Мутантные формы вируса гепатита в

Комплексное исследование при подтвержденном вирусном гепатите В (HBV). Анализ маркеров инфекции позволяет установить клиническую стадию заболевания, иммунологический статус обследуемого, а также оценить эффективность лечения. Включает в себя определение белков вируса (антигенов), основных классов специфических антител, а также обнаружение ДНК вируса в крови.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исключить из рациона жирную пищу в течение 24 часов до исследования.
Не курить за 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Вирусный гепатит B (HBV) – инфекционное заболевание, которое является причиной серьёзных поражений печени. Зачастую гепатит B переходит в хроническую форму, его течение становится затяжным и провоцирует возникновение цирроза и рака печени.

Вирус гепатита B (Hepadnaviridae) содержит двухцепочечную ДНК, окруженную нуклеокапсидом размером 27 нм, в состав которого входит антиген HBcAg, и внешней оболочкой, содержащей антиген HBsAg. Этот антиген обнаруживается в крови за 6 недель до появления симптомов заболевания и может выявляться длительное время как при их наличии, так и в при их отсутствии (при хроническом гепатите и носительстве). На ранних стадиях заболевания присутствует у 90-95 % больных.

Особенностью вируса гепатита B является то, что он поступает непосредственно в кровь и циркулирует в ней на протяжении всего периода заболевания. У некоторых пациентов вирус в крови сохраняется всю жизнь. По этой причине источником заражения могут стать не только те, кто болен гепатитом в его острой форме, но также те, кто уже перенес данное заболевание, а также люди, у которых заболевание не проявляется, однако они являются носителями вируса.

Полное выздоровление регистрируется у 92-95 % больных острым гепатитом В, и лишь у 5-8 % из них отмечается переход заболевания в хроническую форму.

Гепатит B лечится исключительно в условиях стационара. Это заболевание в случае длительного течения является фактором риска развития первичной гепатоцеллюлярной карциномы (рак печени).

В жизнедеятельности вируса гепатита В различают две фазы: фазу репликации и фазу интеграции. В фазе репликации происходит воспроизведение (размножение) вируса. ДНК вируса проникает в ядро гепатоцита, где с помощью ДНК-полимеразы синтезируется нуклеокапсид, содержащий ДНК вируса, антигены HBcAg, HBeAg, которые являются основной мишенью иммунной системы. Затем нуклеокапсид мигрирует из ядра в цитоплазму, где реплицируются белки внешней оболочки (HBsAg), и, таким образом, происходит сборка полного вириона. При этом избыток HBsAg, не использованный для сборки вируса, через межклеточное пространство попадает в кровь. Полная сборка (репликация) вируса заканчивается презентацией его растворимого нуклеокапсидного антигена – HBeAg на мембране гепатоцита, где происходит его "узнавание" иммуноцитами. Антиген HBcAg серологическими методами не определяется, потому что отсутствует в крови в свободном виде. Определяется наличие в крови антител (anti-HBc) к этому антигену, вырабатывающихся вследствие его высокой иммуногенности.

Маркерами фазы репликации вируса гепатита В являются:

выявление в крови антигенов HBeAg и anti-HBc (Ig M).

У 7-12 % больных хроническим вирусным гепатитом В возможен спонтанный переход фазы репликации в нерепликативную фазу (при этом из крови исчезает HBeAg и появляются anti-HBe). Именно фаза репликации обусловливает тяжесть поражения печени и контагиозность больного.

В фазе интеграции происходит интегрирование (встраивание) фрагмента вируса гепатита В, несущего ген HBsAg, в геном (ДНК) гепатоцита с последующим образованием преимущественно HBsAg. При этом репликация вируса прекращается, однако генетический аппарат гепатоцита продолжает синтезировать HBsAg в большом количестве.

Вирусная ДНК может быть интегрирована не только в гепатоциты, но и в клетки поджелудочной железы, слюнных желез, лейкоциты, сперматозоиды, клетки почек.

Фаза интеграции сопровождается становлением клинико-морфологической ремиссии. В этой фазе в большинстве случаев формируется состояние иммунологической толерантности к вирусу, что приводит к купированию активности процесса и носительству HBsAg. Интеграция делает вирус недосягаемым для иммунного контроля.

Серологические маркеры фазы интеграции:

наличие в крови только HBsAg или в сочетании с anti-HBc (IgG);
отсутствие в крови ДНК-вируса;
сероконверсия HBeAg в anti-HBe (т.е. исчезновение из крови HBeAg и появление anti-HBe).

Пациенты, перенесшие инфекцию и имеющие антитела к вирусу, не могут повторно заразиться гепатитом B. В некоторых случаях полное выздоровление не наступает и человек становится хроническим вирусоносителем. Вирусоносительство может протекать бессимптомно, но в некоторых случаях развивается хронический активный гепатит B. Ключевым фактором риска активного вирусоносительства является возраст, когда человек был заражен: для грудных детей уровень риска превышает 50 %, в то время как для взрослых остается на уровне 5-10 %. Исследования показывают, что мужчины чаще становятся носителями, чем женщины.

HBsAg – поверхностный антиген вируса гепатита В

Поверхностный антиген вируса гепатита В (HВsAg) является белком, который присутствует на поверхности вируса. Обнаруживается в крови при остром и хроническом гепатите В. Самый ранний маркер. Достигает максимума к 4-6-й неделе заболевания. Сохраняется до 6 месяцев при остром гепатите, свыше 6 месяцев – при переходе заболевания в хроническую форму.

HBeAg – ядерный 'е’-антиген вируса гепатита В

Антиген, находящийся в ядре вируса. Появляется в крови одновременно с HBsAg и сохраняется в течение 3-6 недель. HBeAg появляется в крови больного острым гепатитом В одновременно с HBsAg или вслед за ним и сохраняется в крови 3-6 недель. Указывает на активное размножение и высокий риск передачи вируса при половом контакте, а также перинатально. Инфекционность HBeAg-положительной сыворотки в 3-5 раз выше, чем HBsAg-положительной. Выявление HBeAg в крови более 8-10 недель свидетельствует о переходе заболевания в хроническую форму. При отсутствии репликативной активности вируса во время хронической инфекции HBeAg не выявляется. Его появление же свидетельствует о реактивации вируса, что чаще происходит на фоне иммуносупрессии.

При лечении вирусного гепатита В исчезновение HBeAg и появление антител к HBe-антигену свидетельствует об эффективности терапии.

anti-HBc (Ig M) – специфические антитела класса IgМ к ядерному 'core' антигену вируса

Начинают вырабатываться еще до клинических проявлений, указывают на активную репликацию вируса.

Появляются в крови через 3-5 недель, сохраняются в течение 2-5 месяцев и исчезают в период выздоровления.

anti-HBc – суммарные антитела (IgM+IgG) к ядерному ‘core' антигену вируса гепатита В

Важный диагностический маркер, особенно при отрицательном значении HBsAg. Антитела класса IgM вырабатываются через 3-5 недель. Антитела класса IgG начинают вырабатываться с 4-6-го месяца и могут сохраняться пожизненно. Подтверждают контакт организма с вирусом.

anti-HBs – суммарные антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В

Появляются медленно, достигая максимума через 6-12 месяцев. Указывают на перенесенную инфекцию или наличие поствакцинальных антител. Выявление этих антител свидетельствует о выздоровлении и развитии иммунитета. Обнаружение антител в высоком титре в первые недели заболевания может быть связано с развитием гипериммунного варианта фульминантного гепатита В.

anti-HBe – антитела к 'е’-антигену вируса гепатита В

Появляются на 8-16-й неделе после инфицирования у 90 % больных. Свидетельствуют о завершении острого периода болезни и начале периода реконвалесценции. Могут сохраняться до 5 лет после перенесенного заболевания.

HBV (ДНК) – ДНК вируса гепатита В

Маркер наличия и репликации вируса. Методом ПЦР можно определить ДНК вируса качественно или количественно. Благодаря качественному методу подтверждается присутствие вируса гепатита В в организме и его активное размножение. Это особенно важно в сложных диагностических случаях. При инфицировании мутантными штаммами вируса результаты теста на специфические антигены HBsAg и HBeAg могут быть отрицательными, но при этом риск распространения вируса и развития заболевания у зараженного человека сохраняется.

Качественное определение ДНК вируса играет важную роль в раннем выявлении гепатита В у людей с высоким риском инфицирования. Генетический материал вируса обнаруживается в крови на несколько недель раньше, чем HBsAg. Положительный результат ПЦР за период более 6 месяцев указывает на хроническую инфекцию. Определение вирусной нагрузки (количество ДНК вируса в крови) позволяет оценить вероятность перехода заболевания в хроническую форму.

Повышенные уровни печеночных трансаминаз при положительном результате ПЦР являются показателями необходимости проведения терапии. Во время лечения вирусного гепатита В исчезновение ДНК вируса свидетельствует об эффективности лечения.

Для чего используется исследование?

Для оценки серологического профиля;
для выяснения стадии заболевания и степени контагиозности;
для подтверждения заболевания и уточнения его формы (острая, хроническая, носительство);
для наблюдения за течением хронического гепатита В;
для оценки эффективности противовирусной терапии.

Когда назначается исследование?

При выявлении у пациента поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg);
при подозрении на инфицирование вирусом гепатита В и сомнительных результатах серологических тестов;
при микст-гепатитах (сочетанные вирусные гепатиты В и С);
при динамическом наблюдении за больным гепатитом В (определение стадии процесса при совместном исследовании на другие специфические маркеры инфекции).

Что означают результаты?

Для каждого показателя, входящего в состав комплекса:

Острый гепатит В. Выделяют "дикий" штамм (естественный) и "мутантный" штамм (вид) вируса. Определение штамма вируса имеет определенное значение при выборе противовирусного лечения. Мутантные штаммы вируса несколько хуже поддаются лечению в сравнении с "диким".

Хронический гепатит В (ХВГВ). Выделяют три серологических варианта:

ХВГВ с минимальной активностью (ранее использовали термин "носительство HBsAg");
НВе-негативный ХВГВ;
НВе-позитивный ХВГВ.

Интерпретация сочетаний серологических маркеров гепатита В

М.И. МИХАЙЛОВ, член-корреспондент РАЕН, профессор, руководитель лаборатории.
В соавторстве с Т.А. СЕМЕНЕНКО. Гепатит В - широко распространенная вирусная инфекция, в клинически выраженных случаях характеризуется симптомами острого поражения печени и интоксикации, отличается многообразием клинических проявлений и исходов заболевания (выздоровление, развитие хронического гепатита, цирроза и рака печени).

Для исследователя, занимающегося вирусными инфекциями человека, гепатит В представляет особый интерес. Отвечая на вопрос, почему это так, можно привести следующие основные доводы:
- вирус гепатита В (HBV) - самый изменчивый ДНК-содержащий вирус;
- разнообразие антигенов вируса и антител к ним позволяет проводить диагностику, предсказание характера течения и исходов заболевания и профилактику постгрансфузионного гепатита, при этом требуя новых, наиболее информативных тестов индикации;
- множественность путей передачи возбудителя, определяющих его глобальное, но неравномерное распространение, что вызывает повышенный интерес эпидемиологов;
- существующие параллели между гепатитом В и ВИЧ-инфекцией делают правомерным определение, сформулированное как "гепатит В - кузина ВИЧ", заставляя организаторов здравоохранения разрабатывать новые подходы в работе;
- HBV - этиологический агент первичного рака печени.

Кроме того, наличие эффективной вакцины против гепатита В и ее применение позволяют получить удовлетворение от работы, реально ощущая воможность защиты людей от этой страшной инфекции.

Вирус, его размножение и мутантные формы

HBV - основной представитель семейства гепаднавирусов, от "hepar" - печень; "dna" - ДНК. Помимо вируса гепатита В человека в это семейство входят вирусы гепатита сурков, земляных белок, сусликов, пекинских уток и других животных. Объединяющие характеристики этих вирусов: сходное строение; циркулярная дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК); общая стратегия размножения вируса; преимущественное размножение в клетках печени; возможность длительной (иногда пожизненной) циркуляции вируса в организме; взаимосвязь с развитием первичного рака печени.

Частицы вируса гепатита В представляют собой сферические частицы размером 42 нм, имеющие ядро и оболочку, состоящую из поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Информация о вирусных антигенах и белках, необходимых для его существования, заключена в небольшой (всего 3200 нуклеотидов) двуцепочечной кольцевой молекуле ДНК. В ней выделяют 4 гена - несущих информацию о HBsAg (S-ген); ядерном антигене - НВсАд (С-ген), ферменте ДНК - полимеразе (Р-ген) и Х-белке (Х-ген).

Заражение гепатитом В происходит при непосредственном попадании вируса в кровь, через слизистые оболочки или поврежденные кожные покровы. Считается, что любой человек, не имеющий антител к HBsAg, может заболеть гепатитом В. Чрезвычайно высокая инфекционность вируса (некоторые образцы сывороток крови с наличием HBV могут вызвать заболевания в разведениях 10 -7 - 10 -8 и устойчивость к различным физико-химическим воздействиям определяют широкое распространение гепатита В. Достигая по кровеносным сосудам клеток печени, вирус адсорбируется на их поверхности. Изучение механизма адсорбции и проникновения в клетку позволило выявить несколько специфических рецепторов на HBsAg и гепатоците. Помимо рецепторов, информация о которых заложена непосредственно в ДНК вируса (Pre-S1 и Pre-S2), в процессе адсорбции принимает участие печеночный белок аннексии V. В последние два года определено, что процесс адсорбции и проникновения вируса гепатита В представляет собой сложный механизм, вовлекающий несколько клеточных белков. Кроме того, установлено, что размножение вируса гепатита В может происходить не только в гепатоцитах, но и в других клетках организма человека: клетках крови, селезенки, поджелудочной железы и др.

Из всех известных ДНК-содержащих вирусов человека вирус гепатита В имеет самый сложный цикл размножения. Для того, чтобы получить новые вирусные частицы, репликация ДНК включает в себя дополнительный этап, когда с ДНК синтезируется РНК и лишь только с нее считывается информация о ДНК-HBV. Этот дополнительный этап репликации, не свойственный для других ДНК-содержащих вирусов, приводит к возможному появлению мутантных форм вируса гепатита В.

Изучение изолятов вируса гепатита В, выявленных в различных регионах мира, позволило установить наличие 6 основных генотипов, обозначенных А, В, С, D, Е и F. Определено, что HBV генотип F чаще выявляется у больных с тяжелым течением заболевания. В последние годы интерес исследователей вируса гепатита В был сконцентрирован на мутантной форме, обозначенный как Pre Core мутант вируса гепатита В. Установлено, что эта мутация возникает из-за замены одной аминокислоты (гуанин) на другую (аденин) в участке С-гена. У носителей вируса это приводит к прекращению синтеза НВеАg, атаке иммунных клеток на пораженные клетки и ухудшению самочувствия пациента. В подавляющем большинстве случаев эти больные плохо поддаются лечению препаратами интерферона. Всесте с тем продемонстрировано, что применяемые вакцины против гепатита В защищают человека от заражения различными генотипами и Pre Core мутантом вируса гепатита В.

Более тяжелому течению острого гепатита В способствуют следующие факторы: сопутствующие заболевания, такие, как сахарный диабет, язвенная болезнь, системные заболевания крови, прием наркотиков, тяжелые физические нагрузки и др.

Заражение вирусом гепатита В приводит к развитию инфекции с острым или хроническим течением заболевания. Причем инфекция может протекать как в желтушной, так и безжелтушной форме, их соотношение 1:6 - 1:8. Считается, что поражение гепатоцитов в основном связано не с непосредственным действием вируса, а с иммунопатологическими процессами. Так, механизм разрушения гепатоцитов в самых общих чертах может быть описан следующим образом: попав в кровь, вирус вызывает активацию В- и Т-клеточного звена иммунитета человека. Т-киллеры взаимодействуют с антигенами вируса гепатита В и антигенами главного комплекса гистосовместимости, представленными на поверхности печеночной клетки, вызывая разрушение гепатоцитов.

Кроме этого, значительную роль в развитии патологического процесса гепатита В играют аутоиммунные реакции, т.е. реакции на собственные компоненты гепатоцитов (полиальбумин, липополипротеид, фрагменты мембран митохондрий и др.). При этом происходит разрушение не только зараженных, но и незараженных гепатоцитов. В данном случае HBV играет пусковую роль в развитии аутоиммунного компонента гепатита В. Определенную роль имеют и циркулирующие иммунные комплексы HBsAg с антителами к нему. Считается, что эти комплексы определяют внепеченочные поражения при гепатите В, такие, как гломерулонефрит, узелковый периартериит и др.

Гепатит В может иметь легкое, средне-тяжелое и тежелое течение заболевания, включая фульминантный гепатит, который в большинстве случаев заканчивается смертью больного. Летальность при гепатите В составляет 0,4-1%. Более тяжелому течению острого гепатита В способствуют следующие факторы: сопутствующие заболевания, такие, как сахарный диабет, язвенная болезнь, системные заболевания крови, прием наркотиков, тяжелые физические нагрузки и др. К утяжелению инфекции приводит одновременное заражение вирусами гепатитов А, С и D. Так, например, известно, что острый гепатит С в подавляющем большинстве случаев имеет легкое течение, однако при сочетании с гепатитом В он протекает тяжело, иногда с летальным исходом.

Особенностью гепатита В является возможное развитие хронического гепатита В, который регистрируется в 5-10% случаев, при этом, очевидно, большая часть из них ассоциирована с присоединением дельта вирусной инфекции. Причины развития хронического процесса окончательно не установлены. Считается, что прежде всего это может быть связано с наличием у больного нарушений в клеточном звене иммунитета и с низкой продукцией эндогенно синтезированного интерферона. При гепатите В существует общая закономерность - чем в более раннем возрасте человек инфицируется вирусом, тем больше вероятность развития хронического гепатита. Так, при перинатальном инфицировании новорожденных, чьи матери помимо HBsAg имели НВеАg, хронический гепатит формируется в 80-90% случаев. У 15-20% больных хроническим гепатитом В происходит постепенное (5-20 лет) прогрессирование в цирроз, а у части из них - в первичный рак печени.

Гепатит В - "кузина СПИД"

Пaраллели между этими заболеваниями очень велики. Наличие вируса специфического фермента - ДНК-полимеразы, обладающей функцией обратной транскриптазы, позволяет называть вирус гепатита В как скрытый ретровирус. Обращает на себя внимание общность многих эпидемиологических характеристик СПИДа и гепатита В. Они касаются, в первую очередь, способов передачи заразного начала при обеих инфекциях: половой контакт, контаминированные вирусами инструменты при парентеральных манипуляциях, контаминированная кровь и ее продукты; передача от матери плоду или новорожденному. Соответственно, СПИД и гепатит В имеют общие группы риска. В случаях заражения гепатитом В лиц, инфицированных ВИЧ, инфекция быстро переходит в активную форму.

Первичный рак печени

Исследования, проведенные в различных странах мира, выявили, что около 80% всех случаев первичного рака печени связано с вирусом гепатита В. Наиболее часто он возникает у лиц старше 40-50 лет, страдающих циррозом печени. Вместе с тем необходимо отметить тенденцию к более частой регистрации первичного рака печени среди лиц молодого возраста.

Теоретически предполагают несколько путей реализации онкогенного действия HBV. Это возможное наличие в ДНК HBV нуклеиновых последовательностей с онкогенной функцией, так называемых онкогенов. Обнаружение белков, кодированных Х-геном HBV, в крови больных с первичным раком печени косвенно свидетельствует о роли этого антигена в развитии рака. Кроме того, предполагают, что HBV имеет свойство биологического мутaгена, приводящего к развитию этой опухоли печени. Взаимосвязь вируса гепатита В и первичного рака печени позволила предположить, что вакцинация против гепатита В снизит заболеваемость и первичным раком печени.

Бессимптомное носительство вируса

О носительстве HBV судят по обнаружению HBsAg в течение более шести месяцев при отсутствии клинических, морфологических и биохимических признаков гепатита. В настоящее время носительство HBV однозначно рассматривается как патологическое состояние организма. Длительный синтез HBsAg, в ряде случаев в течение всей жизни, связан с интеграцией ДНК HBV в геном гепатоцитов. Впервые гипотеза об интегративной природе носительства HBV высказана В.М. Ждановым и С. Хиршманом в конце 70-х годов, в дальнейшем она была экспериментально подтверждена. Носители HBsAg составляют основной резервуар вируса гепатита В. В настоящее время на земном шаре проживает более 300 млн бессимптомных носителей вируса, из них около 5 млн - в нашей стране. Многочисленные исследования продемонстрировали повсеместное, но неравномерное распространение носительства HBsAg. В России частота выявления колеблется от 1,5% в европейской части страны до 4-5% в Якутии и на Дальнем Востоке.

Состояние носительства может длиться до 10 лет и более. Ежегодно 1-2% носителей HBsAg спонтанно эллиминирует антиген. Причины и механизмы этого явления до сих пор не выяснены. В настоящее время отсутствуют эффективные методы и средства, способные исключить из гепатоцита интегрированный геном ДНК HBV.

Вакцины против гепатита В

Создание вакцины против гепатита В - одно из важнейших завоеваний человечества. Основой вакцины служит поверхностный антиген вируса гепатита В, поскольку было установлено, что лица, имеющие антитела к нему, повторно не заболевают. Источником антигена являлись сыворотка или плазма крови носителей HBsAg. Антиген очищали, подвергали инактивации, адсорбировали на гидроокиси алюминия и использовали в качестве вакцинного препарата. По источнику получения антигена такие вакцины обозначали как "плазменные". Эти вакцины обладали высокой иммуногенностью и были эффективны, однако имели существенный недостаток. Несмотря на то, что не было зарегистрировано ни одного случая заражения гепатитом В от введения вакцины, существовал теоретический риск возможного попадания HBV в готовую серию вакцины, так как она изготавливалась из заведомо зараженного материала. Открытие ВИЧ добавило опасений, связанных и с этим вирусом. Кроме того, прогресс молекулярной биологии позволил приступить к созданию вакцин против гепатита В нового поколения - рекомбинантных. Общая схема их получения включает следующие этапы: из молекулы ДНК HBV выделяли ген, отвечающий только за синтез HBsAg, который вводили в дрожжевые клетки; они начинали синтезировать антиген, который очищали от балластных белков. Полученный антиген, обладающий чрезвычайно высокой степенью очистки (99,99%), адсорбировали на гидроокиси алюминия и использовали в качестве вакцинного препарата. Благодаря высокой иммуногенности и чрезвычайно низкой реактогенности рекомбинантные вакцины широко используются во всем мире.

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Елпаева Екатерина Александровна, Писарева Мария Михайловна, Никитина Олеся Евгеньевна, Кижло Светлана Николаевна, Грудинин Михаил Павлович

Целью исследования явилось определение распространенности генотипов вируса гепатита В , циркулирующих в Северо-Западном регионе России (Санкт-Петербурге, Ленинградской области и Республике Карелия), выявление мутаций, ответственных за развитие устойчивости к аналогам нуклеозидов/нуклеотидов, а также preS/S-мутаций , влияющих на синтез HBsAg и течение хронического гепатита В. Обследовано 579 больных ХГВ на наличие ВГВ в крови и/или ткани печени, генотип определен у 226 больных, секвенирование фрагмента гена полимеразы выполнено у 49 пациентов, особенности клинического течения ХГВ изучены у 67 больных у 26 с HBsAg и у 41 с серологическими признаками preS/S-мутаций . Вирусная ДНК выявлена у 323 (55,8 %) больных ХГВ, генотип D обнаружен у 183 (81,0 %), генотип А у 37 (16,4 %) и микст D+А у 6 (2,7 %) пациентов. Среди 49 пациентов первичные, вторичные и паттерн-мутации устойчивости к аналогам нуклеозидов выявлены у 14 (28,6 %) пациентов, данные мутации вызывали рецидив HBV-инфекции. PreS/S-мутации , ответственные за исчезновение HBsAg, выявлены у 2 (4,1 %) пациентов. PreS/S-мутантная вирусная инфекция при длительном течении ХГВ (>20 лет) вызывала прогрессирование некротически-воспалительного и фибротического процессов в печени и трансформацию гепатита в цирроз печени. Оценка генетической структуры вируса гепатита В имеет важное значение для диагностики, противовирусного лечения и прогнозирования клинического течения хронического гепатита В.

ROLE OF HEPATITIS B VIRLJS MIJTANT FORMS IN PROGRESSIVE COURSE OF CHRONIC HEPATITIS B

The aim of the study was to determine the prevalence of HBV genotypes in the North-West of Russia (St. Petersburg, Leningrad region, and Republic of Karelia), to identify mutations responsible for resistance to nucleotide/nucleoside analogs (AN), preS/Smutations, canceling the HBsAg synthesis, and to detect the preS/S-mutations influence on the CHB course. HBV was analysed in plasma and/or in the liver biopsy materials of 579 patients with CHB; the genetic type was revealed in 226 patients; sequence analysis of polymerase gen was performed in 49 patients; peculiarities of CHB clinical course were studied in 67 patients: in 26 with HBsAg and in 41 patients with serological marker of preS/S-mutations . Viral DNA was detected in 323 (55,8 %) CHB patients, D genotype was revealed in 183 (81,0 %), A genotype in 37 (16,4 %) and mixed D+А in 6 (2,7 %) patients. Primary, secondary and pattern-mutations of resistance to drugs (nucleotide/nucleoside analogs) were detected in 14 (28,6 %) from 49 patients. These mutations caused the HBV-infection relapse. PreS/S-mutations , responsible for the HBsAg disappearance, were revealed in 2 (4,1 %) patients. PreS/S-mutation viral infection caused progressive liver necroinflammation, fibrosis, and transformation of CHB in liver cirrhosis after more than 20 years of clinical course. The estimation of the viral genetic structure has special significance for diagnosis, antiviral treatment, and prognosis of chronic hepatitis B clinical course.

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ ПЕТРОЗАВОДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА

Медицинские науки 2014

ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЕЛПАЕВА

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии, НИИ гриппа Минздрава России (Санкт-Петербург, Российская Федерация) elpaevak@gmail. com

МАРИЯ МИХАЙЛОВНА ПИСАРЕВА

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии, НИИ гриппа Минздрава России (Санкт-Петербург, Российская Федерация) pisareva@influenza. spb. ru

ОЛЕСЯ ЕВГЕНЬЕВНА НИКИТИНА кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отделения экспериментальных научных исследований, НИИ гриппа Минздрава России (Санкт-Петербург, Российская Федерация) nikitina@influenza. spb. ru

СВЕТЛАНА НИКОЛАЕВНА КИЖЛО зав. отделением, Центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями (Санкт-Петербург, Российская Федерация) [email protected]

МИХАИЛ ПАВЛОВИЧ ГРУДИНИН

кандидат биологических наук, зав. лабораторией молекулярной вирусологии и генной инженерии, НИИ гриппа Минздрава России (Санкт-Петербург, Российская Федерация) [email protected]

ОЛЬГА ПЕТРОВНА ДУДАНОВА доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой пропедевтики внутренних болезней медицинского факультета, Петрозаводский государственный университет (Петрозаводск, Российская Федерация) [email protected]

РОЛЬ МУТАНТНЫХ ФОРМ ВИРУСА ГЕПАТИТА В В ПРОГРЕССИРУЮЩЕМ ТЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА В

Целью исследования явилось определение распространенности генотипов вируса гепатита В, циркулирующих в Северо-Западном регионе России (Санкт-Петербурге, Ленинградской области и Республике Карелия), выявление мутаций, ответственных за развитие устойчивости к аналогам нуклеозидов/нуклеотидов, а также preS/S-мутаций, влияющих на синтез HBsAg и течение хронического гепатита В. Обследовано 579 больных ХГВ на наличие ВГВ в крови и/или ткани печени, генотип определен у 226 больных, секвенирование фрагмента гена полимеразы выполнено у 49 пациентов, особенности клинического течения ХГВ изучены у 67 больных - у 26 с HBsAg и у 41 - с серологическими признаками preS/S-мутаций. Вирусная ДНК выявлена у 323 (55,8 %) больных ХГВ, генотип D обнаружен у 183 (81,0 %), генотип А - у 37 (16,4 %) и микст D+А - у 6 (2,7 %) пациентов. Среди 49 пациентов первичные, вторичные и паттерн-мутации устойчивости к аналогам нуклеозидов выявлены у 14 (28,6 %) пациентов, данные мутации вызывали рецидив HBV-инфекции. PreS/S-мутации, ответственные за исчезновение HBsAg, выявлены у 2 (4,1 %) пациентов. PreS/S-мутантная вирусная инфекция при длительном течении ХГВ (>20 лет) вызывала прогрессирование некротически-воспа-лительного и фибротического процессов в печени и трансформацию гепатита в цирроз печени. Оценка генетической структуры вируса гепатита В имеет важное значение для диагностики, противовирусного лечения и прогнозирования клинического течения хронического гепатита В.

Ключевые слова: вирус гепатита В, генотипы, мутации лекарственной резистентности, preS/S-мутации, хронический гепатит В, секвенирование

Хронический гепатит В является одной из глобальных проблем мирового здравоохранения. В мире вирусом гепатита В (ВГВ) инфицированы около 350 миллионов человек, и около миллиона носителей вируса ежегодно умирает от печеноч-

ной недостаточности, цирроза печени и гепато-целлюлярной карциномы. Основные успехи в лечении хронического гепатита B (ХГВ) связаны с развитием знаний о молекулярно-биологических особенностях вируса [5], [8], [13]. Одним из на-

Е. А. Елпаева, М. М. Писарева, О. Е. Никитина, С. Н. Кижло, М. П. Грудинин, О. П. Дуданова

иболее важных факторов, влияющих на тяжесть течения болезни и эффективность противовирусного лечения, является генотип вируса и структура его генома, которая подвержена постоянным изменениям в результате мутаций [16].

В настоящее время выделяют десять генотипов ВГВ - A-J генотипы [6], [7], [12], [17]. Отмечается зависимость частоты носительства ВГВ, частоты хронизации гепатита, путей передачи вируса, клинического течения ХГВ и эффективности противовирусной терапии (ПВТ) от генотипов вируса [6]. Информации в литературе о распространенности различных генотипов ВГВ на территории Российской Федерации недостаточно, и данная проблема требует дальнейшего изучения [1], [2], [3], 4].

Генетическая гетерогенность вирусной популяции у пациента обусловлена двумя ключевыми факторами: противостоянием вируса иммунной системе хозяина и воздействием ПВТ. Так, под воздействием иммунного прессинга формируются ргеС/С и preS/S-мутации, приводящие к снижению и/или прекращению синтеза вирусных антигенов (HBeAg, HBsAg), а под влиянием противовирусных препаратов - аналогов нуклео-зидов/нуклеотидов (АН) - происходит возникновение мутаций в гене полимеразы и развивается лекарственная резистентность. В связи с этим чрезвычайную важность для верификации гепатита В, определения клинического течения заболевания и назначения своевременного лечения представляют данные о структуре генома ВГВ.

В последовательности полимеразы ВГВ содержится YMDD-мотив, замены в котором играют основную роль в формировании устойчивости вируса к АН - ламивудину (ЛАМ), адефовиру (АДФ), энтекавиру (ЭТВ), телбивудину (ТБВ). Ус -тойчивость к ламивудину связана с мутациями, приводящими к заменам в полимеразном белке М204У, L180M и др., устойчивость к адефовиру - к заменам N236T, A181V, к энтекавиру - I169T, M250V, T184G, S202I, к телбивудину - M204I/V [14], [15]. Данные изменения генетической структуры вируса не только снижают эффективность лекарственного контроля репликации вируса, но могут усиливать резистентность и изменять клиническое течение ХГВ.

Поскольку геном ВГВ имеет перекрывающиеся рамки считывания, мутации в полимеразном гене могут изменять свойства поверхностных белков. PreS/S-мутации, возникающие самостоятельно или сочетающиеся с полимеразными мутациями, также способны влиять на серологические и клинические особенности ХГВ. Они приводят к изменению структуры HBsAg, снижению или прекращению его секреции из гепатоцита, что, с одной стороны, затрудняет этиологическую верификацию ХГВ, а с другой -способствует развитию окислительного стресса, воспалению, ядерному увеличению числа цирку-

лярно замкнутых вирусных ДНК, развитию мутаций и раковой трансформации гепатоцитов на поздних стадиях ХГВ [9], [10], [11]. Клиническое значение preS/S-мутаций ВГВ остается неясным, в связи с чем данная проблема требует всестороннего изучения.

Целью исследования явилось определение распространенности генотипов ВГВ, циркулирующих в России на территории Санкт-Петербурга (СПб), Ленинградской области (ЛО) и Республики Карелия (РК) в период 2008-2013 годов, выявление мутаций, ответственных за развитие устойчивости к АН, а также preS/S-мутаций, влияющих на синтез HBsAg и течение ХГВ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Особенности клинического течения ХГВ изучены у 67 пациентов с ХГВ. Оценивались печеночные тесты: уровень аланинаминотрансфера-зы (АЛАТ), аспартатаминотрансферазы (АСАТ), альбумина, гамма-глобулинов, IgA, IgM, IgG, щелочной фосфатазы (ЩФ). Определялся индекс гистологической активности (ИГА) по Knodell с оценкой паренхиматозного повреждения (ПП) (1-4 балла), портального воспаления (ПВ) (1-4 балла), перипортальных некрозов (ПН) (1-10 баллов) и фиброз (Ф) по Metavir (0-4 балла).

Роль мутантных форм вируса гепатита В в прогрессирующем течении хронического гепатита В

Протокол исследования выполнялся согласно Хельсинкской декларации, от всех пациентов было получено информированное согласие на исследование. Оценивались t-критерий Стьюдента, тест Манна - Уитни, статистическая обработка данных выполнялась с помощью пакета Statistica 6.

Среди обследованных 579 пациентов хроническим гепатитом ВГВ был выявлен у 323 (55,8 %). У пациентов из СПб и ЛО ВГВ был определен у 256 (50 %) человек, кроме этого были выявлены случаи инфицирования несколькими гепатовирусами: у 21 (4 %) пациента - сочетанное инфицирование ВГВ и вирусом гепатита С, у 5 (1 %) - ВГВ и вирусом гепатита D. Уровень вирусной нагрузки у этих пациентов был преимущественно низкий: менее 104 копий/мл у 161 (62,9 %) больного, 104-106 - у 29 (11,3 %) и лишь у 40 (15,6 %) он составлял более 106 копий/мл. У пациентов из Карелии ВГВ был обнаружен у всех 67 (100 %) пациентов: у 26 - в сыворотке крови и ткани печени, вирусная нарузка у них составила 2,9 ± 0,8*104 копий/мл, у 41 пациента -только в ткани печени.

Генотип ВГВ был определен у 226 (70,0 %) пациентов: у 203 (79,3 %) из СПб и Ло и у 23 (34,3 %) из РК (табл. 1). Наиболее распространенным в СПб и ЛО оказался ВГВ генотипа D (у 163 (80,2 %) больных), для которого характерна более низкая вирусная нагрузка. В Карелии также преобладал ВГВ генотипа D - у 20 (87,0 %) пациентов. В целом доля генотипа D в структуре больных ХГВ составила 81,0 %, доля генотипа А была существенно ниже - 16,4 %.

Распределение генотипов вируса гепатита В среди больных ХГВ в Санкт - Петербурге,

Ленинградской области и Республике Карелия

Генотип / Регион D A A+D ни А, ни D Все- го, чел.

чел. % чел. % чел. % чел. %

Санкт-Петербург и Ленинградская область 163 80,2 35 17,2 5 2,5 0 0 203

Респуб- лика Карелия 20 87,0 2 8,7 1 4,3 0 0 23

Всего 183 81,0 37 16,4 6 2,7 0 0 226

Для определения мутаций устойчивости к АН методом секвенирования по Сенжеру у 49 человек (30 из СПб и ЛО, 19 - из РК) была определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена полимеразы. Полученные последовательности гена и предсказанные последовательности полимеразного и поверхностных белков сравнены с референсными из международной базы данных GenBank.

Мутация устойчивости rtM204I/V (rt - reverse transcriptase) была обнаружена лишь у одного человека. Интересно отметить, что у этого пациента было зарегистрировано изменение аминокислотной последовательности под воздействием терапии ламивудином. В 2006 году ему была проведена трансплантация печени с неверифицированным гепатитом, с 2007 года был выявлен HBsAg, в связи с чем он последовательно получал ламиву-дин и телбивудин. После приема в течение года ламивудина были выявлены замены rtM204I и rtN236K, еще через шесть месяцев лечения ламивудином были обнаружены замены rtM204V, rtL80I, rtL180M, rtA181V и rtN236K, после 14 месяцев лечения телбивудином были определены замены rtM204V, rtV173L, rtL180M, rtA181C. С 2012 года пациент получал 1 мг энтекавира, в результате чего выявлялась волнообразная вире-мия и лишь после добавления тенофовира вирусная нагрузка снизилась до уровня менее 300 копий/ мл. У других 13 пациентов также были выявлены первичные (приводящие к развитию лекарственной устойчивости) и вторичные (компенсаторные) мутации устойчивости к АН и паттерн-мутации устойчивости к противовирусным препаратам (табл. 2). Всего различные мутации в гене полимеразы были выявлены у 14 (28,5 %) пациентов.

Первичные и вторичные мутации гена полимеразы, потенциально ответственные за устойчивость к противовирусным

Аминокислотные замены Санкт- Петер- бург Респуб- лика Каре- лия Устойчи-вость к АН

Читайте также: