Набор для выявления антител к вирусу инфекционного бронхита кур методом ифа
Название (рус.) НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР (ИБК) ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ МЕТОДОМ Состав и форма выпуска В состав набора входят 9 компонентов (К1 - К9). Иммуноспецифические компоненты: К1 - положительная к вирусу ИБК сыворотка крови кур (положительный контроль) цельная лиофилизированная, 1 мл или в нативном виде - 0,2 мл - 1 ампула (флакон); К2 - отрицательная сыворотка крови кур (отрицательный контроль), не содержащая антител к вирусу ИБК, цельная, лиофилизированная, 1,0 мл или в нативном виде - 0,2 мл - 1 ампула (флакон); К3 - очищенный антиген вируса ИБК, адсорбированный в лунках планшета для ИФА - 2 планшета; К4 - антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против lgG кур, сухой в объеме 0,5 мл или в нативном виде - 0,2 мл - 1 ампула, рабочее разведение 1: (указывается для каждой серии). Неспецифические компоненты: К5 - набор солей для приготовления буферного раствора для испытуемых и контрольных проб, антивидового конъюгата и межэтапной промывки: трис (оксиметил) аминометан - 0,97 г (К5.1), трис (оксиметил) аминометан гидрохлорид - 6,61 г (К5.2), натрий хлористый' - 11,7 г (К5.3); К6 - набор солей для приготовлений субстратного буфера: натрий фосфорнокислый двузамещенный - 5,37 г - 1 флакон (К6.1), лимонная кислота - 1,57 г - 1 флакон (К6.2); К7 - детергент твин 20, жидкий - 1 мл - 1 флакон; К8 - субстрат - ортофенилендиамин, 1 таблетка во флаконе; К9 - перекись водорода, гидроперит, таблетка 1 г - 1 шт. в упаковке. Фармакологические свойства Сущность метода заключается в выявлении образовавшегося на поверхности лунок полистиролового планшета комплекса антиген-антитело. Специфический комплекс взаимодействует с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом против lgG кур и вызывает разложение субстрата, окрашивая содержимое лунок планшета. Набор рассчитан на проведение 176 анализов сывороток крови кур при исследовании в одном разведении 1 : 400, при раститровке сывороток от 1 : 100 до 1 : 12800 - на 20 анализов. Показания Для определения специфических антител против вируса инфекционного бронхита кур (ИБК) в сыворотках крови кур иммуноферментным методом (ИФМ). Дозы и способ применения Для исследования в лабораторию доставляют из птицехозяйств сыворотки крови кур от 25 голов (по 0,2 - 0,3 мл). Пробы сывороток хранят в морозильной камере бытового холодильника. Для постановки метода ИФА используют: одно- и восьмиканальные автоматические пипетки постоянного и переменного объема до 0,02 мл и до 0,2 мл со сменными наконечниками, термостат с температурой нагрева (37 + 0,5 °С), бытовой холодильник, рН метр, ридер любой модели для учетов результатов ИФА. Перед приготовлением рабочих растворов набор с компонентами выдерживают 30 минут, при комнатной температуре (20 - 22 °С). Раствор № 1. Содержимое флаконов К5.1, К5.2 и К5.3 растворяют в 1000 мл дистиллированной воды и измеряют показание рН, которое должно быть в пределах 7,4 - 7,6. Затем в этот раствор вносят содержимое флакона К7, получая конечную концентрацию детергента 0,01 %. Данный раствор используют для разведения контрольных сывороток, испытуемых проб, антивидового конъюгата и межэтапной промывки. Раствор № 2. Фосфатно-цитратный буфер рН 4,9 - 5,0. Для приготовления буфера содержимое флакона К6.1 растворяют в 50 мл дистиллированной воды, содержимое флакона К6.2 также в 50 мл дистиллированной воды. Затем смешивают 24,3 мл раствора К6.1 с 25,7 мл раствора К6.2, добавляют 50 мл дистиллированной воды. Полученный раствор должен иметь рН 4,9 - 5,0 при необходимости добавляют кислый (К6.2) или щелочной (К6.1) компоненты. Раствор № 3. Содержимое флакона К1 растворяют в 1,0 мл раствора № 1. Готовят перед использованием. Сыворотка К1 в нативном виде готова для использования по вышеописанному способу. Раствор № 4. Содержимое флакона К2 с отрицательной сывороткой крови кур растворяют в 1 мл раствора № 1. Раствор № 4 готовят перед использованием. Сыворотка К2 в нативном виде готова для использования по вышеописанному методу. Раствор № 5. Содержимое флакона К4 с антивидовым конъюгатом растворяют в 0,5 мл раствора № 1. Для получения рабочего разведения 1: из этого флакона или из нативного препарата конъюгата отбирают мл на 10 мл раствора №1 (на 1 планшет), готовят перед использованием. Раствор № 6. 1 таблетку гидроперита растворяют в 20 мл дистиллированной воды. Раствор № 7. Субстратно-индикаторная смесь. Содержимое флакона К8 (таблетку) растворяют в 20 мл раствора № 2, встряхивают до полного растворения и добавляют на каждые 10 мл этого раствора по 0,4 мл раствора № 6. Готовят раствор № 7 непосредственно перед использованием. В связи с высокой токсичностью ОФД приготовление субстратно-индикаторной смеси проводить в резиновых перчатках, избегая попадания на кожу и слизистые оболочки. Постановка реакции - из комплекта набора берут планшет (К3), в лунках которого адсорбирован очищенный антиген вируса ИБК, и используют для постановки иммуноферментного метода. Разведение сывороток - образцы исследуемых проб сывороток крови разводят 1 : 100 раствором № 1. С этой целью к 0,01 мл сыворотки крови кур добавляют 1 мл раствора № 1 и перемешивают. В лунки рядов планшета В1 - 12. Н1 - 12 вносят по 0,1 мл раствора № 1, а в лунки А2 - 11 вносят по 0,2 мл исследуемых проб сывороток крови, и проводят раститровку по вертикальным рядам, начиная с 1 : 100 до 1 : 12800. В лунки А1 и А12 вносят разведения 1 : 100 контрольных (отрицательной и положительной) сывороток и также проводят раститровку по вертикальным рядам. Из последних лунок Н1 - Н12 удаляют по 0,1 мл. При обнаружении высоких титров антител в испытуемых пробах проводят раститровку по горизонтальным рядам планшета. Планшет осторожно встряхивают, закрывают крышкой и переносят в термостат на 37 °С на 2 часа. Затем лунки планшета освобождают от содержимого путем вытряхивания и трехкратно промывают раствором № 1. Готовят раствор № 5 по вышеописанному способу и вносят во все лунки планшета по 0,1 мл, затем опять помещают в термостат на 1 час и промывают. Готовят раствор № 7 и вносят во все лунки по 0,1 мл. Оставляют при комнатной температуре в темном месте 5 - 10 минут. Останавливают реакцию добавлением в каждую лунку 0,05 мл серной кислоты, приготовленной путем растворения 2 мл концентрированной серной кислоты в 10 мл дистиллированной воды (в наборе отсутствует). Учет результатов анализа проводят после остановки реакции одним из способов: визуально - по интенсивности окрашивания содержимого лунок планшета или инструментально - с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом при длине волны 492 нм. При визуальном способе учета первоначально проводят оценку результатов по контрольным лункам планшета: положительный контроль при раститровке окрашивается в желтый цвет различной интенсивности. В лунках с отрицательным контролем раствор остается неокрашенным или незначительно желтеет. При визуальном учете сравнивают окраску содержимого лунок планшета испытуемых проб с окраской лунок контрольных образцов. За титр испытуемой сыворотки принимают последнее разведение ее, при котором наблюдают видимое глазом цветовое окрашивание, более интенсивное по сравнению с отрицательным контролем. Инструментальный фотометрический учет результатов анализа позволяет количественно оценить титры специфических антител в исследуемых пробах путем измерения значений оптической плотности (ОП 492 нм). Конечным разведением испытуемой сыворотки считается последнее ее разведение, в котором оптическая плотность превышает таковую отрицательного контроля в 2 - 2,1 раза. Расчет титра сывороток при постановке реакции в одном разведении 1 : 400. Выявление специфических антител в сыворотках крови можно проводить и без раститровки испытуемых сывороток. В этом случае во все лунки планшета А2 - 12 . Н2 - 12 вносят по 0,1 мл исследуемых проб сывороток в разведении 1:400 в одной или двух повторностях, используя по 1(2) лунки на каждую пробу. В две лунки В1, С1 вносят положительные, а в две последующие Д1, Е1 - отрицательные контрольные сыворотки в разведении 1 : 400. Лунки F1, G1, H1 служат контролем конъюгата и заполняются по 0,1 мл раствором № 1. Учет результатов реакции проводится спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Для предполагаемого варианта учета различия между средними значениями положительной
и отрицательной контрольных сывороток (PCx - NCx) должно быть более 0,5. Значения оптической плотности для отрицательного контроля должны быть менее или равны 0,150. Наличие или отсутствие антител к вирусу ИБК определяют путем вычисления отношения средней оптической плотности испытуемой сыворотки при длине волны 492 нм к среднему значению оптической плотности (ОП) положительного контроля (S/Р). Положительная контрольная сыворотка стандартизована и имеет определенный титр антител к вирусу ИБК. Если S/Р отношение меньше или равно 0,15, сыворотка будет считаться отрицательной. Если S/Р отношение больше чем 0,15, сыворотка содержит антитела к вирусу ИБК. Конечное значение титра может быть подсчитано по S/Р-отношению при разведении 1 : 400. Расчет титра.
Расчет среднего значения ОП отрицательного контроля (NCx):
(Значение В1 ОП(492) + Значение С1 ОП(492))/2 = NCx
Пример: (0,100 + 0,120)/2 = 0,110 (NCx = 0,110).
Расчет среднего значения ОП положительного контроля (PCx):
(Значение D1 ОП(492) + Значение E1 ОП(492))/2 = PCx
Пример: (0,720 + 0,690)/2 = 0,755 (PCx = 0,755).
Расчет S/Р отношения:
(ОП(492) испытуемой сыворотки - NCx)/(PCx - NCx) = S/P
Пример: Значение образца = 0,480
(0,480 - 0,110)/(0,755 - 0,110) = 0,370/0,645 = 0,574 (Значение S/Р=0,574).
Расчет титра. log10Титр = 1,08(log10S/Р) + 3,92. Пример: S/Р отношение равно 0,574. log10Титр = 1,08(log100,574) + 3,92. log10Титр = 1,08(-0,241)+3,92. log10Титр = 3,660. Титр = 103,660 = 4571. Интерпретация результатов. По результатам ИФА определяют напряженность иммунитета в партии привитых цыплят путем деления количества проб с титром антител 1 : 800 и выше к общему количеству исследованных сывороток и выражают в процентах. Птицу считают иммунной к вирусу инфекционного бронхита при напряженности иммунитета 80 и более процентов (т. е., если в 80 и более процентах проб сывороток крови титр антител достигает значения 1 : 800 и выше). Птицу вакцинируют (ревакцинируют) при напряженности иммунитета менее 80 %. Обнаружение высокого уровня антител (более 1 : 800) свидетельствует о возможной циркуляции в стаде полевого вируса инфекционного бронхита. В таких случаях через 21 - 30 дней проводят повторное исследование проб сывороток крови, полученных от этих же птиц. Нарастание титров и (или) увеличение количества птиц с высоким уровнем антител при наличии клинических и патологоанатомических признаков ИБК является основанием для объявления в хозяйстве неблагополучия по данному заболеванию. Особые указания Ампулы, флаконы без этикеток, с трещинами, с измененной консистенцией подлежат выбраковке и обеззараживанию и утилизации. Условия хранения В защищенном от света месте и температуре от 2 до 8 °С. Срок годности набора - 12 месяцев. Производитель Федеральный центр охраны здоровья животных ФГУ (ВНИИЗЖ ФГУ), Россия
Адрес: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец.
Тел.: (4922) 26-06-14
Тел./факс: (4922) 26-38-77
E-mail: [email protected]
Продавец Место Вашей рекламы
По вопросам размещения информации
о ветеринарных препаратах и кормовых добавках
ИФА диагностические тест-системы Biocheck предназначены для серологического мониторинга распространения возбудителей инфекционных заболеваний птиц в популяции кур, оценки напряженности поствакцинального иммунитета, а также ретроспективной диагностики болезней птиц.
В состав наборов входят иммуноспецифические компоненты :
- положительный контроль – сыворотка крови птиц, содержащая антитела птиц, к соответствующему вирусному антигену (прозрачная жидкость красного цвета);
- отрицательный контроль – сыворотка крови СПФ кур (прозрачная жидкость голубого цвета);
- антивидовой алколинфосфатазный коньюгат против IgG кур (прозрачная жидкость красного цвета);- полистироловые 96-луночные микропанели с сорбированными в лунках с соответствующим вирусным антигеном;
В состав наборов входят химические компоненты :
- таблетки субстрата (нитрофинил фосфат);
- субстратный буфер (бесцветная прозрачная жидкость);
- буфер для разведения испытуемых проб;
- набор фосфатных солей для промывочного буфера (порошок белого цвета);
- стоп-раствор – раствор для остановки реакции;
Каждый набор включает в себя микропанели в количестве 5 шт. и рассчитан на исследовании 460 проб сыворотки крови кур.
| Диагностические наборы на заболевания птиц (Biocheck) | |
| 1 | Диагностический набор Биочек CAV (Анемия — Infectious Anaemia) |
| 2 | Диагностический набор Биочек IBD (Б.Гамборо -Infections Bursal Disease) |
| 3 | Диагностический набор Биочек NDV (Б. Ньюкасла- Newcastle Disease) |
| 4 | Диагностический набор Биочек IBV (Бронхит — Infections Bronchitis Virus) |
| 5 | Диагностический набор Биочек Al Ab (Грипп — Avian Influenza Ab) |
| 6 | Диагностический набор Биочек Al Ag (Грипп — Avian Influenza Ag) |
| 7 | Диагностический набор Биочек ILT (Ларинготрахеит — Infections Laringotracheite Strips) |
| 8 | Диагностический набор Биочек MG (Микоплазмоз — Mycoplasma Gallisepticum) |
| 9 | Диагностический набор Биочек MS (Микоплазмоз синовиа — Mycoplasma Sinoviae) |
| 10 | Диагностический набор Биочек MG/MS (Микоплазмоз галлисептикум/синовиа Mycoplasma Gallisepticum/ Sinoviae) |
| 11 | Диагностический набор Биочек ORT (Орнитобактериоз - Ornithobacterium Rhinotracheale) |
| 12 | Диагностический набор Биочек REO (Реовирус — Reovirus) |
| 13 | Диагностический набор Биочек ART (Ринотрахеит — Avian Rhinotracheitis Stripe) |
| 14 | Диагностический набор Биочек SE (Сальмонеллез — Salmonella Enteritidis) |
| 15 | Диагностический набор Биочек ST (Сальмонеллез — SalmonellaTyphimurium) |
| 16 | Диагностический набор Биочек SE/ST (Сальмонеллез — S. Enteritidis/ S.Typhimurium) |
| 17 | Диагностический набор Биочек АЕ (Энцефаломиелит -Avian Encephalomyelitie Strips) |
| 18 | Диагностический набор Биочек LLAG (Лейкоз птиц — Avian Leucosis Virus) |
| 19 | Диагностический набор Биочек REV (Ретикулоэндотелиоз -Reticuloendotheliosis) |
| 20 | Диагностический набор Биочек EDS (Синдром снижения яйценоскости -Egg Drop Syndrome) |
Промышленное ведение отрасли птицеводства обуславливает жесткий контроль ветеринарно-санитарного состояния птицы. Поэтому для эффективного и точного мониторинга уровня специалистами немецкой фирмы BIOCHEK разработаны ИФА-диагностикумы, которые осуществляют определение наличия вирусов и бактерий в сыворотке птицы, концентрацию антител, определяющую эффективность применения вакцин.
Быстрота, дешевизна и удобство использования иммуноферментного метода заболеваемости особо ценны в условиях крупных промышленных птицеводческих комплексов с высокой концентрацией птицы на производственных площадках.
Теоретическое обоснование применения ИФА
Концентрация иммуноглобулинов класса G характеризует уровень аутоиммунного ответа на различных носителей инфекционных болезней, опасных для человека (зоонозов). Поэтому для отрасли птицеводства тест-наборы biochek ценны ввиду того, что, кроме зоонозных заболеваний, они позволяют осуществлять:
Тест-наборы позволяют полностью провести исследование биологических жидкостей птицы с удобством и без дополнительных затрат ввиду:
Производитель: Россия, ВНИИЗЖ
Заболевание: ИБК (ИФА)
Фасовка: набор, 20-40 проб.
сильные стороны нашей компании
Мы осуществляем доставку заказанных Вами препаратов. Доставка осуществляется рефрежиратором, со строгим соблюдением температурного режима, за счет поставщика.
РЕЗЮМЕ
На основе данных эпизоотического мониторинга распространения вируса инфекционного бронхита кур (ИБК) на территории РФ научно обоснована стратегия выбора компонентного состава ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК и ССЯ-76, содержащей полиштаммную композицию по ком поненту ИБК. Вакцина содержит вирусы ИБК антигенно родственные серотипу Массачусетс, 793/В российскому варианту и предназначена для бустерной вакцинации промышленной и родительской несушки в птицехозяйствах, где циркулируют вариантные штаммы вируса ИБК. При изготовлении вакцины используются эмбрионы от СПФ-кур. Испытания полученной вакцины показали ее высокую иммуногенность и низкую реактогенность, что позволяет обеспечивать длительный и напряженный иммунитет, а также передачу материнских антител потомству.
ВВЕДЕНИЕ
Инфекционный бронхит кур (ИБК) является высококонтагиозным заболеванием, наносящим существенный ущерб промышленному птицеводству. Вирус ИБК поражает верхние дыхательные пути, репродуктивные органы и вызывает нефрозо-нефриты. У взрослых несушек отмечают спад яичной продуктивности, деформацию и обесцвечивание скорлупы, разжижение яичного белка и снижение выводимости [2].
Возбудитель ИБК – коронавирус – чрезвычайно изменчив. Небольшие замены в гене S1 приводят к появлению новых антигенных вариантов вируса [2, 4].
Проведенный в 2003–2004 г.г. на территории РФ мониторинг с помощью ОТ-ПЦР и секвенирования указывает на доминирующее распространение изолятов (около 40%) генотипа Массачусетс. Также довольно часто (5–15%) встречаются изоляты генотипа 793/В, D274, QX, B1648. Кроме того, 27% проб не были отнесены к ранее известным генотипам и составили российскую группу [1]. При дальнейшем мониторинге в 2006 г. был выявлен полевой изолят вируса ИБК, относящийся к генотипу Арканзас [1]. Данное распределение изолятов на территории РФ несколько отличается от распределения на территории ЕС, где доминирует генотип 793/В (33%) , Массачусетс (25%) и Италия-02 (13%) [5].
Рисунок 1 Распределение генотипов вируса ИБК на территории РФ и ЕС в 2006 г.
В дальнейшем возможно изменение картины распределения в связи с глобализацией птицеводства и завозом молодняка птицы из-за рубежа, преимущественно из Европы, а также в результате участившегося использования вакцин на основе серотипа 793/B и D274 импортного производства, которые могут послужить причиной возникновения полевых вирусов ИБК [4].
Как правило, защита птицепоголовья основана на применении живых и инактивированных вакцин против ИБК из штаммов серотипа Массачусетс. Их протективная активность против гомологичных полевых изолятов хорошо изучена, однако они обеспечивают лишь частичную защиту от заражения вариантными вирусами ИБК (70% защиты от вирусов, относящихся к группе QX, 60% – от австралийских вариантов) [3].
Рисунок 2 Эффективность защиты птицы, привитой вакцинами серотипа Массачусетс
В связи с этим перед нами стояла задача создания вакцинного препарата для несушек и родителей не только обеспечивающего защиту от особоопасных (НБ) и распространённых заболеваний (ИБК, ССЯ-76), но и создающего надежную защиту от вирусов ИБК, не принадлежащих к серотипу Массачусетс и составляющих больше половины российских изолятов.
Масляный адъювант: при изготовлении вакцин использован адъювант Montanide ISA 70 VG (SEPPIC, Франция).
Подопытная птица: использовали цыплят кросса Хай-Лайн-98 90-суточного возраста из промышленного птицехозяйства. На птицефабрике птица была трёхкратно привита против ИБК живой вакциной из штамма Н-120 и двукратно против НБ вакциной из шт. Ла-Сота методом выпойки. Образцы испытуемых вакцин вводили в грудную мышцу по 0,5 см3. В опытных и контрольной группах было по 25 голов.
Контроль иммунитета. Антитела к вирусу ИБК определяли методом ИФА на наборах Synbiotics, для определения титров антител к НБ и ССЯ-76 использовали РТГА, которую проводили согласно общепринятой методике.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Средние титры антител по опытным и контрольной группам представлены в табл. 1.
Таблица 1 Формирование иммунного ответа на введение образцов ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК и ССЯ-76
Инструкция
по применению набора для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ-СЕРОТЕСТ" (организация-производитель - ООО "Ветбиохим", г. Москва)
(утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору 21 сентября 2009 г. N ПВР-1-3.8/02157)
1. Общие сведения
1. Набор для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ-СЕРОТЕСТ".
2. В состав набора входят иммуноспецифические и химические компоненты:
1). Планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках вирусом ИРТ - 2 штуки;
2). Положительный контроль ( ), прозрачная жидкость, бесцветная или с желтоватым оттенком, - 1 пробирка;
3). Отрицательный контроль ( ), прозрачная жидкость, бесцветная или с желтоватым оттенком, - 1 пробирка;
4). Антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой хрена - 100-кратный концентрат (Конъюгат), прозрачная жидкость, бесцветная или с желтоватым оттенком, - 1 пробирка;
5). 20-кратный концентрат буферного раствора для промывки планшетов (ФСБТ), бесцветная прозрачная жидкость, - 4 флакона;
6). Сыворотка крови лошади, лиофилизированная (CЛ), гомогенная масса желтоватого цвета, - 1 флакон;
7). Субстратный раствор (СР), бесцветная прозрачная жидкость, - 1 флакон;
8). Стоп-раствор, бесцветная прозрачная жидкость, - 1 флакон.
3. Набор "ИРТ-СЕРОТЕСТ" предназначен для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита (ИРТ) в сыворотке крови крупного рогатого скота (КРС) методом иммуноферментного анализа (ИФА) и определения титра антител.
Набор рассчитан на проведение на одном планшете одновременного анализа 46 испытуемых проб сыворотки крови (в 2-х повторах) и двух контрольных проб (в 2-х повторах). Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких серий анализов по мере поступления биоматериала.
4. Упаковка и маркировка
Компоненты набора расфасовывают в пластиковые (стеклянные), герметично укупоренные флаконы (пробирки) соответствующей вместимости.
Пластиковые флаконы (пробирки) укупоривают завинчивающимися или защелкивающимися пластиковыми крышками. Стеклянные флаконы укупоривают резиновыми пробками, укрепленными алюминиевыми или пластиковыми завинчивающимися колпачками.
На флаконы (пробирки) с каждым компонентом наклеивают этикетки с указанием: названия и/или товарного знака организации-производителя и разработчика, краткого названия набора, краткого названия компонента, его номера, количества в упаковке, номера серии, номера контроля, срока годности (месяц и год).
Полистироловые планшеты упаковывают в индивидуальные полиэтиленовые пакеты. На пакеты наклеивают этикетки с указанием: названия и/или товарного знака организации-производителя и разработчика, краткого названия набора, названия адсорбированного компонента, номера серии и контроля, срока годности.
Флаконы (пробирки) с компонентами набора и планшеты упаковывают в картонные или пластиковые коробки с наличием гнезд.
На каждую коробку с диагностическим набором наклеивают этикетку, в которой указывают: страну, город, название и/или товарный знак организации-производителя и разработчика, полное название набора, номер серии и номер контроля, дату изготовления (месяц и год), срок годности (месяц и год), условия хранения, регистрационный номер, знак соответствия в системе ГОСТ Р, обозначение нормативного документа, надпись "для животных". В каждую коробку вкладывают инструкцию по применению набора.
5. Срок годности компонентов набора - 12 месяцев от даты изготовления при условии хранения и транспортирования их в защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С. Не допускается замораживание компонентов набора! Запрещается смешивать компоненты наборов разных серий, переливать в другую посуду и использовать набор по истечении срока годности.
Флаконы без этикеток, с нарушением целостности, изменением консистенции или цвета компонентов, при наличии плесени или других примесей и не использованные в течение срока годности подлежат выбраковке. Планшеты и контрольные сыворотки обеззараживают 3% раствором хлорамина. Остальные компоненты набора не требуют специальных мер утилизации.
Примечание. Для проведения ИФА используют: одно- и многоканальные микропипетки переменных объемов со сменными наконечниками, мерную лабораторную посуду, дистиллированную или деионизованную воду, суховоздушный термостат с температурой 37°С, спектрофотометр с вертикальным лучом света длиной волны 450 нм, липкую пленку.
II. Принцип метода
6. Метод основан на взаимодействии иммобилизованного в лунках вируса инфекционного ринотрахеита КРС (BHV1) со специфическими антителами из исследуемой пробы сыворотки и последующем выявлении полученного комплекса конъюгатом (меченными пероксидазой хрена специфическими антителами к IgG крупного рогатого скота). Связанная пероксидаза вызывает разложение находящейся в хромоген-субстратном растворе перекиси водорода и окисление хромогена. В лунках развивается окраска, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству антител в определяемой пробе.
III. Порядок применения
7. Подготовка биологического материала
Для анализа используют сыворотку крови крупного рогатого скота. Если анализ проводят в течение 24 ч после отбора, образцы биоматериала хранят при температуре 4°С. При более длительном хранении образцы замораживают при температуре минус 20°С. Перед исследованием замороженные образцы в течение 5-10 мин нагревают в водяной бане при температуре 37°С.
В случае выпадения осадка в пробах сыворотки крови их обязательно осветляют центрифугированием в течение 10 мин при 2000g.
Не рекомендуется исследование проросших и гемолизированных сывороток, а также многократное замораживание и оттаивание образцов сыворотки крови.
8. Подготовка рабочих растворов
8.1. Перед началом работы все реагенты выдерживают не менее 30 мин при комнатной температуре (20-25°С) и тщательно перемешивают. Оставшиеся после частичного использования компоненты должны храниться плотно закрытыми в упаковке производителя.
8.2. Работчий раствор буфера для отмывания планшетов (ФСБТ). Содержимое флакона N 5 разводят в 20 раз свежеприготовленной дистиллированной водой. (Пример: для получения 500 мл рабочего раствора к 25 мл концентрата добавляют 475 мл воды). Следует иметь в виду, что для обработки одного стрипа требуется примерно 30 мл рабочего раствора. Рабочий раствор стабилен при температуре 4°С в течение 3 сут. Для более длительного хранения раствор замораживают и хранят при температуре минус 20°С.
8.3. Буфер для разведения (БР) испытуемых сывороток и контрольных образцов представляет собой рабочий раствор ФСБТ, приготовленный по п. 8.2.
8.4. Буфер для разведения конъюгата (БРК) представляет собой рабочий раствор ФСБТ, содержащий 5% сыворотки крови лошади. БРК готовят в 2 этапа:
1). Во флакон N 6 (СЛ) добавляют 1 мл рабочего раствора ФСБТ и тщательно перемешивают содержимое до полного растворения.
2). Далее готовят необходимое количество БРК. (Пример: для приготовления 10 мл БРК необходимо к 9,5 мл рабочего раствора ФСБT добавить 0,5 мл раствора CЛ).
8.5. Рабочий раствор конъюгата. Концентрат конъюгата (флакон N 4) разводят в 100 раз БРК, подготовленного по п. 8.4. (Пример: для получения 10 мл рабочего раствора конъюгата к 9,9 мл БРК добавить 100 мкл концентрата конъюгата и тщательно перемешать).
8.6. Субстратный раствор (СР, флакон N 8) и стоп-раствор (флакон N 9) - готовы к применению.
9. Проведение анализа
9.1. Испытуемые и контрольные пробы сыворотки крови разводят в 100 раз буфером для разведения (БР, приготовленным по п. 8.3.). (Пример: для получения 300 мкл пробы сыворотки для анализа к 297 мкл БР добавить 3 мкл сыворотки и тщательно перемешать).
9.2. В лунки А1-В1 и C1-D1 вносят по 100 мкл разведенных в 100 раз контрольных проб ( , ).
В остальные лунки планшета вносят по 100 мкл испытуемых проб сыворотки крови (по две лунки на каждый образец).
Закрывают планшет липкой пленкой и инкубируют 45 мин при температуре 37°С.
9.3. Планшет 4 раза промывают рабочим раствором ФСБТ, подготовленным по п. 8.2., на автоматическом промывочном устройстве или вручную, доверху заполняя лунки (300 мкл/лунку) и каждый раз полностью удаляя жидкость постукиванием перевернутого планшета по фильтровальной бумаге.
Внимание. При этой операции возможно выпадение стрипов из рамки! Рекомендуется до начала работы промаркировать стрипы для восстановления их первоначального расположения.
9.4. В каждую лунку вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата (см. п. 8.5.). Планшет закрывают липкой пленкой и инкубируют 45 мин при температуре 37°С.
9.5. Планшет 5 раз промывают рабочим раствором ФСБТ (см. этап 9.3).
9.6. В каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного раствора. Планшет инкубируют 15 мин при комнатной температуре в темноте.
9.7. Останавливают реакцию добавлением в каждую лунку по 100 мкл стоп-раствора.
9.8. После остановки реакции оптическую плотность субстратной смеси измеряют на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм ( ).
10. Учет и интерпретация результатов
10.1. На первом этапе проводят оценку отрицательного и положительного контролей, входящих в состав набора. Результаты реакции считаются достоверными и могут быть учтены, если контрольные показатели соответствуют следующим критериям:
Если полученные значения не соответствуют вышеуказанным критериям, результаты ИФА считаются недостоверными и реакцию повторяют. Если отрицательного и положительного контролей соответствуют вышеуказанным критериям, далее проводят оценку результатов реакции в лунках с испытуемыми образцами.
Вычисляют среднее значение для каждой опытной пробы ( ).
Пробу считают отрицательной, если:
Пробу считают положительной, если:
IV. Меры личной профилактики
11. Работу с компонентами набора следует проводить с соблюдением правил техники безопасности. При попадании их на кожу или слизистые оболочки рекомендуется промыть это место большим количеством водопроводной воды
12. Запрещается прием пищи и воды, курение в помещении, где проводятся работы с компонентами набора.
13. Набор следует хранить в местах, недоступных для детей.
Инструкция разработана ООО "Ветбиохим" совместно с фирмой INGENASA (Испания). Организация-производитель - ООО "Ветбиохим". Адрес производства: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.
С утверждением настоящей инструкции утрачивает силу инструкция по применению набора для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ-СЕРОТЕСТ", утвержденная Россельхознадзором 26.06.2008 г.
Рекомендовано к регистрации в Российской Федерации ФГУ ВГНКИ
Заместитель Руководителя Россельхознадзора
Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Инструкция по применению набора для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ-СЕРОТЕСТ" (организация-производитель - ООО "Ветбиохнм", г. Москва) (утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору от 21 сентября 2009 г. N ПВР-1-3.8/02157)
Текст инструкции официально опубликован не был
Читайте также: