Методические рекомендации по лабораторному мониторингу гриппа птиц

Таблица 106 - Обозначения серотипов вируса гриппа А птиц

Таблица 105 - Номенклатура субъединиц вирусов гриппа рода А

Согласно Международной номенклатуре любой штамм вируса гриппа рода А обозначается по следующей схеме: род/источник изоляции/место изоляции/ собственный номер изолята/год изоляции/формула вида - серотипы ГА и нейраминидазы. Для штаммов, изолированных от человека, источник изоляции не пишется; для всех других штаммов год изоляции обозначается 2-мя последними цифрами. Семейство ортомиксовирусов (от греч. orthos -правильный, прямой и mуха - слизь) включает три рода: вирусы гриппа А и В, вирусы гриппа С и тоготоподобные вирусы.

Типичным представителем рода вирусов гриппа А и В является вирус гриппа A/PR/8/34(H1N1). Вирионы представляют собой частицы плеоморфной, чаще округлой формы, диаметром 80-120 нм. Они состоят из фрагментированного нуклеокапсида спиральной симметрии диаметром 9-15 нм и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются выступы длиной 10,0-13,5 нм. Мол. м. вирионов 250 МД,

Геном состоит из 8-и неодинаковых по размеру (900-2350 нуклеотидов) фрагментов 1-спиральной минус-РНК. Вирионная РНК ортомиксовирусов не обладает инфекционностью. В вирионах обнаружено 7 белков, 4 из которых (РВ1, РВ2, РА, NP) связаны с нуклеокапсидом, а 3 (НА, NA, Ml) входят в состав липопротеидной оболочки, причем 2 из них (НА и NA) являются гликопротеинами. Гликопротеины образуют 2 вида выступов наружной оболочки вирионов. Выступы 1-го вида образованы гемагглютинином (НА) с мол.м. 75-80 кД (около 500 а.к.). Каждый выступ состоит из 3-х молекул НА, которые организованы в палочкообразную структуру. Каждая молекула НА в свою очередь состоит из 2-х субъединиц (НА 1-330 а.к., НА 2-22 - а.к.), соединенных дисульфидной связью. НА ответственен за адсорбцию и проникновение вирионов в клетку и ГА-активность вируса. AT к НА нейтрализуют инфекционность вируса и подавляют его ГА-активность. Выступы 2-го типа образованы нейраминидазой (NA) с мол.м. 60-70 кД (450-470 а.к.). Все подтипы НА и NA вируса гриппа А обозначают последовательными номерами независимо от происхождения вируса. Установлено 14 АГ подтипов по НА и 9 подтипов по NA. Вирус гриппа В не подразделяют на АГ подтипы. Синтез вирусспецифических белков происходит в цитоплазме клетки.

В естественных условиях вирус гриппа А поражает человека, свиней, лошадей и птиц, а вирус гриппа В - только человека. Передаются вирусы аэрогенным путем.

Типичный представитель рода вирусов гриппа С - вирус гриппа C/Taylor/1233/47. Вирус гриппа С обнаружен у человека и свиней.

В состав рода тоготоподобные вирусы входят вирусы Тогото (прототипный вирус) и Дори, переносимые клещами и иногда поражающие человека. Морфологически они сходны с другими ортомиксовирусами и содержат 6-7 фрагментов 1-спиральной минус-РНК.

Грипп кур (классическая чума птиц, грипп птиц А1, подтип 7, экссудативный тиф) - острая контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся общим угнетением, отеками, поражением органов дыхания и пищеварения.

В настоящее время грипп птиц в форме КЧП регистрируется редко. Чаще инфекция проявляется эпизоотическими вспышками, вызываемыми штаммами других АГ подтипов с более низкой, чем вирус КЧП, патогенностью. Такие вспышки зарегистрированы в США, Италии, Англии, ФРГ, СССР и других странах. Вирусы гриппа птиц (ВГП) выделены от кур, индюков, уток, перепёлок, фазанов, глухарей, длиннохвостых попугаев, цесарок и др.

Антигенная вариабельность и родство. В настоящее время вирусы гриппа А птиц на основании их поверхностных АГ - ГА (Н) и нейраминидазы (N) - разделены на 13 по Н-АГ и 9 вариантов по N-АГ (табл. 106). Штаммоспецифические АГ-связи определяются с помощью: РТГА - для определения сходства по ГА; РТНА - для определения сходства или различия по НА; теста двойной диффузии - для определения сходства ГА и НА. У штаммов вируса гриппа А птиц, имеющих АГ характеристику H1N1, выявлено не менее 4 АГ детерминант нейраминидазы. Четкие различия выявлены также у НА штаммов вируса гриппа А птиц с АГ формулой H3N8, следовательно, НА штаммов вируса гриппа А птиц с АГ характеристиками H1N1 и H3N8 имеет на своей поверхности не менее 4-х АГ различных детерминант: 1 общую для вирусов, имеющих одинаковый сероподтип, 2 - перекрестно реагирующих и 1 - штаммоспецифическую.

Серовариант	Наименование штамма	Формула
1.	А/утка/ Ал ьберта/3 5/7 6/	H1N1
2.	А/утка/Германия/ 1215/73	H2N3
3.	А/утка/Украина 1/63	H3N8
4.	А/угка/ЧССР/56	H4N6
5.	А/крачка/Ю . Африка/6 1	H5N3
6.	А/индюк/Массачусетс/3 740/65	H6N2
7.	А/вирус чумы птиц/Росток/34	H7N1
8.	А/утка/Онтарио/б 1 1 8/68	H8N4
9.	А/индюк/Висконсин( 1 /66)	H9N2
10.	А/цыпл енок/Германия/4 9	H10N7
11.	А/Утка/ Англ ия/5 6	H1IN6
12.	А/утка/ Альберта/60/ 1 6	H12N5
13.	А/черноголовый хохотун/ Астрахань/ 142/7	H13N2

Кроме 13 подтипов ГА, все штаммы ВГП содержат в своей структуре НА или птичьего, или человечьего, или лошадиного происхождения. Собственно птичьей НА известно 6 типов, Подтиповая классификация ВГП продолжается и по сегодняшний день, т.к. новые факты выделения их от птиц различных видов регистрируются ежегодно в различных регионах земного шара. В 1971 г. была опубликована номенклатура вирусов гриппа А, рекомендованная группой экспертов ВОЗ. Согласно этой рекомендации каждый штамм обозначается по месту и времени выделения, а в скобках указывается его АГ формула. Эта номенклатура себя оправдала, однако накопившиеся за последние годы данные требуют ее пересмотра В 1980 г. ВОЗ предложила новую номенклатуру ВГП. Предложено обозначать серотипы ГА и НА последовательными номерами, независимо от происхождения вирусов. Таблица эталонных штаммов ВГП свидетельствует о том, что изменения нуклеотидной последовательности и, как следствие, замена аминокислотных остатков сопряжено с изменением патогенности вируса гриппа в отношении птиц и КЭ. Так, например, изолят А/индюк/Висконсин/68

(H5N9) ВГП состоит из 2-х популяций вируса, имеющих разные гены NS и вызывающих разные биологические реакции. Анализ АГ свойств методами ИФА и РТГА свидетельствует о родстве внутренних белков "человеческих" и "птичьих" вирусов гриппа и различиях в структуре поверхностного гликопротеина - ГА.

Спектр патогенности в естественных условиях. Он неоднороден и зависит от АГ подтипа. Известны 2 подтипа ВГП; А5 и А7, вызывающих заболевание типа КЧП. Грипп А7 КЧП чаще поражает птиц семейства куриных, менее восприимчивы водоплавающие птицы.

Дикие утки и др. виды водоплавающей птицы также чувствительны даже к самым слабопатогенным штаммам ВГП и являются не только переносчиками инфекции, но и резервуаром. Сезонные миграции диких птиц вызывают сезонные заболевания болотных птиц.

Из 14 подтипов вируса гриппа А только 3 обнаруживаются у человека (Н1, Н2 и НЗ). Прошло уже 25 лет с тех пор как из человеческой популяции исчез подтип Н2 вируса гриппа. Однако ген ГА Н2 циркулирует среди птичьих штаммов вируса гриппа.

Поставить диагноз на грипп птиц можно путём выделения вируса и идентификации его в РСК, РН и РТГА, а также выявления специфических AT в процессе эпизоотии или по прошествии её (ретроспективная диагностика). В нашей стране биопромышленность выпускает 2 диагностических набора:

а) набор специфических АГ и сывороток к ним для диагностики гриппа птиц 13-и серотипов;

б) диагностический набор для идентификации вируса НБ и Ш (актуального эпизоотического типа).

Выделение вируса.Взятие и подготовка материала. В качестве вируссодержащего материала используют селезёнку, головной мозг, синусы, трахею, лёгкие, воздухоносные мешки, кишечник от больной птицы или свежих трупов. Материал в лабораторию доставляют в замороженном виде в термосе со льдом. Инфекционные титры вируса в назальных смывах бывают максимальными через 2-4 дня после заражения птицы и достигают 10 5 -10 7 ЭИДзо/мл смыва. Изолировать вирусы из клоачных смывов удаётся чаще всего на 5-8-й день после экспериментального заражения птицы.

Заражение куриных эмбрионов. Испытуемую суспензию инокулируют 9-10-дн КЭ (не менее 5 на одну пробу) в аллантоисную или амниотическую (лучше) полости общепринятым методом и инкубируют в течение 72 ч. Экстраэмбриональную жидкость каждого эмбриона раздельно проверяют на ГА-активность капельной РГА с 1 %-ной взвесью эритроцитов кур. При отсутствии положительной РГА проводят еще 3-5 слепых пассажей, используя для заражения КЭ эмбриональную жидкость предыдущего пассажа. Если титры ГА низкие, проводят таким же образом еще 2-3 дополнительных пассажа. Проба испытуемого материала считается отрицательной, если в 3-5 слепых пассажах не будет обнаружено ГА и патогенного действия вируса (гибели КЭ). При положительной РГА проводят идентификацию выделенного вируса.

Заражение культуры клеток. Вирус после 2-5 пассажей хорошо развивается в культуре фибробластов КЭ. ЦПД обычно проявляется через 24-48 ч (в зависимости от дозы и адаптации). Присутствие его устанавливают при помощи РГА и РГАд. Предложен ускоренный метод титрования инфекционности вируса гриппа в культуре клеток путем подсчета гемадсорбирующих клеток. Метод позволяет получить результат через 8 ч после заражения.

Биопроба на цыплятах. Испытуемую суспензию инокулируют цыплятам 2-3-месячного возраста. Летальную инфекцию у цыплят можно вызвать при любом методе заражения (подкожно, внутримышечно, в мозг, конъюнктиву) подтипами А1, А7 и А5. Заражение per os с кормом и водой удается непостоянно, лишь в случае высокой патогенности эпизоотического изолята гриппа. Зараженные цыплята, как правило, гибнут через 36-72 ч в зависимости от дозы и вирулентности возбудителя.

Индикация и идентификация вируса. Для этой цели широко используют методы ИФ, цитоскопию, биопробу (на птице и КЭ) и серологическую идентификацию. С помощью монАТ можно идентифицировать не только разные группы вирусов (ВГП и ПМВ), но и определять подтипы ВГП и серотипы ПМВ птиц, и даже штаммы внутри одного подтипа, а также локализацию компонентов вириона в зараженных клетках (МРВГП - МА клонов 1С6, 5С10, N:2 - МА клоны 303 и т.д.). На основе монАТ можно готовить диагностические препараты для выявления АГ и AT в РТГА, НИФ, РСК, ИФА и др. реакциях.

РГА. Для индикации вируса в патологическом материале можно использовать РГА. Надосадочную жидкость после центрифугирования суспензии проб из органов и тканей больной птицы, а также смывов исследуют в капельной или пробирочной РГА с 1%-ной суспензией эритроцитов кур или 0,5%-ной взвесью эритроцитов морской свинки. Реакцию учитывают через 20 мин и 1 ч. Специфичность определяют в РТГА.

Цитоскопия. Метод заключается в исследовании тканевых элементов в отпечатках, полученных со слизистой оболочки верхних дыхательных путей (лучше) и органов. Препараты высушивают и окрашивают одним из методов: по Романовскому, Пигаревскому, Быковскому и т. п. При окраске по Быковскому и Пигаревскому в цитоплазме клеток при гриппе обычно обнаруживают тельца-включения ярко-красного цвета; при окраске по Романовскому - фиолетового цвета. Внутриклеточные включения находят не только в клетках цилиндрического эпителия, но и в цитоплазме макрофагов, лейкоцитов и плоского эпителия. В настоящее время этот принцип исследования используется с применением люминесцентной микроскопии.

Метод простого флюорохромирования. На мазки-отпечатки из органов и смывов наносят 1-2 капли рабочего раствора акридина оранжевого (1:10000), покрывают покровным стеклом и свежий препарат (в течение 10 мин после приготовления) рассматривают в люминесцентном микроскопе. Ядра клеток выявляются по изумрудно-зеленому свечению, РНК плазмы клеток - в виде не резко ограниченных гранул красного или оранжевого цвета. В препарате, имеющем вирус гриппа, выявляются включения в виде четко отграниченных ярко-красных гранул в цитоплазме клеток.

1. Область применения

1.1. Настоящие Правила устанавливают обязательные требования к организации лабораторной диагностики гриппа А птиц (далее — грипп птиц).

1.2. Положения настоящих правил обязательны для выполнения на территории Российской Федерации органами государственной власти, предприятиями или иными хозяйствующими субъектами, учреждениями, организациями, общественными объединениями, независимо от их подчинения и форм собственности, должностными лицами и гражданами.

2. Общие положения

2.1. Диагностические лабораторные исследования и серологические тесты по определению напряженности поствакцинального иммунитета (далее — лабораторные тесты) проводят в специализированных ветеринарных учреждениях.

2.2. Лабораторная диагностика гриппа птиц направлена на выявление в исследуемых объектах ветеринарного надзора:

вируса гриппа птиц;

РНК вируса гриппа птиц;

антигенов вируса гриппа птиц;

антител к вирусу гриппа птиц.

2.3. При проведении лабораторных тестов могут быть использованы методы лабораторных исследований, применяющие:

тесты, утвержденные в установленном порядке;

тесты, которые реализуются с использованием тест-систем, зарегистрированных в установленном порядке в Российской Федерации.

3. Обязательные требования по отбору проб для проведения диагностики гриппа птиц

3.1. Отбор проб крови и патологического материала проводит ветеринарный работник, имеющий специальную подготовку.

3.2. Пробы маркируются и опечатываются. К пробам прилагается сопроводительный документ, содержащий сведения о дате и месте отбора проб, юридическом или физическом лице — владельце птицы и месте его нахождения, виде, возрасте птицы и ее состоянии на момент отбора проб.

3.3. Для проведения исследований осуществляют отбор проб патологического материала (органы, ткани головного мозга, легких, трахеи, селезенки, участков кишечника, почек, сердца) от павшей или убитой с диагностической целью птицы.

3.4. От каждого стада птицы отбирают для исследовании 5-10 трупов или патологический материал от 5-10 трупов, клоакальные и/или трахеальные смывы от 10-15 голов, 1-10 сборных проб помета от стада.

У мелких видов птиц для отбора проб используют свежий помет.

Пробу помета рекомендуется отбирать из расчета 1 грамм помета на 60 точек птичника (выгула или вольеры), выбранных по диагонали крест-накрест.

3.5. Пробы крови для определения антител к вирусу гриппа птиц рекомендуется отбирать у 25-30 птиц из стада (партии), из одного птичника (зала) или одного населенного пункта, местности (водоема).

Пробы крови отбирают из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре, или в термостате при 37°С в течение 1-2 часов, затем обводят иглой или пастеровской пипеткой, отслаивая сгусток крови от стенок пробирки, и оставляют на 16-18 часов при температуре 2-4°С. Образовавшуюся прозрачную без признаков гемолиза сыворотку отбирают с помощью пипетки в отдельные, чистые пробирки.

Отбор крови допускается проводить с помощью иглы и шприца (или вакуумной пробирки).

Рекомендуется проводить центрифугирование проб крови для получения сыворотки в течение 10-15 минут при 1000 об/мин для осаждения свободных эритроцитов.

Для серодиагностики используют парные пробы сывороток крови, полученные от больных или инфицированных птиц, в начале заболевания и через 4-10 дней.

3.6. Пробы транспортируются во влагонепроницаемой таре, в контейнере с хладоэлементами или в термосе со льдом. Допускается однократное замораживание сывороток.

При транспортировке проб соблюдают установленные ветеринарно-санитарные правила и меры безопасности, предъявляемые к транспортировке биологических материалов, содержащих инфекционные агенты 3 группы патогенности.

3.7. Если немедленное исследование проб невозможно, допускается сохранять образцы на протяжении 4 дней при температуре 4°С.

При необходимости для увеличения срока хранения диагностические образцы и/или изолят помещают в морозильную камеру с температурой -80°С.

4. Методы и сроки проведения лабораторных исследований

4.1. Для установления диагноза на грипп птиц допускается применение следующих методов:

а) для выявления вируса гриппа птиц — биопроба на СПФ (свободных от патогенной микрофлоры) — цыплятах с обязательным последующим подтверждением специфичности биологической реакции;

б) для выделения вируса гриппа птиц — метод выделения вируса на СПФ — куриных эмбрионах или в культуре клеток;

в) для обнаружения антигенов вируса гриппа птиц;

иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения одного или нескольких белков вируса;

иммунопреципитация (двойная иммунодиффузия по Оухтерлони (далее — РДП) или иммуноэлектроосмофорез (далее — ИЭОФ);

иммунохроматографические методы (далее — ИХА);

радиоиммунный анализ (далее — РИА);

непрямая гем- и латексагглютинация;

реакция связывания комплемента (далее — РСК);

г) для обнаружения гемагглютинина (гемагглютинирующей активности) вируса гриппа птиц:

реакция гемагглютинации (далее РГА) с подтверждением специфичности в реакции торможения гемагглютинации (РТГА);

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину;

д) для обнаружения РНК вируса:

полимеразная цепная реакция (далее — ПЦР);

ПЦР с последующим секвенированием ее продуктов;

Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;

е) для обнаружения антител к вирусу гриппа птиц:

ж) для субтипирования вируса по гемагглютинину и нейраминидазе:

сиквенс к ДНК или ПЦР-продукта;

Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину;

з) для субтипирования противовирусных антител по гемагглютинину:

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину.

4.2. Применение иных тестов допускается для получения предварительных результатов.

4.3. Методы проведения лабораторных исследований реализуются на основе утверждаемых в установленном порядке методик проведения обязательных диагностических исследований.

4.4. Сроки проведения лабораторных исследований устанавливаются в зависимости от метода исследования и не могут превышать 1 месяца.

В данном разделе размещаются актуальные версии нормативно-правовых
актов (законы, приказы, указы, решения Верховного суда РФ и др.),
представляющие интерес для специалистов в области ветеринарии и
фитосанитарии.

Приказ. Об утверждении ветеринарных правил лабороторной диагностики гриппа А птиц
Приложение. Ветеринарные правила лабороторной диагностики гриппа А птиц
1. Статья 1. Область применения
2. Статья 2. Общие положения
3. Статья 3. Обязательные требования по отбору проб для проведения диагностики гриппа птиц
4. Статья 4. Методы и сроки проведения лабораторных исследований

В целях повышения эффективности борьбы с гриппом птиц и в соответствии с пунктом 5.2.11 Положения о Министерстве сельского хозяйства Российской Федерации, утвержденного Постановлением Правительства Российской Федерации от 24 марта 2006 г. N 164 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2006, N 14, ст. 1543), приказываю:

утвердить Ветеринарные правила лабораторной диагностики гриппа A птиц согласно приложению.

1.1. Настоящие Правила устанавливают обязательные требования к организации лабораторной диагностики гриппа A птиц (далее — грипп птиц).

вируса гриппа птиц;

РНК вируса гриппа птиц;

антигенов вируса гриппа птиц;

антител к вирусу гриппа птиц.

тесты, утвержденные в установленном порядке;

3.4. От каждого стада птицы отбирают для исследований 5 — 10 трупов или патологический материал от 5 — 10 трупов, клоакальные и/или трахеальные смывы от 10 — 15 голов, 1 — 10 сборных проб помета от стада.

У мелких видов птиц для отбора проб используют свежий помет.

3.5. Пробы крови для определения антител к вирусу гриппа птиц рекомендуется отбирать у 25 — 30 птиц из стада (партии), из одного птичника (зала) или одного населенного пункта, местности (водоема).

Пробы крови отбирают из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре или в термостате при 37 град. C в течение 1 — 2 часов, затем обводят иглой или пастеровской пипеткой, отслаивая сгусток крови от стенок пробирки, и оставляют на 16 — 18 часов при температуре 2 — 4 град. C. Образовавшуюся прозрачную без признаков гемолиза сыворотку отбирают с помощью пипетки в отдельные, чистые пробирки.

Отбор крови допускается проводить с помощью иглы и шприца (или вакуумной пробирки).

Рекомендуется проводить центрифугирование проб крови для получения сыворотки в течение 10 — 15 минут при 1000 об./мин. для осаждения свободных эритроцитов.

Для серодиагностики используют парные пробы сывороток крови, полученные от больных или инфицированных птиц, в начале заболевания и через 4 — 10 дней.

3.7. Если немедленное исследование проб невозможно, допускается сохранять образцы на протяжении 4 дней при температуре 4 град. C.

При необходимости для увеличения срока хранения диагностические образцы и/или изолят помещают в морозильную камеру с температурой -80 град. C.

4.1. Для установления диагноза на грипп птиц допускается применение следующих методов:

иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения одного или нескольких белков вируса;
иммунопреципитация (двойная иммунодиффузия по Оухтерлони (далее — РДП) или иммуноэлектроосмофорез (далее — ИЭОФ);
иммунохроматографические методы (далее — ИХА);
радиоиммунный анализ (далее — РИА);
непрямая гем- и латексагглютинация;
реакция связывания комплемента (далее — РСК);

г) для обнаружения гемагглютинина (гемагглютинирующей активности) вируса гриппа птиц:

реакция гемагглютинации (далее — РГА) с подтверждением специфичности в реакции торможения гемагглютинации (РТГА);
ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину;

д) для обнаружения РНК вируса:

полимеразная цепная реакция (далее — ПЦР);
ПЦР с последующим секвенированием ее продуктов;
Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;

е) для обнаружения антител к вирусу гриппа птиц:

ж) для субтипирования вируса по гемагглютинину и нейраминидазе:

РТГА;
сиквенс к ДНК или ПЦР-продукта;
ПЦР;
Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;
ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных
антител к вирусному гемагглютинину;

з) для субтипирования противовирусных антител по гемагглютинину:

РТГА;
ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину.

4.2. Применение иных тестов допускается для получения предварительных результатов.

Аннотация
Об авторах
Список литературы

Д. В. Гадзевич

Ведущий ветеринарный врач

С. И. Данильченко

Руководитель ЛДЦ, кандидат ветеринарных наук

С. Г. Ерофеев

Руководитель сектора, кандидат ветеринарных наук

М. А. Пасунькина

Заведующий лабораторией, кандидат ветеринарных наук

А. Б. Гринченко

Старший научный сотрудник

В. Н. Ирза

Главный эксперт, доктор ветеринарных наук

М. С. Волков

Заведующий лабораторией, кандидат ветеринарных наук

А. В. Варкентин

Заведующий сектором, кандидат ветеринарных наук

2. Белов А. Б. Гипотезы сохранения вирусов гриппа в биосфере и современная эпидемиологическая ситуация в мире // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний: материалы науч.-практ. конф. – Н. Новгород, 2004. – С. 51–57.

3. Дудников С. А., Гуленкин В. М. Концепция природной очаговости и грипп птиц // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. – 2006. – Т. 4. – С. 248–280.

4. Клинические признаки и патологоанатомические изменения при гриппе птиц (Н5N1) в Сибирском регионе в 2005 году / А. В. Фролов, А. В. Борисов, В. В. Борисов [и др.] // Вет. медицина України. – 2006. – № 4. – С. 14–16.

5. Львов Д. К., Ильичев В. Д. Миграции птиц и перенос возбудителей инфекции (эколого-географические связи птиц с возбудителями инфекции). – М.: Наука, 1979. – 270 с.

6. Обзор ситуации по высокопатогенному вирусу гриппа птиц субтипа H5 в России в 2016–2017 гг. / В. Ю. Марченко, И. М. Суслопаров, В. Э. Игнатьев [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. – 2018. – Вып. 1. – С. 30–35; DOI: 10.21055/0370-1069-2018-1-30-35.

7. Русев И. Т. Роль мигрирующих птиц в заносе и распространении высокопатогенного птичьего гриппа в Украине // Вісник СумДУ. – 2006. – №8 (92). – С. 29–41.

8. Эпизоотологический мониторинг инфекционных болезней птиц в Республике Крым / Н. Г. Воротилова, С. И. Данильченко, И. Б. Ионкина, Д. В. Гадзевич // Известия сельскохозяйственной науки Тавриды. – 2015. – № 3 (166). – С. 81–92.

9. Вержиховський О. Епізоотична ситуація з високопатогенного грипу птиці в Україні – стан виконання оздоровчих заходів та недопущення поширення збудника // Вет. медицина України. – 2006. – № 3. – С. 14–17.

11. Novel reassortant clade 2.3.4.4 avian inﬂuenza A (H5N8) virus in wild aquatic birds, Russia, 2016 / D. H. Lee, K. Sharshov, D. E. Swayne [et al.] // Emerg. Infect. Dis. – 2017. – Vol. 23 (2). – P. 359–360; DOI: 10.3201/eid2302.161252.

Бесплатная горячая линия юридической помощи

Главная
ПРИКАЗ Минсельхоза РФ от 03.04.2006 N 105 "ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРАВИЛ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА A ПТИЦ"

ВЕТЕРИНАРНЫЕ ПРАВИЛА ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА A ПТИЦ

1.1. Настоящие Правила устанавливают обязательные требования к организации лабораторной диагностики гриппа A птиц (далее - грипп птиц).

2.1. Диагностические лабораторные исследования и серологические тесты по определению напряженности поствакцинального иммунитета (далее - лабораторные тесты) проводят в специализированных ветеринарных учреждениях.

вируса гриппа птиц;

РНК вируса гриппа птиц;

антигенов вируса гриппа птиц;

антител к вирусу гриппа птиц.

тесты, утвержденные в установленном порядке;

3.2. Пробы маркируются и опечатываются. К пробам прилагается сопроводительный документ, содержащий сведения о дате и месте отбора проб, юридическом или физическом лице - владельце птицы и месте его нахождения, виде, возрасте птицы и ее состоянии на момент отбора проб.

3.4. От каждого стада птицы отбирают для исследований 5 - 10 трупов или патологический материал от 5 - 10 трупов, клоакальные и/или трахеальные смывы от 10 - 15 голов, 1 - 10 сборных проб помета от стада.

У мелких видов птиц для отбора проб используют свежий помет.

3.5. Пробы крови для определения антител к вирусу гриппа птиц рекомендуется отбирать у 25 - 30 птиц из стада (партии), из одного птичника (зала) или одного населенного пункта, местности (водоема).

Пробы крови отбирают из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре или в термостате при 37 град. C в течение 1 - 2 часов, затем обводят иглой или пастеровской пипеткой, отслаивая сгусток крови от стенок пробирки, и оставляют на 16 - 18 часов при температуре 2 - 4 град. C. Образовавшуюся прозрачную без признаков гемолиза сыворотку отбирают с помощью пипетки в отдельные, чистые пробирки.

Отбор крови допускается проводить с помощью иглы и шприца (или вакуумной пробирки).

Рекомендуется проводить центрифугирование проб крови для получения сыворотки в течение 10 - 15 минут при 1000 об./мин. для осаждения свободных эритроцитов.

4.1. Для установления диагноза на грипп птиц допускается применение следующих методов:

а) для выявления вируса гриппа птиц - биопроба на СПФ (свободных от патогенной микрофлоры) - цыплятах с обязательным последующим подтверждением специфичности биологической реакции;

б) для выделения вируса гриппа птиц - метод выделения вируса на СПФ - куриных эмбрионах или в культуре клеток;

в) для обнаружения антигенов вируса гриппа птиц;

иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения одного или нескольких белков вируса;

иммунопреципитация (двойная иммунодиффузия по Оухтерлони (далее - РДП) или иммуноэлектроосмофорез (далее - ИЭОФ);

иммунохроматографические методы (далее - ИХА);

радиоиммунный анализ (далее - РИА);

непрямая гем- и латексагглютинация;

реакция связывания комплемента (далее - РСК);

г) для обнаружения гемагглютинина (гемагглютинирующей активности) вируса гриппа птиц:

реакция гемагглютинации (далее - РГА) с подтверждением специфичности в реакции торможения гемагглютинации (РТГА);

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину;

д) для обнаружения РНК вируса:

полимеразная цепная реакция (далее - ПЦР);

ПЦР с последующим секвенированием ее продуктов;

Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;

е) для обнаружения антител к вирусу гриппа птиц:

ж) для субтипирования вируса по гемагглютинину и нейраминидазе:

сиквенс к ДНК или ПЦР-продукта;

Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину;

з) для субтипирования противовирусных антител по гемагглютинину:

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину.

4.2. Применение иных тестов допускается для получения предварительных результатов.

Читайте также: