Капсид вируса в спермограмме
МОСКВА, 24 янв — РИА Новости, Татьяна Пичугина. Есть вирусы, проникающие в семенники мужчины и задерживающиеся там надолго — порой на всю жизнь. Эта проблема привлекла внимание ученых, поскольку возникла надежда на лечение некоторых случаев бесплодия.
Зловещую славу вирусу Зика принесла его способность вызывать серьезные пороки развития плода в материнской утробе. Мало того, согласно последним данным, вирус Зика поражает сперматозоиды и сохраняется в семенниках в течение нескольких недель после того, как человек выздоровел и следы инфекции исчезли из крови и мочи.
"Что происходит дальше с инфицированными вирусом сперматозоидами, никто не знает. Таких данных в научной литературе нет", — рассказывает РИА Новости доктор биологических наук Елизавета Брагина из Института физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского МГУ, первый автор обзора "Spermatozoon as a Vehicle for Viruses" ("Сперматозоиды как носители вирусов").
Однажды, исследуя мужскую сперму с помощью электронной микроскопии, Брагина увидела, что сперматозоид поражен вирусом герпеса. Это ее заинтересовало, и она поделилась открытием с медиками. Известно, что такие вирусы, как ВИЧ, гепатит C или герпес, передаются при половом контакте. А могут ли притаившиеся в сперматозоиде вирусы поразить яйцеклетку и затем зародыш в утробе? Это в науке называется вертикальным переносом.
"Вертикальный перенос четко показан для вируса гепатита B. Много работ подтверждают это на клиническом материале и модельных системах на животных. В Китае наблюдали за парами, в которых мужчина инфицирован герпесом, а женщина — нет, однако беременность прерывалась спонтанным выкидышем. Ученые выделили вирусы герпеса из спермы и нерожденного плода, доказав методами молекулярной биологии, что они идентичны. Все подобные работы свидетельствуют: инфицирование яйцеклетки через сперму часто приводит к остановке развития эмбриона ", — продолжает исследовательница.
Клинических данных о том, что ВИЧ передается от сперматозоида к яйцеклетке, нет. Есть только косвенные подтверждения в опытах на хомячках, когда яйцеклетку грызуна оплодотворяли в чашке Петри инфицированным человеческим сперматозоидом. Вирус был замечен уже на стадии двух бластомеров, затем зародыш прекращал развиваться. Впрочем, выяснился и обнадеживающий факт: заражены всего 2-3% сперматозоидов больного ВИЧ. То есть вероятность вертикального переноса невелика. Аналогичные результаты получены для вируса папилломы человека и гепатита B. У их носителей в среднем более здоровое потомство, поскольку яйцеклетку наверняка настигнет незараженный вирусом сперматозоид. Если же ей не повезет и она подцепит вирусный, то эмбрион погибнет еще в утробе.
"Организм защищается. Когда вирусная инфекция поражает зародыш, он просто перестает развиваться", — говорит Брагина и уточняет, что все-таки ВИЧ-инфицированные мужчины чаще всего пользуются услугами центров репродукции, где их сперматозоиды сначала тщательно очищают. В 90% случаев после очистки вирус в семенной жидкости не обнаруживают, а остальным предлагают воспользоваться банком донорской спермы.
О вертикальном переносе герпеса прямых данных тоже нет. Косвенные свидетельства основаны на наблюдениях за мужчинами, не раз пытавшихся стать отцами, но безуспешно: беременность супруги неизменно оканчивалась выкидышем. У таких мужчин часто выявляют в сперме вирус герпеса.
"В совместной работе с коллегами с кафедры клинической андрологии РУДН мы показали, что если мужчин с герпесом пролечить, число удачных беременностей повышается. Правда, это относится к вспомогательным репродуктивным технологиям, но такие же сведения поступают и о естественной беременности", — говорит Брагина.
По ее словам, в России есть врачи, обращающие внимание на эти работы и отправляющие супруга на анализы, если видят, что женщина перенесла пять-шесть привычных выкидышей или несколько неудачных искусственных оплодотворений, когда эмбрион застывает в развитии. Выявив герпес, мужчину лечат, после чего среди таких пар число удачных беременностей вырастает вдвое.
Генитальный герпес (ГГ), возбудителем, которого является вирус простого герпеса (ВПГ) – одно из наиболее распространенных инфекционных заболеваний урогенитального тракта.
Негативное влияние ВПГ-инфекции на репродуктивные органы, как у женщин, так и у мужчин и, особенно, на мужскую фертильность, превращает эту проблему в серьезную макросоциальную задачу. По литературным данным вирусом простого герпеса инфицированы органы мочеполовой системы (МПС) у 40-60% взрослого населения. При ВПГ-инфекции гениталий поражаются кожа и слизистые оболочки половых органов (герпес наружных гениталий), а также органы малого таза (герпес внутренних гениталий).
Клинически герпес наружных гениталий может протекать в типичной, атипичной и субклинической формах.
Клинические формы ГИ органов малого таза (ОМТ) у мужчин целесооб¬разно разделить на:
- герпес нижнего отдела урогенитального тракта, анальной области и ампулы прямой кишки и
- герпес верхнего отдела полового тракта.
Еще недавно изучением ГГ традиционно занимались дерматовенерологи. Сегодня стало понятно, что эта проблема выходит за рамки дерматовенерологии и становится предметом обсуждения как гинекологов, так урологов и андрологов.
Герпетический простатит
В современной этиопатогенетической классификации простатитов вирусные простатиты расцениваются как инфекционные каналикулярные осложнения вирусных уретритов. В развитии вирусных простатитов чаще наблюдается уретрогенный путь передачи, а нисходящий (урогенный) путь встречается редко.
| Клинико-вирусологическая характеристика герпетических поражений органов малого таза у мужчин (Т.Б.Семенова, 2000) | |||
|---|---|---|---|
| Локализация очага поражения | Форма ВПГ-инфекции | Клинические проявления | Вирусологическая характеристика |
| ВПГ-инфекция нижнего отдела урогенитального тракта и анальной области: - уретра - мочевой пузырь - анус - ампула прямой кишки | Очаговая форма | Единичные или сгруппированные на эритематозном фоне везикулезно-эрозивные элементы; в анальной области - трещины | Выделение ВПГ из очага поражения (соскоб или мазки-отпечатки) цитологическими методами, методом иммуно-флюоресценции (ИФ), посев на культуру клеток |
| Диффузная форма | Клинические симптомы хронического неспецифического воспаления ОМТ | Выделение ВПГ из отделяемого урогени-тального тракта и ануса (ПЦР, посев на культуру клеток) | |
| ВПГ-инфекция верхнего отдела полового тракта: -предстательная железа -семенные пузырьки | Типичная форма | Клинические симптомы хронического неспецифического воспаления ОМТ | Выделение ВПГ из отделяемого уретры, сока простаты, спермы (ПЦР, посев на культуру клеток) |
| Субклиническая форма | Нет клинических признаков воспаления. При микроскопии отделяемого уретры и сока простаты опреде-ляется лейкоцитоз (40-50 в п/зр), лейкоспермия | Выделение ВПГ из отделяемого уретры, сока простаты, спермы (ПЦР, посев на культуру клеток) | |
| Бессимптомная форма | Нет клинико-лабораторных данных, свидетельствующих о воспалительном процессе | Выделение ВПГ из отделяемого уретры, сока простаты, спермы (ПЦР, посев на культуру клеток) | |
В клинической практике диагноз хронического герпетического простатита ставится урологами редко. Между тем, при абактериальных простатитах нельзя исключить, что патогенным агентом является именно вирус. По оценкам разных авторов, простатит вызывается или поддерживается ВПГ в 2,9 - 21,8% случаев (Weidner et al., 1981).
В клиническом течении хронических простатитов (ХП) отмечаются функциональные сдвиги, репродуктивные изменения, болевой (с иррадиацией в наружные половые органы, промежность, поясницу) и дизурический синдромы.
Обострению вирусного простатита обычно предшествует появление герпетических высыпаний в области гениталий. Появление везикулезно-эрозивных элементов на коже и слизистых оболочках может совпадать с появлением жалоб со стороны предстательной железы (ПЖ). Нередко у больных РГГ простатит протекает субклинически: у этих пациентов диагноз простатита ставится на основании появления лейкоцитоза в секрете простаты и уменьшения числа лецитиновых зерен.
Герпетический простатит может существовать, в виде изолированной формы ГИ. В этом случае рецидивы ГГ отсутствуют и, ВПГ не определяется в отделяемом уретры. Этиологический диагноз основывается на обнаружении ВПГ в секрете ПЖ, при этом, патогенная флора в секрете простаты и в третьей порции, мочи отсутствует.
При ультразвуковом исследовании предстательной железы в области парауретральных зон простаты определяются гиперэхогенные фиброзные очаги размером 3-9 мм. У больных с герпетическим простатитом по сравнению с абактериальными простатитами неясной этиологии отмечается большая выраженность фиброзных отделов в области периферических зон. Наряду с этим имеет место расширение семенных пузырьков, указывающие на нарушение их дренирования в заднюю уретру, что позволяет пред¬положить поражение простатической маточки (Т.Б.Семенова, В.Б. Стоянов 2001).
Вирусоспермия
До сих пор нет однозначного понимания всех причин патоспермии. Мужская репродуктивная система весьма чувствительна к повреждающему и модифицирующему действию самых разнообразных патогенных факторов, ведущих к нарушению процесса сперматогенеза.
Одним из факторов нарушения мужской фертильности и развития патоспермии являются инфекционно-воспалительные процессы различных отделов урогенитального тракта. Известно, что в сперме мужчин, наблюдающихся по поводу различных видов беспло¬дия, наряду с разнообразными патогенными бактерия¬ми выявляются герпесвирусы (ВПГ, ЦМВ, ВЭБ), вирус папилломы человека, вирус гепатита С, аденовирусы.
Если роль бактериальных микроорганизмов, включая ряд ИППП, в нарушении репродуктивной функции у мужчин считается доказанной, то до последнего времени оставалась невыясненной роль вирусов, в частности ВПГ, при мужской инфертильности. Основной вопрос состоит в том, является ли присутствие вируса в эякуляте результатом контаминации или имеет место истинное внутриклеточное инфицирование.
Целью настоящего исследования явились:
- оценка влияния герпетической инфекции на репродуктивное здоровье мужчин,
- изучение роли ВПГ как этиологического фактора в развитии рецидива хронического простатита.
- Мужчины с первичным и вторичным идиопатическим бесплодием.
- Мужчины, чьи жены наблюдались у гинекологов, в связи с различными формами патологии беременности (синдромом потери плода, смертью плода и новорожденного, при аутопсии, ко¬торых определялась внутриутробная ВПГ-инфекция).
- Мужчины с хроническим простатитом и РГГ.
Для обследования пациентов был использован новый метод электронно-микроскопического исследования спермы (ЭМИС), разработанный научным коллективом авторов МГУ под руководством д.б.н. Е.Е.Брагиной. Внедрение ЭМИС в практику позволило существенно расширить границы понимания причин идиопатического бесплодия. С помощью ЭМИС стало возможным выявление нарушений в сперматозоидах, которые ранее при светооптической микроскопии были не доступны: удалось установить аномалии центриоли, хроматина, обнаружить внутриклеточную вирусную инфекцию. Было проведено электронно-микроскопическое исследование эякулята 391 пациента с нарушениями фертильности. В каждом образце эякулята производили подсчет сперматозоидов, содержащих внутриклеточные капсиды ВПГ, общее количество исследованных сперматозоидов – не менее 100. В образцах эякулята 161 пациента (41%) были выявлены сперматозоиды, содержащие капсиды ВПГ. Количество ВПГ-содержащих сперматозоидов составляло от 2 до 20% от общего количества (Брагина Е.Е. с соавт., 2000; Бочарова Е.Н. с соавт., 2003).
Исследования показали, что ВПГ присутствует не только в семенной жидкости или на поверхности клеток, но и внутри самих сперматозоидов. Серьезного внимания заслуживает тот факт, что внутриклеточное инфицирование ВПГ было выявлено во фракции подвижных сперматозоидов с нормальной морфологией. Это позволяет сделать предположение о возможности оплодотворения яйцеклеток инфицированными сперматозоидами, что, в случаях зачатия, может с большой вероятностью привести к осложнениям беременности, развитию патология плода и новорожденного.
Для оценки состояния репро¬дуктивной системы группа мужчин (70 человек в возрасте от 26 до 38 лет) прошла в Герпетическом центре стандартное клинико-лабораторное обследование: диагностика и, при необходимости, лечение ИППП, иссле-дование эякулята, обследование простаты и добавочных половых желез, исследование им¬мунного, а, при необходимости, гормонального статуса. Всем мужчинам было проведено углубленное вирусологическое обследование органов МПС с использованием методов культуральной (посев) и ПЦР диагностики, а также электронно-микроскопического исследования спермы (ЭМИС). Для исключения возможной контаминации вирусов из мочевого пузыря или уретры последовательно забирали материал сначала из уретры, затем исследовали секрет простаты, мочу и эякулят. За рамками исследования остались микст-инфекции – вирусно-вирусные и вирусно-бактериальные ассоциации.
В ходе исследования были поставлены следующие задачи:
- Изучить роль ВПГ в этиологии хронического простатита у мужчин с рецидивирующим герпесом гениталий (РГГ) – 1 группа (18 чел.)
- Проанализировать частоту выделения ВПГ в эякуляте и секрете простаты у мужчин с субклинической и бессимптомной формами ГГ, поступивших на обследование по поводу бесплодного брака – 2 группа (52 чел.)
Приведенный материал свидетельствует о необходимости целенаправленного вирусологического обследования мужчин, в семьях, где планируется беременность. Мы убеждены, что бессимптомные формы ВПГ-инфекции органов МПС встречаются значительно чаще, чем принято считать.
Лечение вирусоспермии
Учитывая пожизненное носительство ВПГ в организме человека, основной целью терапии ГИ является достижение стойкой ремиссии, результатом которой, в рассматриваемых нами случаях, будет наступление беременности (в проблемных по ВПГ-инфекции супружеских парах) и физиологическое ее завершение.
Использованная литература
 | Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 |
2. Ультраструктура сперматозоидов с вирусоподобными инородными включениями
Проводили ультраструктурное исследование сперматозоидов из образцов эякулята 19 пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности и у которых у которых с помощью реакции иммунофлюоресценции выявлены белки вируса простого герпеса и/или обнаружена инфекционная активность вируса простого герпеса с помощью быстрого культурального метода. В сперматозоидах 13 образцов выявили структуры, имеющие вид двухконтурных мембранных пузырьков с диаметром внешнего контура 120-140 нм и диаметром внутреннего контура 90-110 нм. Сердцевина этих структур по электронной плотности не отличалась от пространства между наружной и внутренней мембранами. У части пузырьков прослеживалась гексагональная структура наружного листка. На основании сравнения морфологических данных было сделано заключение о том, что в сперматозоидах выявляются капсиды вирусов группы герпеса.
Возникает вопрос, почему в сперматозоидах наблюдается только одна форма капсидов – двухконтурные структуры с электронно-прозрачной сердцевиной, то есть, почему не происходит инкапсуляция ДНК? Было предположено, что капсиды в цитоплазматической капле сперматозоидов наблюдаются тогда, когда прекращение ядерно-цитоплазматического транспорта совпадает с синтезом и накоплением в цитоплазме поздних структурных белков вируса, формирующих капсид (2001). Эти белки не могут попасть в ядро, где они должны сформировать капсиды, в которые инкапсулируется ДНК. Если конденсация хроматина совпадает с ранними стадиями жизненного цикла вируса, оформленные герпетические капсиды не выявляются при электронно-микроскопическом изучении, хотя вирусные белки (обнаруживаемые с помощью реакции иммунофлюоресценции) присутствуют.
В настоящей работе показано, что капсиды вируса простого герпеса могут быть обнаружены в ядрах сперматозоидов, наблюдали капсиды в перинуклеарном пространстве ядер и в районе пор ядерной оболочки. Эти данные позволяют считать, что капсиды формируются в ядрах сперматозоидов. Возможно, капсиды в ядрах не выявляются из-за плотности конденсированного хроматина.
3. Идентификация вирусной природы инородных включений в сперматозоидах человека
3.1. Выявление белков вируса простого герпеса с помощью реакции иммунофлюоресценции
Реакцию иммунофлюоресценции проводили с использованием моноклональных антител к сверхранним (МКА 4а – моноклональные антитела к белкам капсида c м. м.32 кД, который появляется в ядре через 45 мин после инфицирования, предположительно α), ранним (МКА 3е5 – появляется в ядре через 1,5 час после инфицирования, предположительно β) и поздним (МКА 2С – поверхностный gB, появляется через 4 час после инфицирования в цитоплазме, предположительно γ) белкам вируса простого герпеса. Антигены вируса простого герпеса визуализировались в виде зеленого свечения в головках сперматозоидов.
В этой серии экспериментов исследовали 101 образец эякулята. Из них для спермиологического обследования после лечения воспалительных заболеваний урогенитального тракта различной этиологии (хламидиоз, уреаплазмоз, гонорея) обратились 22 пациента (1-ая группа), 25 пациентов (2-ая группа) проходили спермиологическое обследование по поводу бесплодия, 34 пациента (3-я группа) проходили профилактическое обследование при планировании беременности жены, у 20 пациентов (4-ая группа) в анамнезе жены имелось спонтанное прерывание беременности (табл. 1).
Выявление белков вируса простого герпеса с помощью
Не выявлены белки
После лечения воспалительных заболеваний урогенитального тракта
Спонтанное прерывание беременности у жены
В 1-ой группе пациентов все три вирусных белка выявлена у 9 человек (41%), во 2-ой группе – у 10 человек (40%), в 3-ей группе – у 9 человек (26%), в 4-ой группе – у 10 человек (50%) (рис. 3). Один или два белка в различных сочетаниях выявлены в 1-ой группе у 6 человек (27%), во 2-ой группе у 7 человек (28%), в 3-ей группе у 12 человек (35%), в 4-ой группе – у 4 человек (25%). Вирусные белки не выявлены в 1-ой группе у 7 пациентов (32%), во 2-ой группе – у 8 пациентов (32%), в 3-ей группе – у 13 человек (38%), в 4-ой группе – у 4 человек (25%).
Таким образом, в сперматозоидах могут быть обнаружены как белки всех стадий жизненного цикла вируса простого герпеса (сверхранние, ранние и поздние), так и белки одной или двух стадий жизненного цикла в различных сочетаниях (абортивная форма инфекции).
3.2. Выявление инфекционной активности вируса простого герпеса в эякуляте пациентов
Выявление инфекционной активности вируса простого герпеса проводили с помощью быстрого культурального метода в цельном эякуляте, семенной плазме и общей клеточной фракции эякулята 101 пациента, у которых проводили выявление сверхранних, ранних и поздних белков вируса простого герпеса.
Все три белка выявлены у 38 пациентов. Положительные результаты быстрого культурального метода в этой группе обнаружены у 31 человека (82%). Общая клеточная фракция исследована с помощью быстрого культурального метода у 29 человек, инфекционная активность выявлена у%).
Неполная экспрессия вирусных белков выявлена у 30 человек. Только сверхранние белки обнаружены у 7 пациентов (23%), сверхранние и ранние – у 9 (30%), сверхранние и поздние – у 2 (7%). Поздние белки выявлены у 8 человек (27%), ранние и поздние – у 4 (13%). Всего сверхранние белки выявлены у 18 человек (60%), ранние – у%), поздние – у%). При неполном наборе вирусных белков положительные результаты быстрого культурального метода наблюдали у 15 пациентов (50%), при анализе общей клеточной фракции выявлена инфекционная активность вируса у 5 человек (17 %).
Вирусные белки не обнаружены у 33 пациентов. Положительные результаты быстрого культурального метода наблюдали у 5 пациентов (15%), инфекционная активность вирусов выявлена в общей клеточной фракции у 3 пациентов (9%) (рис. 4).
Рис. 3. Выявление белков вируса простого герпеса в сперматозоидах с помощью реакции иммунофлюоресценции (в процентах).
1-ая группа – пациенты с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта в анамнезе; 2-ая группа – пациенты с нарушениями фертильности; 3-я группа – пациенты, проходившие профилактическое обследование; 4-ая группа – пациенты, у жен которых в анамнезе спонтанное прерывание беременности.
1 – выявление α, β и γ белков вируса простого герпеса; 2 – выявление одного или двух белков; 3 – не выявлены вирусные белки
Рис. 4. Определение инфекционной активности вируса простого герпеса в эякуляте пациентов с выявленными α, β и γ вирусными белками в сперматозоидах (1-ая группа), пациентов, у которых выявлены один или два белка (2-ая группа), пациентов с отрицательными результатами реакции иммунофлюоресценции (3-я группа)(%).
1 – общие положительные результаты быстрого культурального метода, 2 – положительные результаты быстрого культурального метода в общей клеточной фракции.
Таким образом, инфекционная активность вируса простого герпеса определялась статистически значимо чаще в тех образцах эякулята, в которых выявляли белки всех стадий жизненного цикла вируса (α, β и γ белки), чем в образцах с наличием одного или двух белков (p=0, 009).
3.3. Выявление белков вируса простого герпеса и инфекционной активности вируса в подвижной фракции сперматозоидов
Фракцию подвижных сперматозоидов исследовали в 39 образцах. Распределение по группам было следующим: основное количество образцов эякулята было от пациентов, у жен которых в анамнезе спонтанное прерывание беременности (20 образцов), 10 образцов от пациентов с нарушением фертильности, 4 – от пациентов с воспалительными заболеваниями в анамнезе и 5 – от лиц, проходивших профилактическое обследование. Во всех 15 образцах эякулята с отрицательными результатами реакции иммунофлюоресценции в общей клеточной фракции белки вируса простого герпеса не обнаружены и во фракции подвижных сперматозоидов.
Положительные результаты реакции иммунофлюоресценции при исследовании фракции подвижных сперматозоидов получили в 19 образцах: белки трех стадий жизненного цикла вируса обнаружили в 8 образцах (21%), белки одной или 2 стадий – в 11 образцах (28%). Инфекционная активность вируса простого герпеса выявлена в 4 исследованных образцах фракции подвижных сперматозоидов.
Таким образом, показано, что во фракции подвижных сперматозоидов могут быть обнаружены либо белки всех фаз жизненного цикла вируса простого герпеса, либо 1 или 2 белка в различных сочетаниях. Инфекционная активность вируса во фракции подвижных сперматозоидов определяется в 3,5 реже, чем белки вируса.
3.4. Выявление ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах методом гибридизации in situ
С помощью метода гибридизации in situ с зондами к ДНК вируса простого герпеса было изучено 37 препаратов от 29 пациентов. У 8 пациентов исследовали общую клеточную фракцию и фракцию подвижных сперматозоидов – результаты, полученные методом гибридизации in situ, совпадали (в образцах от 6 пациентов метка была выявлена, а у 2 – не визуализировалась). У 17 пациентов исследовали только общую клеточную фракцию, у 4 – только подвижные сперматозоиды. Контролем служили клетки неинфицированные VERO и инфицированные референс штаммом F1 вируса простого герпеса в концентрации 0,001БОЕ/клетку. При исследовании сперматозоидов выявляли метку в виде локальных темно-коричневых гранул в головках сперматозоидов. Гранулы имели различный размер и были обнаружены как в сперматозоидах с аморфной формой головок, так и в сперматозоидах нормальной морфологии.
Методом гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса была обнаружена в 21 образце (13 образцов общей клеточной фракции и 8 образцов подвижных сперматозоидов) от 15 пациентов (табл. 2).
Метка была обнаружена в 7 образцах общей клеточной фракции сперматозоидов, в которых выявляли белки всех стадий жизненного цикла вируса (α, β и γ белки) и выявлена инфекционная активность вируса, и в 1 образце с положительными результатами быстрого культурального метода и отрицательными результатами реакции иммунофлюоресценции.
В 3 образцах общей клеточной фракции положительные результаты гибридизации in situ совпадали с положительными результатами реакции иммунофлюоресценции (выявление α, β и γ белков), но инфекционной активности вируса простого герпеса не обнаружена ни в одной из фракций образца. В 3 образцах положительные результаты гибридизации in situ получены при выявлении α, β и γ белков вируса при отрицательных результатах быстрого культурального метода в исследуемой фракции (инфекционную активность вируса выявляли в цельном эякуляте или спермоплазме).
Выявление ДНК вируса простого герпеса методом гибридизации in situ
БКМ (+) в исследуемой фракции
БКМ (–) во всех фракциях
БКМ (–) в исследуемой фракции
РИФ – реакция иммунофлюоресценции,
ГИС – гибридизация in situ.
* приводятся данные по результатам реакции иммунофлюоресценции в исследуемой фракции.
* * с помощью реакции иммунофлюоресценции обнаружены один или два белка в различных сочетаниях.
Исследование фракции подвижных сперматозоидов позволило выявить метку в 4 образцах с полным набором вирусных белков. В 2 образцах инфекционная активность вируса простого герпеса выявлена в исследуемой фракции, в 2 – в цельном эякуляте и спермоплазме, но не выявлена в исследуемой фракции. При неполном наборе вирусных белков во фракции подвижных сперматозоидов положительные результаты гибридизации in situ выявлены в 3 образцах. В 2 из них выявлена инфекционная активность вируса простого герпеса, в 1 инфекционная активность вируса не обнаружена ни в одной из фракций. Вобразцов общей клеточной фракции и 4 образца фракции подвижных сперматозоидов) препаратах от 14 пациентов ДНК вируса не визуализировалась.
Результаты гибридизации in situ были отрицательными при анализе 7 образцов общей клеточной фракции и 4 образцов фракции подвижных сперматозоидов, в которых были выявлены один или два белка вируса простого герпеса. Ни в одном случае не была показана инфекционная активность вируса в исследуемой фракции сперматозоидов. Не отмечено также ни одного случая визуализации метки у 5 пациентов, результаты обследования которых с помощью реакции иммунофлюоресценции и быстрого культурального метода во всех фракциях были отрицательными.
Таким образом, при исследовании сперматозоидов методом гибридизации in situ показано наличие ДНК вируса простого герпеса в головках сперматозоидов у пациентов как с положительными, так и отрицательными результатами выявления инфекционной активности с помощью быстрого культурального метода. Выявлено наличие ДНК вируса простого герпеса в головах сперматозоидов нормальной морфологии. Выявлено наличие ДНК вируса простого герпеса во фракции подвижных сперматозоидов. Не выявлено наличие ДНК вируса простого герпеса ни в одном из образцов, в которых не обнаружено ни белков вируса, ни инфекционной активности.
4. Особенности сперматогенеза у пациентов, в эякуляте которых выявлено герпетическое инфицирование
4.1. Спермиологическое обследование пациентов с выявленным герпетическим инфицированием сперматозоидов
Исследование проводили согласно рекомендациям ВОЗ (WHO, 1992, 2000). В настоящей работе не найдено статистически значимых различий по показателям спермиологического исследования между группой пациентов с герпетическим инфицированием сперматозоидов, выявленным с помощью реакции иммунофлюоресценции и/или быстрого культурального метода, и группой пациентов, в сперматозоидах которых герпетическое инфицирование не определено.
Kotronias D., Kapranos N. (1998) продемонстрировали наличие ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах методом гибридизации in situ. В своей работе авторы подчеркивают связь между наличием ДНК вируса в сперматозоидах и выраженной олигоспермией у пациентов с проблемами фертильности. Позднее теми же авторами (Kapranos N. et al., 2003) в цельном эякуляте пациентов с проблемами фертильности методом гнездовой ПЦР проводилась детекция ДНК вирусов группы герпеса. ДНК вируса простого герпеса обнаружена в 56 образцах эякулята из %), вирус Эпштейна-Барр – в%), цитомегаловирус – в 8 (7%). Выявление вируса простого герпеса коррелировало с малым объемом эякулята и низкой подвижностью сперматозоидов, в отличие от цитомегаловируса и вируса Эпштейна-Барр. Этим же методом El Borai N. и соавт. (1997) исследовали цельный эякулят 154 инфертильных и 24 фертильных мужчин. В группе инфертильных пациентов ДНК вируса простого герпеса обнаружена в%) образцах, в контроле вирусы герпеса не обнаружены. Причиной расхождения результатов, полученных в процитированных работах, и результатов данного исследовании, является принцип отбора групп пациентов – из настоящего исследования были исключены пациенты с олигозооспермией.
4.2. Детекция X, Y и 1 хромосом методом FISH в сперматозоидах пациентов с выявленным герпетическим инфицированием
Изучен материал от 17 пациентов, в сперматозоидах которых выявлены белки вируса простого герпеса и/или инфекционная активность вируса. Исследование проводили с использованием ДНК-проб, специфичных для хромосом 1, X и Y. Выбор ДНК-зондов определялся тем, что при мейотическом делении у человека чаще всего наблюдается нерасхождение хромосом X и Y (Martin R., 2003), в тоже время имеются сообщения о том, при герпетическом инфицировании клеток повреждения затрагивают хромосому 1 (Peat D., Stanley M., 1986).
Показано, что частота полиплоидии по хромосомам 1, Х и Y у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами составляет 0,2±0,1%, анеуплоидии по хромосомам 1, Х и Y – 0,09±0,06, 0,06±0,04, 0,05±0,03% соответственно, частота анеуплоидии ХY – 0,1±0,11%. Определяли также долю общего количества численных хромосомных аномалий в каждом образце. В целом у пациентов с герпесвирусным инфицированием сперматозоидов в данной группе частоту всех изученных дисомий выявили в 0,48±0,09% ядер клеток.
По данным Chevret E. и соавт. (1994), полученным с помощью двухцветового метода FISH, частота X - и Y-несущих сперматозоидов составляет 49,3% и 49,22% соответственно (соотношение – 1:1), частота XY несущих сперматозоидов достигает 0,42. Используя метод FISH, Van Hummelen P. et al. (1996) продемонстрировали, что нерасхождение хромосом в сперматозоидах здоровых доноров эякулята достигает 1-2%. Показано, что анеуплоидии аутосом встречаются в зрелых половых клетках в пределах 0,05-0,28% (Pellestor F. et al., 1996). Результаты, полученные в данной работе, согласуются с вышеперечисленными данными. Таким образом, частота выявленных нарушений при герпетическом инфицировании сперматозоидов не выше той, которая была обнаружена у здоровых половозрелых мужчин с нормозооспермией (Chevret E. et al., 1994; Pellestor F. et al., 1996; Van Hummelen P. et al. 1996; Shi Q., Martin R., 2000; Martin R., 2003).
4.3. Исследование количественного состава незрелых половых клеток в эякуляте пациентов, в сперматозоидах которых выявлено герпетическое инфицирование
Изучение состояния сперматогенеза проводилось на суховоздушных препаратах ядер половых клеток из суспензии эякулята после окрашивания красителем по Романовскому-Гимза. Подсчитывали ядра клеток на разных стадиях их развития, определяя долю (в процентах) клеток в каждой стадии от общего числа подсчитанных незрелых половых клеток ( и соавт., 1993; 1995; 1997; , 2007).
Было проведено исследование эякулята 24 пациентов, у которых в сперматозоидах выявлены белки вируса простого герпеса. Контрольная группа состояла из 23 мужчин, проходивших обследование в качестве доноров спермы ( и соавт., 1995).
Результаты количественного анализа состава незрелых половых клеток эякулята пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами представлены на рис. 5.
Читайте также: