Методы очистки и концентрации вирусов

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ , комплекс методов исследования, позволяющих распознать этиологию вирусного заболевания и изучить его возбудителя.

Осн. этапами В. и. являются выделение вируса от больных и павших животных (взятие, консервирование, пересылка и подготовка материала, заражение им животных, куриных эмбрионов, культуры клеток); титрование вирусов для определения их кол-ва в исследуемых материалах; культивирование вирусов на восприимчивых домашних и лабораторных животных, особенно на развивающихся куриных эмбрионах и культурах тканей (гл. обр. первичнотрипсинизированных).

С помощью морфологич. методов выявляют элементарные тельца, внутриклеточные включения (напр., Бабеша — Негри при бешенстве, Боллингера при оспе птиц). Иммунохимич. методы (гл. обр. метод флуоресцирующих антител) позволяют определить специфич. вирусный антиген в заражённых [зараженных] клетках тканевой культуры или органов и тканей инфицир. животных. С помощью серологич. методов проводят видовую и группоспецифич. идентификацию вируса и антител в сыворотках переболевших животных. С этой целью используют реакции нейтрализации, РСК, реакцию гемагглютинации, задержки гемагглютинации, диффузионной преципитации, торможения гемадсорбции. Реакция нейтрализации позволяет улавливать антигенные различия сходных между собой вирусов даже в пределах одноимённой [одноименной] группы. РСК применяют для обнаружения вирусных антигенов в материалах от больных и павших животных, идентификации выделенного вируса, изучения антигенных связей между различными вирусами и определения антител у переболевших животных. Реакции гемагглютинации и задержки гемагглютинации широко применяют в В. и. для диагностич. целей и типирования возбудителей болезни Ньюкасла, гриппа птиц, парагриппа и нек-рых аденовирусов; непрямую реакцию гемагглютинации используют для выявления адено- и миксовирусов, хламидий. Реакцией прицепитации в агаре изучают антигенную структуру вирусов, выявляют антитела в сыворотке и антигены в исследуемом материале. Реакцию гемадсорбции применяют для предварительной индикации и титрования вирусов в культуре клеток, особенно тех, к-рые не вызывают цитопатич. действия. Гемадсорбция наступает раньше проявления цитопатогенного действия, поэтому её [ее] используют как ранний метод предварительной индикации вирусов. Гемадсорбция островковая (адсорбция эритроцитов на отдельных участках монослоя клеток) типична для гриппа свиней, эпидемич. паротита; диффузная (адсорбция эритроцитов на клетках всего монослоя)— для классич. чумы кур, болезни Ньюкасла, афр. чумы свиней и др. Методы очистки и концентрации вирусов используют при изучении физич., химич. и морфологич. свойств вирусов. Фазовые системы, образованные полимерами, используют для концентрации вирусов из больших объёмов [объемов] вируссодержащих жидкостей, выделения нуклеиновых к-т вирусов. Радиобиологич. методы применяют в В. и. для изучения распределения и локализации вирусов (антител) в организме и особенно для изучения процессов онтогенеза вирусов. С помощью электронной микроскопии обнаруживают вирионы в исследуемом материале и специфич. конгломераты вирусов и антител (иммунная электронная микроскопия). Иммуноэлектроосмофорез обусловлен одновременным встречным движением в геле агара антигена и антитела в результате разной величины электрич. заряда с образованием комплекса антиген — антитело в виде линии преципитации и последующей его денатурацией. Метод применяют при изучении антигенной структуры вируса. Изоэлектрич. фокусирование основано на способности белков переходить в инертное (в отношении электрофоретич. подвижности), а затем агрегированное состояние в изоэлектрич. точке. Метод применяют для изучения белков вирусов. При иммуноферментативном методе происходит присоединение фермента к антителам с последующим образованием комплекса фермент — антитело — антиген, к-рый выявляют в клетке с помощью цитохимич. реакции на фермент (пероксидазу, щелочную и кислую фосфотазу, глюкозооксидазу). Метод используют с диагностич. целью для выявления вирусных антигенов в культурах клеток, мазках-отпечатках, криостатных срезах, а также для изучения тонкой структуры антигенов вируса, патогенеза вирусных болезней и др. См. также Вирусоскопия .

Лит.: Тихоненко Т. И., Методические основы биохимии вирусов, М., 1973, с. 152—58; Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, пер. с англ., ред. Э. Леннет и Н. Шмидт, М., 1974.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:научить студентовотбору, консервированию и

транспортировке патологического материала, технике приготовления 10%рабочей суспензии из патологического материала, методам очистки и концентрации вирусов в исследуемом материале.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ:

- Стерильные ступки и пестики - 5 шт.;

- свежий исследуемый патологический материал (10-15 г.);

- ножницы, скальпели, пинцеты в стаканах - - 5 шт.;

- чистые пробирки с резиновыми пробками-10 шт.;

- стерильный речной песок или порошок стекла - 5 шт.;

- воронки и бумажные фильтры -10 шт.;

- сосуд с дезраствором;

- антибиотики (пенициллин, стрептомицин, нистатин);

- пастеровские пипетки -10 шт.;

- мерные пипетки на 10 мл и 1 мл - 10 шт.;

- питательные среды-МПА, МПБ, сусло-агар - 2 шт.;

- фильтры ВГНКИ, Зейтца, Шамберлана;

- спиртовки - 5 шт.;

- физиологический раствор - 5 шт.

В лабораторной диагностике вирусных болезней точность диагноза прежде всего зависит от правильности взятия патологического материала, его транспортировки, качества приготовления и техники исследования вируссодержащего материала, которые имеют свои особенности.

Материал для исследований от заболевших, павших или вынужденно убитых животных следует брать как можно быстрее после появления четких признаков болезни или не позднее 2-3 ч после клинической смерти или убоя. Это связано с тем, что сразу после заболевания или впервые 1-2 дня значительно ослабевает барьерная роль кишечника, что наряду с повышенной проницаемостью кровеносных сосудов способствует диссеминации кишечной флоры. Кроме того, по мере продолжения и даже углубления инфекционного процесса количество вируса может уменьшаться в результате воздействия защитных механизмов организма.

При взятии материала для выделения вируса следует исходить из патогенеза изучаемой инфекции (входные ворота, пути распространения вируса в организме, места его размножения и пути выделения). Так, при респираторных инфекциях для выделения вирусов берут носоглоточные смывы, мазки из носа и глотки, соскобы трахеи и кусочки легкого трупов; при энтеровирусных - кал; при нейротропных - кусочки головного или спинного мозга; при дермотропных инфекциях - свежие поражения кожи, то есть отбирают тот материал, в котором предполагается наибольшая концентрация вируса. Материалом для выделения вируса могут служить различные экскреты и секреты, кусочки органов, кровь, лимфа и др.

Смывы с конъюнктивы, со слизистой оболочки носа, с задней стенки глотки, прямой кишки и клоаки у птиц берут стерильными ватными тампонами и погружают их в пенициллиновые флаконы или пробирки, содержащие 3-5 мл соответствующей жидкости. Наиболее часто для этого используют раствор Хенкса или среды для культур клеток (ИГЛА, 199) с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 500 ЕД. и нистатин по 20 ЕД. на 1 мл среды) и белковым стабилизатором, например 0,5%-ным раствором желатина или 0,5-1%-ым раствором альбумина бычьей сыворотки. Присутствие стабилизаторов необходимо для предотвращения быстрой инактивации некоторых вирусов (например, парагриппа).

При взятии материала из носоглотки можно пользоваться прибором, сконструированным Томасом и Стоком. Он состоит из трубки диаметром 9мм и длиной 30см, внутри которой помещаетсявтораятонкая трубка с нержавеющим стержнем, оканчивающимся нейлоновой щеткой (диаметр 9мм). Прибор вводят глубоко в носовые КОДЫ (хоаны) или в горло через носовой ход, выдвигая щеточку, затем вновь задвигая ее в трубку, перед тем как вынуть прибор из органа. Щеточку тщательно отмывают от слизи и клеток в 2 мл жидкости.

Слюну имеет смысл брать при наличии признаков поражения ротной полости или слюнных желез. Вытекающую изо рта слюну можно собрать прямо в пробирку. Если ее выделяется мало или она не вытекает, необходимо пропитать слюной стерильный тампон из ваты на палочке, а затем поместить в пробирку с небольшим количеством физиологического раствора и закрыть резиновой пробкой. Для усиления слюноотделения животному можно ввести пилокарпин из расчета 0,02-0,05г на 1кг массы.

Мочу собирают при помощи катетера в стерильную посуду.

Фекалии берут из прямой кишки шпателем или палочкой и помещают в стерильную пробирку или пенициллиновый флакон.

Везикулярную жидкость можно собрать шприцем или пастеровской пипеткой в стерильную пробирку. Стенки афт, корочки с поверхности кожи снимают пинцетом.

Спинномозговую жидкость используют редко. Ее берут асептично путем обычной пункции.

После смерти животного важно как можно быстрее взять кусочки органов, так как при многих вирусных инфекциях наблюдается феномен посмертной аутостерилизации, в результате чего вирус может быть вообще не обнаружен или его количество окажется столь незначительным, что обычными рутинными методами исследования выделить его не удается. Вторая причина необходимости экстренного взятия материала заключается в том, что в трупе быстро развивается бактериальное обсеменение, взять пробу стерильно становится невозможно.

В экспериментальных условиях инфекционный материал берут главным образом у животных, убитых в агональный период болезни.

Применение антибиотиков эффективно лишь при условии незначительного бактериального загрязнения проб. Однако при различных посмертных изменениях тканей, если даже при помощи антибиотиков удается затормозить рост бактерий, нельзя нейтрализовать продукты их метаболизма и токсические субстанции поврежденной ткани. Такой материал непригоден для проведения исследований ни на животных, ни тем более на куриных эмбрионах и культурах клеток. По тем же причинам пробы должны быть взяты по возможности в стерильных условиях. Особенно тщательно следует избегать загрязнения проб содержимым пищеварительного тракта, так как в нем могут находиться непатогенные вирусы, которые вызывают деструкцию клеточных культур, осложняя тем самым диагностические исследования.

В качестве патматериала берут кусочки органов размером в несколько кубических сантиметров и массой 10-20г, которые имеют видимые отклонения от нормы (по форме, размеру, цвету, консистенции, наличию необычных образований); могут быть поражены и содержать вирус на основании клинической картины болезни перед смертью.

Наиболее часто содержат вирус печень, селезенка, легкие, головной мозг, лимфатические узлы, почки.

Транспортировка и хранение проб.

Пробы рекомендуется как можно быстрее поместить в условия, обеспечивающие замедление процессов инактивации вируса. Такие условия обеспечивают низкие температуры. Для этого пробирки (флакончики) с патматериалом, закрытые резиновыми пробками, надо поместить в термос с охлаждающей смесью . В качестве охлаждающей смеси можно взять смесь равных частей сухого льда (твердой углекислоты) и этилового спирта (температура минус 71°С держится несколько дней). Можно использовать смесь, состоящую из трех массовых частей льда или снега и одной массовой части поваренной соли. В последнем случае удается получить температуру минус 15°С - минус 20°С. Вместо замораживания можно использовать для консервирования химические средства (менее эффективно). Лучшим из последних считается смесь равных объемов стерильных глицерина и 0,85%-ного раствора поваренной соли (изотонический раствор), в которую и помещается патматериал. Обычно эту смесь используют для консервирования кусочков паренхиматозных органов и тканей. Растворы глицерина менее пригодны для вируссодержащих жидкостей, особенно в тех случаях, когда этот материал нужно вводить животным, эмбрионам и в культуру клеток в неразведенном виде. Употребление глицерина делает невозможным исследование патологического материала методом иммунофлюоресценции. Поэтому одновременно с пробой патматериала необходимо направлять мазки-отпечатки, приготовленные и фиксированные на предметном стекле, для исследования в люминесцентном микроскопе.

Для гистологических исследований кусочки органов чаще консервируют в 10%-ном растворе формалина.

Патматериал должен быть снабжен надежной и четкой этикеткой, недопустимо делать надписи карандашом по стеклу. На пробирке или флакончике достаточно надежна этикетка из лейкопластыря, на которой написано простым (графитным) карандашом, какой материал и от какого животного получен. На термос с пробами патматериала навешивают бирку из картона или фанеры, на которой указывают хозяйство, вид животного, вид материала и дату. Термос должен быть опечатан. Взятый материал с сопроводительным документом, содержащим полную информацию о животном, от которого взяты пробы, эпизоотологические данные хозяйства, предположительный диагноз и меры, принятые для ликвидации болезни (лечение, вакцинации и т. д.), а также дату и фамилию врача, направляют с нарочным. Этими данными руководствуются при выборе направления лабораторных исследований. Доставленные в лабораторию пробы рекомендуется немедленно использовать для выделения вируса. Если по каким-то причинам (отсутствие экспериментальных животных, куриных эмбрионов, культур клеток) исследование откладывается, материал необходимо хранить при температуре минус 40°С - минус 70°С. Большинство вирусов быстро разрушается в крови, спинномозговой жидкости, моче, соскобах и смывах носоглотки, а вирус парагриппа крупного рогатого скота и респираторно-синцитиальный вирус быстро погибают при замораживании, поэтому успех выделения их зависит от быстроты исследований. Если не известно, что исследуемое инфекционное заболевание было вызвано вирусом, часть материала отдают для бактериологического и микологического исследований.

Подготовка вируссодержащего материала для исследования.

В лаборатории полученный патматериал освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают от глицерина, взвешивают или измеряют. Часть материала берут для вирусологических исследований, оставшуюся часть хранят в холодильнике на случай дополнительных исследований. Затем составляют план исследований присланного материала.

Дата добавления: 2014-12-20 ; просмотров: 67 | Нарушение авторских прав

Очистка вирусов обычно осуществляется в три стадии:

1) осветление клеточного лизата;

2) концентрирование вирусной суспензии;

3) собственно очистка концентрированной суспензии.

Осветление нативных культуральных жидкостей проводится с целью удаления из них остатков клеток, упрощения дальнейшей очистки, и для облегчения эффективной обработки вирусов инактивирующими агентами. Осветление осуществляется методами фильтрации и центрифугирования. Часто оба указанных метода применяются в сочетании друг с другом, причем фильтрация сопровождает непрерывное центрифугирование.

Существует много способов концентрирования и очистки вирусов. Наиболее распространенные:

1. Методы преципитации. Преципитация (осаждение) нейтральными солями или органическими растворителями была первым методом, который применялся в крупномасштабном производстве очищенных вирусов, хотя многие вирусы более или менее нестабильны в присутствии органических растворителей.

2. Адсорбция-элюирование. Разработан процесс очистки и концентрирования, основанный на адсорбции вирусных частиц к нерастворимому комплексу, образуемому высокомолекулярным полимером этиленоксидом и ионами кальция. Сформированный с частицами вируса тройной комплекс выводится из системы преципитацией, а затем выделяется из смеси центрифугированием.

3. Ультрафильтрация. Ультрафильтрация представляет собой процесс, с помощью которого смесь веществ различной молекулярной массы в жидкой фазе подвергается разделению при прохождении ее под давлением через мембраны, имеющие определенный размер пор. Разделение происходит главным образом в зависимости от размеров молекул. Ультрафильтрация очень широко применяется для концентрирования вирусов и замены водной фазы вирусных суспензий перед дальнейшей очисткой.

4. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности. Применяется для полной очистки вирусов. Для использования градиентов плотности используют несколько сред, наиболее часто - сахарозу и хлорид цезия.

5. Метод ионообменной хроматографии. Концентрирование и очистку вирусов можно проводить с помощью колоночной ионообменной хроматографии. В качестве ионообменников обычно используют иониты, приготовленные на основе целлюлозы: ДЭАЭ, ТЭАЭ, эктеола и др.

6. Хроматография вирусов по размерам. Применяют сефадексы (молекулярные сита), которые позволяют разделить вирусы по величине частиц.

Оценка чистоты вирусных препаратов.Определение степени чистоты сложных субстанций (вирусные частицы) представляет значительные технические трудности. Гомогенный или монодисперсный, препарат вируса -это препарат, состоящий из частиц, однородных по размерам, форме, электрофоретической подвижности, плотности и антигенным свойствам. Эти критерии и лежат в основе методов, применяемых для проверки чистоты вирусных препаратов.

Для определения чистоты вирусных препаратов применяют следующие методы:

- электронная микроскопия вирусных частиц;

- центрифугирование в градиенте плотности.

В случае вирусных иммунобиологических препаратов, где очень сложная природа вирусных частиц может сделать трудными для оценки многие физико-химические критерии чистоты, главнейшей задачей очистки является удаление нежелательных иммуногенных и инфекционных материалов. В случаях, когда необходимо убедиться в отсутствии потенциальных контаминантов, таких, как сыворотка крови животных, наиболее подходящими являются серологические методы. Они в совокупности с другими физическими, химическими или биологическими тестами, придающими оценке препарата законную силу, составляют основу спецификации продукта.

Инактивация вирусов

При изготовлении некоторых препаратов (вакцин) вируссодержащую суспензию подвергают инактивации. Трудности производства инактивированных вакцин заключаются в необходимости строгого контроля за полнотой инактивации вируса. Методы инактивации делят на две общие группы: физические и химические. Наиболее часто в промышленном производстве используют химические методы.

Широкое применение в качестве инактивирующего агента получил формальдегид; для производства противоящурных вакцин во всем мире широко применяются азиридины; для инактивации вирусов ящура, болезни Ньюкасла, бешенства энцефалитов лошадей и др. используют β-пропиопактон.

Поскольку инактивирующие агенты легко реагируют с невирусными белками и некоторыми компонентами питательных сред, при выборе концентрации инактиванта необходимо учитывать степень чистоты препарата.

Физические инактивирующие агенты имеют ограниченное применение: ультрафиолетовый свет и ионизирующая радиация инактивируют нуклеиновые кислоты вирусов, при их применении необходимо учитывать, что повышение дозы облучения ведет к снижению антигеннности препарата. Тепловое воздействие на вирусы в целях уничтожения их инфекционности при сохранении иммуногенности также ограничено. Температура часто играет роль критического фактора при инактивации вирусов с применением химических средств.

Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; Нарушение авторского права страницы

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 15 Декабря 2012 в 11:09, курсовая работа

В процессе репродукции вируса в клетках происходит накопление его в тканях и жидкостях организма животных, однако в вируссодержащем материале доля вируса незначительна. Поэтому при проведении вирусологических исследований иногда приходится использовать специальные методы для очистки вируса от баластных веществ (остатков тканей, разрушенных клеток, микробов и т. д.), а иногда и концентрировать вирусы.

Меоды очистки вирусов.doc

Методы очистки и концентрации вирусов.

Очистку и концентрацию вирусов проводят с целью:

а) изучить морфологию вирусов;

б) получить очищенные антигены для серологических реакций;

в) получить высококачественные и эффективн ые вакцины.

Различают следующие методы очистки и концентрации вирусов:

I. Физические методы:

1. Термолизис. Применяется для очистки вирусов от тканевых
элементов и бактерий, широко используется в процессе подготовки
вируссодержащих суспензий из органов для вирусологических
исследований. С помощью этого метода освобождают вирусы из
клеток. Вначале готовят из органов суспензию растиранием в ступке
со стерильным песком, затем переносят в центрифужные пробирки
и несколько раз замораживают при низких температурах (-20, -
50° С) с последующими оттаиваниями при температуре 36-37° С в
термостате или при комнатной температуре. После последнего
оттаивания суспензию центрифугируют при 3-4 тыс. оборотов в
минуту 20-30 минут. Вирус будет находиться в надосадочной
жидкости. В дальнейшем из такой вируссодержащей жидкости
вирус можно концентрировать другими методами (например,
методом дифференциального центрифугирования и
ультрацентрифугированием).

2. Фильтрация вируссодержащего материала через
керамические, асбестовые и мембранные (градоколовые) фильтры.
При этом методе сначала материал фильтруют через различные бактериальные фильтры (Зейтца Шамберлана, Беркефельда) и очищают его от балластных веществ (бактерии, обрывки клеток и других частиц).
Затем фильтруют через мембранные фильтры с малыми размерами
пор. При этом вирусы остаются на фильтре (если размер пор меньше
размера вирусов). Затем фильтр измельчают или растирают с небольшим количеством стерильногофизраствора (или буфера), а затем центрифруют для осаждения частичек фильтра. Вирус будет сконцентрирован в надосадочной жидкости.

3. Дифференциальное центрифугирование. Методы центрифугирования основаны на разделении частиц по их массе. Обычно для центрифугирования используют охлажденный вируссодержащий жидкий материал и центрифуги с охлаждением. При дифференциальном

центрифугировании сначала центрифугируют материал при 3-4 тыс. оборотов в минуту 30 минут, надосадочную жидкость собирают в другую пробирку и вновь центрифугируют при более высоких оборотах (5-6 тыс.), жидкость сливают и для осаждения вируса центрифугируют уже затем при 30-60 тыс. оборотов в минуту. Осадок после этого центрифугирования ресуспендируют в небольшом количестве среды и используют в работе.

4. При центрифугировании в градиенте плотности используют разделение частиц по скорости седиментации в вязкой среде (обычно используют 20-60 % сахарозу и др.) и при этом образуются зоны, состоящие из .частиц одного типа.

5. Методы адсорбции вируса с последующей элюцией. Этот метод
основан на способности вирусов адсорбироваться, на поверхности
некоторых веществ или клеток, а в последующем удаляться
(элюировать) с сорбента при изменении условий (температуры,
рН среды и т. д.). В качестве сорбентов применяют гидроокись алюминия
гипс, некоторые бактерии (например, беспигментные штаммы
чудесной палочки), эритроциты.

В вирусологических лабораториях для очистки и концентрации
некоторых вирусов, таких как вирус гриппа в качестве сорбента используют эритроциты животных и птиц. На поверхности эритроцитов вирусы способны адсорбироваться при низкой температуре (+2, +4° С), а при повышении температуры до 37° С элюируют с поверхности эритроцитов в жидкость.

Обычно на эритроцитах адсорбируется до
95% вируса из среды, а элюирует 90-100%.

II . Химические методы

Методы осаждения вирусов химическими веществами :

I) Осаждение метанолом, который добавляют к охлажденной вирус-

содержащей жидкости при низких температурах до конечной Концентрации 35 %. Смесь оставляют на 4 часа при +4° С,

[Центрифугируют для осаждения, а затем растворяют в буферном растворе.

2) Осаждение вирусов в изоэлектрической точке.
Изоэлектрические точки большинства известных вирусов лежат в
диапозоне рН 3,5-6,5, т. к. вирусные белки в основном кислые. При этом
методе к вируссодержащей жидкости медленно при постоянном
помешивании добавляют 1 н раствор соляной кислоты при
температуре +4°С и доводят рН среды до изоэлектрической точки
данного вируса, смесь выдерживают на холоде несколько часов,
затем центрифугируют для осаждения 20-30 минут при 3-4 тыс.
оборотов, надосадочную жидкость сливают и осадок разводят в
слабощелочном буфере.

3) Осаждение солями и полиэтиленгликолем. Для осаждения вирусов обычно используют сернокислые соли магния, натрия и аммония. Наиболее широко применяется сульфат аммония.

К охлажденной вируссодержащей суспензии добавляют насыщенный раствор сернокислого аммония до определенной концентрации 35 %, а полиэтиленгликоля до концентрации 7,5 %,

перемешивают и оставляют на холоде на 16 часов, центрифугируют и осадок растворяют в фосфатном буфере.

4. Метод Ильенко: с использованием хлороформа или эфира. Метод пригоден для очистки вирусов от липидов и липоидов и применяется чаще для очистки нейротропных вирусов от мозговой ткани.

Из мозговой ткани готовят суспензию и к ней добавляют равный объем хлороформа или эфира, закрывают резиновой пробкой и тщательно встряхивают для хорошего перемешивания, выдерживают 2 часа в холодильнике при +4° С и центрифугируют 20-30 минут при 3-4 тыс. оборотов в минуту.

Если был добавлен эфир, вирус будет внизу, выше мозговая ткань и липиды, вверху эфир.

При добавлении хлороформа он будет находиться внизу, выше мозговая ткань и в верхнем слое вируссодержащая жидкость. Применяют этот метод для очистки только тех вирусов, которые являются нечувствительными к хлороформу и эфиру.

III биологические методы

Для очистки вируссодержашей жидкости от бактерий широко
применяют добавление к суспензии антибиотиков пенициллина и
стрептомицина, от плесеней и дрожжей добавляют нистатин.
Культивирование вирусов в злокачественных опухолях (осцит-
карцинома, саркома Крокера и др.), на куриных эмбрионах и в
культурах тканей позволяет очистить и накопить вирусы.

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Кызин А.А., Загидуллин Н.В., Гелич Л.В., Тимербаева Р.Х., Исрафилов А.Г.

Приведены данные по очистке вируса гриппа с применением различных микрофильтрационных мембран. Показано, что повышенное содержание натрия хлорида и небольшие концентрации детергентов в сочетании с ЭДТА значительно повышают проходимость вируса через микрофильтрационные мембраны. Наилучшим вариантом для очистки вируса гриппа является полиэфирсульфоновая мембрана 0.1 мкм в сочетании с дезагрегирующим раствором, содержащим 0.5 М натрия хлорида и 10 мМ ЭДТА, pH 7.4-7.8. Для концентрирования вируса гриппа и удаления низкомолекулярных примесей лучше всего подходит полиэфирсульфоновая мембрана 300 кД в сочетании со слабым раствором анионного детергента.

Purification and concentration of influenza virus by microand ultafiltration

The data on purification of influenza virus using various microfiltration membranes is given. It is shown that the higher content of sodium chloride and low concentrations of detergents in combination with EDTA considerably increase the virus permeability through the microfiltration membranes. Influenza virus passes freely only through the membrane with a nominal retention rate 0.65 μm. Through the membranes less than 0.65 μm influenza virus due to aggregation effect almost completely or partly concentrated. To prevent the virus concentration on the membrane surface due to aggregation after microfiltration it is necessary to carry out diafiltration of unfiltered solution by the disaggregating solution. For the best degree of purification is expedient to use a membrane with a pore size most closely to the size of the virus. The most suitable conditions for purification of influenza virus are 0.1 μm polyethersulfone membrane in combination with disaggregating solution containing 0.5 M sodium chloride and 10 mM EDTA, pH 7.4-7.8. Nonionic detergent, even in relatively low concentrations destructs the influenza virus and cannot be used as a disaggregating solution. The best conditions for concentration and removal low molecular weight impurities from influenza virus are membrane 300 kD in combination with a diluted solution of anionic detergent. During the diafiltration and concentration by detergent-containing solution of influenza virus on ultrafiltration membranes with molecular weight cut-off greater than 300 kDa considerable losses occur due to influenza virus passing through the membrane. To work with the viruses it is advisable to use the membranes made of polyethersulfone and polyvinylidene difluoride, and the depth prefilters based on polypropylene and glass fibers because the polyamide and regenerated cellulose have high sorption activity to viruses.

ОЧИСТКА И КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ВИРУСА ГРИППА МЕТОДОМ МИКРО- И УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ

Тел.: +7 (347) 229 92 64.

*Email: pto.ufa.microgen @mail. т

Приведены данные по очистке вируса гриппа с применением различных микрофильтрационных мембран. Показано, что повышенное содержание натрия хлорида и небольшие концентрации детергентов в сочетании с ЭДТА значительно повышают проходимость вируса через микрофильтрационные мембраны. Наилучшим вариантом для очистки вируса гриппа является полиэфирсульфоновая мембрана 0.1 мкм в сочетании с дезагрегирующим раствором, содержащим 0.5 М натрия хлорида и 10 мМ ЭДТА, рН 7.4-7.8. Для концентрирования вируса гриппа и удаления низкомолекулярных примесей лучше всего подходит полиэфирсульфоновая мембрана 300 кД в сочетании со слабым раствором анионного детергента.

Ключевые слова: вирус гриппа, микрофильтрация, ультрафильтрация, агрегация.

Несмотря на достижения медицины, заболевание гриппом остается одной из самых насущных медико-социальных проблем современного общества, поэтому вакцинация лиц, входящих в группу высокого риска заболеваемости, а также массовая вакцинация определенных групп людей может привести к значительному снижению заболеваемости и смертности от вируса гриппа и его осложнений. В связи с этим существенный интерес представляет собой поиск новых решений в области получения высокоочищенных гриппозных вакцин, обладающих низкой реактогенностью, не имеющих побочных эффектов и подходящих для людей различной возрастной категорий.

Одним из основных этапов производства вакцины является получение очищенного вирусного концентрата. На сегодняшний день для концентрирования различных вирусов широко применяются методы, основанные на микро- и ультрафильтрации [1]. Однако, несмотря на универсальность данных методов, существует ряд сложностей связанных с высокой способностью вирусов к ассоциации и сорбированию на поверхности вириона различных балластных соединений [6]. Механизмы вирусной ассоциации относятся к проблеме межбелкового электростатического взаимодействия, а также к возможной гидрофобизации вирусной поверхности в результате структурной или конформационной дезорганизации поверхностных гликопротеинов. Хорошо известным механизмом взаимодействия вирионов гриппа является, так называемое, сиало-зависимое взаимодействие, состоящее в том, что рецепторсвязывающие сайты на поверхности одного вириона связываются с сиаловыми остатками на поверхности другого вириона [2]. Все перечисленные способы вирусного взаимодействия могут иметь место у вируса гриппа в зависимости от свойств штамма, заряда вирусной поверхности, температуры, pH и состава вируссодержащей среды

[3]. В силу того что культивирование вируса гриппа, как правило, производится на куриных эмбрионах или линиях клеток, в состав вируссодержащей жидкости входит большое количество животного белка, который за счет электростатического взаимодействия также сорбируется на поверхности вируса, дополнительно увеличивая его оболочку. В результате при средних размерах вируса гриппа 80120 нм в растворе размер вирусных частиц может превышать 0.2 мкм [4]. Это явление негативно влияет на процесс очистки вируса гриппа фильтрацией на микропористых мембранах, снижая выход за счет частичного концентрирования вируса на поверхности мембраны. С другой стороны при концентрировании очищенной вируссодержащей жидкости ультрафильтрацией вместе с вирусом концентрируются балластные белки сорбированные на его поверхности, в связи с чем, возникает необходимость введения дополнительной стадии ультра-диафильтрации. Кроме того, значительные потери связаны с сорбцией вируса гриппа на поверхности полимерной мембраны, поэтому по окончании процесса очистки и концентрирования необходимо в мягких условиях провести процесс элюирования вируса с поверхности мембран, не вызывая инактивации и расщепления вируса [5].

Настоящая работа посвящена подбору полимерных мембран для очистки и концентрирования вируса гриппа, а также подбору растворов и условий проведения процесса, обеспечивающих мягкую дезагрегацию вируса и селективное прохождение вирусных частиц и низкомолекулярных примесей через мембрану в процессе очистки и концентрирования.

Материалы и методы

В работе использовали штаммы вируса гриппа: А/CaИfomia/07/2009 (НМ) и A/Perth/16/2009 (Нэ№), В/Brisbane/60/2008 (N^58).

Титр реакции гемагглютинации (РГА) определяли реакцией гемагглютинации на куриных эритроцитах [7].

Содержание гемагглютинина определяли методом одиночной радиальной иммунодиффузии.

Содержание овальбумина определяли с использованием иммуноферментной тест-системой ИФА-овальбумин [7].

Буферный раствор. Для промывки установок и приготовления дезагрегирующих растворов использовали фосфатный буферный раствор (ФБР), содержащий 0.9% натрия хлорида pH 7.2±0.2.

Результаты и обсуждение

Очистка вируссодержащей среды микрофильтрацией в тангенциальном потоке. Предва-

Изучение влияния повышенного содержания натрия хлорида и детергентов в растворе на агрегирование вируса. Известно, что сильным дезагрегирующим действием обладает раствор натрия хлорида, а также растворы детергентов. Наиболее оптимальной концентрацией натрия хлорида не оказывающей разрушающего воздействия на вирус гриппа при кратковременном воздействии является 0.5 М раствор. Для детергентов это значение лежит в области 0.02-0.002%. На основании этих данных для предотвращения агрегирования вируса гриппа было решено по окончании микрофильтрации ВАЖ подвергнуть непрофильтрован-ные остатки пятикратной диафильтрации буферным раствором содержащим: 1) 0.5 М натрия хлорида, 2) 0.5 М натрия хлорида, 0.02% неионного детергента, 3) 0.5 М натрия хлорида и 0.002% анионного детергента. С этой же целью был взят ФБР с более щелочным диапазоном pH 7.4-7.8 и в каждый раствор добавлен этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) до концентрации 10 мМ. Степень прохождения вируса через мембрану также контролировали по титру гемагглютинации проб фильтрата и непрофильтрованного остатка (табл. 2). Из таблицы видно, что выбранные растворы на основе натрия хлорида, детергентов и ЭДТА значительно снижали агрегирование и позволяли вирусу беспрепятственно проходить через мембраны всех рейтингов.

Результаты фильтрации вируса гриппа на микрофильтрационных модулях__

Штамм вируса Микро фильтрационный модуль Титр РГА исходная ВАЖ (объем 10 л) Титр РГА очищенная ВАЖЯ (объем 12 л) Титр РГА Концентрат4 (объем 1 л) Степень прохождения вируса, %

0.1 мкм, PESC (Владисарт) 1:320 1:40 1:2560 15

0.2 мкм, PVDF" (Millipore) 1:320 1:80 1:1280 30

А (H1N1) 0.2 мкм, PES (Владисарт) 1:320 1:80 1:1280 30

0.45 мкм, PES (Владисарт) 1:320 1:160 1:1280 60

""очищенная ВАЖ - фильтрат, полученный при пропускании ВАЖ через микрофильтрационную установку, объединенный с фильтратом ФБР, полученным при промывке концентрата. ^концентрат - непрофильтрованный остаток, CPЕS - полиэфирсульфон, ¿PVDF - поливинилидендифторид

Диафильтрация концентрата вируса гриппа на микрофильтрационных модулях

Наименование раствора для диафильтрации

Микро фильтрационный модуль

Титр РГА исходная ВАЖ (объем 10 л)

Титр РГА очищенная ВАЖ (объем 12 л) Титр РГА концентрат (объем 1 л)

Читайте также: