Отбирать раствор РНК/ДНК для реакции нужно очень осторожно, не захватывая сорбент. Если сорбент взмутился, необходимо осадить его на центрифуге.

Очищенная РНК может храниться до 4 часов при температуре от 2 до 8 °С. Для длительного хранения препарата, необходимо, не захватывая сорбент, отобрать раствор РНК/ДНК, перенести в стерильную пробирку и хранить при минус 68 оС в течение года.

ЭТАП 2. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ, ПЦР-Амплификации.

(Проводится в ЗОНЕ 2 – помещении для проведения ПЦР-амплификации.)

(Общий объем реакции - 20 мкл, объем РНК-пробы – 10 мкл.)

ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку RNase-free, DNase-free.

I. Проведение реакции обратной транскрипции.

1. Отобрать необходимое количество пробирок на 0,5 (0,2) мл.

2. Приготовить реакционную смесь на 12 реакций. Для этого в пробирку c RT-mix внести 5 мкл RT-G-mix-1, тщательно перемешать на вортексе, осадить капли с крышки пробирки.

3. К полученному раствору добавить 6 мкл ревертазы (MMlv), пипетировать 5 раз, перемешать на вортексе. Осадить капли с крышки пробирки.

4. Внести в пробирки по 10 мкл готовой реакционной смеси.

5. Используя наконечник с барьером, добавить 10 мкл РНК-пробы в пробирку с реакционной смесью. Осторожно перемешать.

6. Поставить пробирки в амплификатор (термостат) при температуре 37 °С на 30 мин.

7. Полученный в реакции обратной транскрипции препарат кДНК для последующей постановки ПЦР развести в 2 раза ДНК-буфером (к 20 мкл кДНК отдельным наконечником добавить 20 мкл ДНК-буфера, аккуратно перемешать пипетированием 10 раз).

Готовый препарат кДНК можно хранить в течение недели при температуре не выше минус 16 °С или в течение года при температуре при минус 68°С.

II. Проведение ПЦР-амплификации.

(Общий объем реакции - 25 мкл, объем кДНК-пробы – 10 мкл.)

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

1. Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-R Rotavirus для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.

2. На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue, при этом ПЦР-смесь-2 blue не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-R Rotavirus.

3. Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл).

Б. Проведение амплификации.

1. Взять подготовленные для ПЦР пробирки. Под масло или непосредственно на масло, используя наконечники с фильтром, внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.

2. Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контроль (К-) - вместо кДНК-пробы внести в подготовленную пробирку 10 мкл ДНК-буфера;

б) положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО кДНК Rotavirus.

3. Запустить на амплификаторе нужную программу (см. табл. 1). Когда температура в ячейке амплификатора достигнет 95 °С, поместить пробирки в ячейки амплификатора, закрыть крышку прибора и снять программу с паузы.

Время амплификации на амплификаторе с регулированием температур по матрице примерно 2 ч, на амплификаторе с активным регулированием – 1 ч 30 мин.

Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).

Программа для амплификации участка кДНК Rotavirus.

Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке):

Амплификаторы с матричным регулированием температуры:

PTC-100 (MJ Research)

GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems), Gradient Palm Cycler (Corbett Research), MaxyGene (Axygen)

Информация о документе
Дата добавления:
Размер:
Доступные форматы для скачивания:

по применению набора реагентов

для выявления РНК энтеровируса 71 типа ( Enterovirus 71 типа) в объектах окружающей среды и биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора,

Российская Федерация, 111123,

город Москва, улица Новогиреевская, дом 3а

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3

ПРИНЦИП МЕТОДА 3

ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ 4

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 5

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 7

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ 7

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ 9

ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА 10

ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАЦИИ РНК 10

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ 12

ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ 13

ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И АМПЛИФИКАЦИИ 13

А. Подготовка пробирок для проведения ОТ-ПЦР 13

Б. Проведение ОТ-ПЦР 16

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ 17

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ 19

ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ 20

А. Подготовка пробирок для проведения ОТ-ПЦР 20

АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ 23

СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ 25

СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ 26

В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:

- внутренний контрольный образец

- геномные эквиваленты микроорганизма

- положительный контроль этапа ПЦР

- отрицательный контроль этапа ПЦР

- комплементарная ДНК, полученная в ходе реакции обратной транскрипции

- отрицательный контроль этапа экстракции

- полимеразная цепная реакция

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной диагностике заболевания 1 ) .

ПРИНЦИП МЕТОДА

ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ

Набор реагентов выпускается в 1 формате.

Набор реагентов выпускается в 2 формах комплектации:

Форма 2 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным реагентам, с маркировкой реагентов на их оптовой фасовке.

Форма комплектации 2 предназначена для производственных целей для последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам.

ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 2 используется только в соответствии с регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Комплект для экстракции РНК

Комплект для обратной транскрипции, амплификации и детекции

Аналитическая чувствительность 2 ) ,

Спинномозговая жидкость (СМЖ), концентраты образцов воды

вариант FEP/FRT-50 F

5х10 3

вариант FEP/FRT-50 F

1х10 4

Специфичность набора реагентов проверялась на следующих штаммах микроорганизмов: энтеровирусов человека (представителей разных генетических кластеров – Human echovirus 2, 6, 9, 11, 14, 15, 16, 17, 18, 30; Human coxsackievirus A4, A5, A6, A9, A16, B4, B5 , Human poliovirus 1, 2, 3 (Sabin1, Sabin2, Sabin3)); вирусов гриппа А (H23N2, H9N2, H8N4, H3N3, H5N6, H21N6, H22N5, H4N8, H2N1, H6N2, H20N7, H6N1), В, риновирусов, RS вирусов, аденовирусов человека – 3, 5, 7, 37, 40, 41 типов (клинические изоляты, специфичность подтверждена прямым секвенированием нуклеотидных последовательностей); штаммах микроорганизмов и образцах ДНК – ДНК человека, штаммах Acinetobacter baumanii ATCC ® 19606™, Bacteroides fragilis ATCC ® 25285™, Bordetella bronchiseptica ATCC ® 10580™, Bordetella bronchiseptica ATCC ® 4617™, Bordetella pertussis ATCC ® 9340™, Candida albicans ATCC ® 14053™, Candida guilliermondii ATCC ® 6260™, Candida krusei ATCC ® 14243™, Clostridium difficile ATCC ® 9689™, Clostridium septicum ATCC ® 12464™, Corynebacterium jeikeium ATCC ® 43734™, Corynebacterium xerosis ATCC ® 373™, Eggerthella lenta ( Eubacterium lentum ) ATCC ® 43055™, Enterobacter aerogenes ATCC ® 13048™, Enterobacter cloacae ATCC ® 13047™, Enterococcus faecalis ATCC ® 29212™, Enterococcus faecalis ( vancomycin resistant ) ATCC ® 51299™, Enterococcus faecium ATCC ® 35667™, Erysipelothrix rhusiopathiae ATCC ® 19414™, Escherichia coli ATCC ® 25922™, Escherichia coli ATCC ® 35218™, Fluoribacter ( Legionella ) dumoffii ATCC ® 33279™, Haemophilus infuenzae ATCC ® 33930™, Haemophilus influenzae ATCC ® 9006™, Haemophilus influenzae ATCC ® 10211™, Haemophilus parainfluenzae ATCC ® 7901™, Klebsiella oxytoca ATCC ® 49131™, Klebsiella pneumoniae ATCC ® 27736™, Legionella pneumophila ATCC ® 33152™, Listeria grayi ( murrayi ) ATCC ® 25401™, Listeria innocua ATCC ® 33090™, Listeria monocytogenes ATCC ® 7644™, Moraxella ( Branhamella ) catarrhalis ATCC ® 25238™, Moraxella ( Branhamella ) catarrhalis ATCC ® 8176™, Neisseria meningitidis ATCC ® 13102™, Neisseria meningitidis ATCC ® 13090™, Neisseria lactamica ATCC ® 23970™, Neisseria gonorrhoeae ATCC ® 19424™, Neisseria gonorrhoeae ATCC ® 49926™, Peptoniphilus ( Peptostreptococcus ) anaerobius ATCC ® 27337™, Proteus mirabilis ATCC ® 12453™, Proteus vulgaris ATCC ® 6380™, Propionibacterium acnes ATCC ® 11827™, Pseudomonas aeruginosa ATCC ® 15442™, Rhodococcus equi ATCC ® 6939™, Salmonella enterica subsp . enterica serovar Typhimurium ATCC ® 14028™, Serratia marcescens ATCC ® 14756™, Staphylococcus aureus ATCC ® 6538P™, Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC ® 43300™, Staphylococcus aureus ATCC ® 29213™, Staphylococcus aureus ATCC ® 25923™, Staphylococcus aureus ATCC ® 33862™, Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC ® 33591™, Staphylococcus aureus subsp . aureus ATCC ® 12600™, Staphylococcus epidermidis ATCC ® 12228™, Staphylococcus haemolyticus ATCC ® 29970™, Staphylococcus saprophyticus ATCC ® 49907™, Stenotrophomonas maltophilia ATCC ® 13637™, Streptococcus agalactiae ATCC ® 12386™, Streptococcus agalactiae ATCC ® 13813™, Streptococcus equisimilis ATCC ® 12388™, Streptococcus equi subsp . equi ATCC ® 9528™, Streptococcus bovis (Group D) ATCC ® 9809™, Streptococcus mutans ATCC ® 35668™, Streptococcus pneumoniae ATCC ® 49619™, Streptococcus pneumoniae ATCC ® 6303™, Streptococcus pneumoni ae ATCC ® 27336™, Streptococcus pneumoniae ATCC ® 6305™, Streptococcus pyogenes ATCC ® 19615™, Streptococcus salivarius ATCC ® 13419™, Streptococcus uberis ATCC ® 700407™, Trichophyton mentagrophytes ATCC ® 9533™, Vibrio parahaemolyticus ATCC ® 17802™, Vibrio vulnificus ATCC ® 27562™, Moraxella catarrhalis ATCC ® 25240™. При проведении тестирования данных панелей, а также образцов ДНК человека, неспецифических реакций выявлено не было.

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Сравнительные характеристики набора реагентов:

Результативность применения метода сравнения 3 )

Выявление вирусов рода Enterovirus (Echovirus, Сoxsackievirus, Poliovirus), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяется генетический материал (РНК) вируса в образце биоматериала.

Энтеровирусы, энтеровирусная инфекция [полимеразная цепная реакция].

Синонимы английские

EV, RNA [polymerase chain reaction, PCR].

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Исключить прием слабительных препаратов, введение ректальных свечей, масел, ограничить (по согласованию с врачом) прием медикаментов, влияющих на перистальтику кишечника (белладонна, пилокарпин и др.), и препаратов, влияющих на окраску кала (железо, висмут, сернокислый барий), в течение 72 часов до сбора кала.

Общая информация об исследовании

Enterovirus – это группа РНК-содержащих вирусов, характеризующихся нуклеокапсидом в форме икосаэдра и отсутствием оболочки. Они относятся к семейству Picornaviridae, в которое также входят возбудитель вирусного гепатита А и риновирус.

Род Enterovirus объединяет несколько десятков различных вирусов, являющихся возбудителями целого спектра заболеваний человека: полиомиелита (Poliovirus), миокардита и перикардита (Сoxsackievirus В), вирусной пузырчатки полости рта и конечностей, герпетической ангины, асептического менингита и энцефалита (Сoxsackievirus A, Echovirus), а также более редких болезней. Для всех вирусов рода Enterovirus характерен схожий патогенез: попадание возбудителя в желудочно-кишечный тракт (фекально-оральный путь передачи), репликация в эпителиальных клетках слизистой оболочки ЖКТ и гематогенное распространение с поражением различных органов и тканей. Учитывая эти особенности заражения, основными биологическими средами для выявления Enterovirus являются отделяемое носоглотки, кал и ликвор. Как правило, острая инфекция Enterovirus протекает бессимптомно или в доброкачественной форме, а клиническая картина заболевания развивается лишь спустя некоторое время после первичного заражения. Эту особенность следует учитывать при выборе вида биоматериала, направляемого на анализ.

Для выявления возбудителя при подозрении на Enterovirus-ассоциированную инфекцию применяют серологические тесты, выделение вируса в культуре клеток и молекулярную диагностику.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод молекулярной диагностики, позволяющий выявлять в биологическом материале (например, в ликворе) фрагменты генетического материала (РНК) возбудителя инфекции. Она характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, а также позволяет получить результат в более короткие сроки по сравнению с большинством других анализов, что делает ее незаменимым инструментом для своевременной диагностики Enterovirus-ассоциированных инфекций.

ПЦР является "золотым стандартом" исследования ликвора для диагностики Enterovirus-ассоциированного менингоэнцефалита. Чувствительность такого анализа составляет 95-97 %, специфичность – 97-100 %. Благодаря этим преимуществам ПЦР заменила другой прямой метод идентификации возбудителя – выделение вируса в культуре клеток эмбриона. При этом исследование ликвора, полученного в первые 2 дня развития симптоматики менингоэнцефалита, характеризуется меньшей чувствительностью. Следует отметить, что вероятность обнаружить вирус при анализе нестерильных биологических сред (отделяемого носоглотки, кала) меньше, что необходимо учитывать при отрицательном результате анализа у пациента с клиническими признаками Enterovirus-ассоциированной инфекции. Большая частота ложноотрицательных реакций связана с полной элиминацией вируса из клеток ЖКТ к моменту развития симптомов заболевания (период репликации вируса в эпителии глотки составляет от 2 дней до 2 недель, в эпителии кишки – до 3 месяцев). Также ниже и специфичность метода при исследовании нестерильных сред, что связано с возможным "здоровым носительством" Enterovirus, сопутствующим клинически выраженному заболеванию, но не являющимся ее причиной.

ПЦР основана на непосредственном выявлении РНК вируса и может быть применена для выявления Enterovirus на раннем этапе болезни, что отличает ее от серологических (непрямых) методов, требующих около 2-4 недель для оценки динамики уровня выявляемых специфических антител. Однако по этой же причине ПЦР не позволяет различить острую и хроническую энтеровирусную инфекцию.

Благодаря тому, что в ПЦР выявляется общий для всех Enterovirus фрагмент РНК, она позволяет определить наличие любого представителя этого рода. Современные серологические методы разработаны только для 11 из более чем 70 вирусов рода Enterovirus. Однако по этой же причине с помощью ПЦР нельзя различить вирусы рода Enterovirus между собой, что имеет определенное значение в дифференциальной диагностике Enterovirus 71 – и Сoxsackievirus type A 16 – ассоциированного поражения нервной системы.

Диагностиказаболеваний, вызванных вирусами рода Enterovirus, представляет определенные трудности и требует проведения дополнительных лабораторных, а также инструментальных исследований.

Для чего используется исследование?

Для диагностики Enterovirus-ассоциированных инфекций:

• менингита;
• герпетической ангины;
• вирусной пузырчатки полости рта и конечностей;
• миоперикардита;
• полиомиелита.

Когда назначается исследование?

• менингита (головная боль, раздражительность, лихорадка, фотофобия, тошнота и не приносящая облегчения рвота, ригидность затылочных мышц);
• герпетической ангины (острое начало заболевания, лихорадка с температурой 39-40 ºС, головная боль, тошнота, рвота, болезненная шейная лимфаденопатия, везикулезная сыпь на слизистой оболочке миндалин, мягкого и твердого неба, боль при глотании);
• вирусной пузырчатки полости рта и конечностей у детей (лихорадка, кашель, везикулезная сыпь на коже кистей, стоп и на слизистой оболочке рта);
• миоперикардита (одышка, загрудинная боль, усиливающаяся на вдохе и ослабевающая при наклоне вперед, а также периферические отеки и нарушения ритма сердца);
• полиомиелита (лихорадка, головная боль, тошнота, боль в животе, парез или паралич конечностей или группы мышц, нарушения глотания, пронации и др.).

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

• Enterovirus-ассоциированная инфекция;
• носительство Enterovirus.

• отсутствие Enterovirus в исследуемом биоматериале.

Что может влиять на результат?

• Применение рибавирина и плеконарила может приводить к получению ложноотрицательного результата.
• Применение противовирусного иммуноглобулина не влияет на результат исследования.
• Анализ ликвора в первые 2 дня менингоэнцефалита, а также исследование отделяемого носоглотки и кала характеризуются большей частотой ложноотрицательных результатов.



Кто назначает исследование?

Инфекционист, невролог, педиатр, стоматолог, врач общей практики.

Литература

• Sawyer MH. Enterovirus infections: diagnosis and treatment. Semin Pediatr Infect Dis. 2002 Jan;13(1):40-7. Review.
• Rhoades RE, Tabor-Godwin JM, Tsueng G, Feuer R. Enterovirus infections of the central nervous system. Virology. 2011 Mar 15;411(2):288-305. Epub 2011 Jan 20.
• Ooi MH, Wong SC, Lewthwaite P, Cardosa MJ, Solomon T. Clinical features, diagnosis, and management of enterovirus 71. Lancet Neurol. 2010 Nov;9(11):1097-105.
• Smalling TW, Sefers SE, Li H, Tang YW. Molecular approaches to detecting herpes simplex virus and enteroviruses in the central nervous system. J Clin Microbiol. 2002 Jul;40(7):2317-22.
• Hsiung GD, Wang JR. Enterovirus infections with special reference to enterovirus 71. J Microbiol Immunol Infect. 2000 Mar;33(1):1-8.