Набор реагентов для амплификации днк вируса гепатита в hbv

по применению наборов реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С (HСV) и ДНК вируса гепатита В (HBV) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.. 3

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ Rotor-Gene 3000 и Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) 4

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРА iCycler iQ5 (Bio-Rad, США) 10

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРА Mx3000P (Stratagene, США) 13

РАСЧЕТ КОНЦЕНТРАЦИИ В ИССЛЕДУЕМЫХ И КОНТРОЛЬНЫХ ОБРАЗЦАХ ПРИ ПОМОЩИ ПРОГРАММЫ AmpliSens Soft Monitor FRT. 19

- Rotor-Gene 3000 (два и более каналов) (Corbett Research, Австралия),

- Rotor-Gene 6000 (пятиканальный, шестиканальный) (Corbett Research, Австралия),

- iCycler iQ (два и более каналов), iQ5 (Bio-Rad, США),

- Mx3000P, Mx3005 (Stratagene, США),

Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции

Канал для флуорофора

Название канала детекции для разных моделей приборов[1])

Канал для флуорофора FAM

Канал для флуорофора JOE

Канал для флуорофора ROX

Канал для флуорофора Cy5

ВНИМАНИЕ! В соответствии с Директивой Европейского Союза 67/548/EEC следующие реагенты подлежат маркировке, как содержащие опасные вещества, а также требуют указания факторов риска (R) и мер предосторожности (S):

Наименование комплекта, в который входит реагент

Наименование опасного (в соответствии с директивой 67/548/EEC) вещества

Код опасности, перечень факторов риска (R) и мер предосторожности (S) в соответствии с директивой 67/548/EEC

по ГН 2.2.5.1313-03[2])

ПДКмакс разовая/ среднесменная (мг/м3)

Автоматический контроль за содержанием вещества в воздухе рабочей зоны

Раствор для отмывки 1

Раствор для отмывки 3

Класс опасности 4

раствор для отмывки 4

Расшифровка обозначений факторов риска (R) и мер предосторожности (S).

R11: легко воспламеняется.

R21/22: не глотать, избегать попадания на кожу.

R20/21/23: опасен при проглатывании, контакте с кожей или вдыхании.

R32: при контакте с кислотой образуются токсический газ.

R36: раздражает слизистую глаз.

R52/53: опасен для водных организмов, может вызывать долговременное нежелательное воздействие на водную среду.

R66: При частых контактах может возникнуть сухость кожи и трещины.

R67: пары вещества могут вызывать сонливость и головокружение.

S2: Держать в недоступном для детей месте.

S7: держать емкость плотно закрытой.

S9: Держать контейнер в хорошо вентилируемом помещении.

S16: держать вдали от источников огня, не курить.

S24/25: избегать контакта с кожей и глазами.

S25: Избегать контакта с глазами.

S26: в случае попадания в глаза, немедленно промыть большим количеством воды и обратиться за медицинской помощью.

S36/37/39: работайте в спецодежде, перчатках и защитной маске.

S37: Использовать подходящие перчатки.

S51: Использовать только в хорошо вентилируемых помещениях.

S60: Данный материал и контейнер, в котором он хранился, должны утилизироваться в соответствии с правилами, предусмотренными для опасных отходов.

S61: избегать попадания в окружающую среду.

ВНИМАНИЕ! При работе с легковоспламеняющимися веществами соблюдать правила пожарной безопасности для учреждений здравоохранения ППБО 07-91 от 30.08.91.

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ Rotor-Gene 3000 и Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия)

Провести этапы пробоподготовки и приготовления реакционных смесей согласно инструкции к набору реагентов. При использовании прибора Rotor-Gene 3000 и Rotor-Gene 6000 рекомендуется использование прозрачных ПЦР-пробирок на 0,2 мл с плоской крышкой (детекция через дно пробирки) или пробирок на 0,1 мл.

Поместить микропробирки в ячейки ротора прибора Rotor-Gene 3000/6000 так, чтобы первая пробирка попала в лунку 1; установить ротор в прибор, закрыть крышку (ячейки ротора пронумерованы, эти номера используются в дальнейшем для программирования положения проб в амплификаторе).

ВНИМАНИЕ! Лунка 1 обязательно должна быть заполнена какой-либо исследуемой пробиркой из текущего эксперимента. Если в один ротор загружаются пробирки с реагентами от разных наборов реагентов, то в первую лунку должна попасть пробирка с наибольшим количеством флуорофоров, например, при одновременной загрузке пробирок с тестами на генотипирование HCV, следует сначала поместить в ротор пробирки с реагентами для генотипирования HCV.

Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и программного обеспечения, указаны в следующем порядке: для англоязычной версии программы Rotor-Gene 3000 / для англоязычной версии программы Rotor-Gene 6000 / для русскоязычной версии программы Rotor-Gene 6000.

1. Нажать кнопку New/Новый в основном меню программы.

2. В открывшемся окне выбрать шаблон запуска эксперимента Advanced/Детальный мастер и выделить Dual Labeled Probe/Hydrolysis probes/Флуоресцентные зонды (TaqMan). Нажать кнопку New/Новый.

3. В открывшемся окне выбрать ротор на 36 лунок 36-Well Rotor/36-луночный ротор (или на 72 лунки 72-Well Rotor/72-луночный ротор), и отметить, что вы не используете пробирки с круглыми крышками (Rotor-Gene 3000)/одето фиксирующее кольцо (Rotor-Gene 6000). Нажать кнопку Next/Далее.

4. В открывшемся окне задать оператора и выбрать объем реакционной смеси: Reaction volume/Объем реакции – 50 мкл. Нажать кнопку Next/Далее.

5. В открывшемся окне необходимо задать температурный профиль эксперимента. Для этого нажать кнопку Edit profile/Редактор профиля и задать следующие параметры (см. табл. 1):

Новый набор реагентов для выявления ДНК вируса герпеса человека 8 типа методом ПЦР в режиме реального времени РеалБест ДНК ВГЧ-8 more

Получена СЕ марка на ПЦР-наборы для диагностики ИППП, респираторных инфекций, кандидоза, ВПЧ-инфекции. more

ID] => 2409 [TIMESTAMP_X] => 18.06.2019 09:49:15 [

TIMESTAMP_X] => 18.06.2019 09:49:15 [MODIFIED_BY] => 9321 [

MODIFIED_BY] => 9321 [DATE_CREATE] => 18.06.2019 09:49:15 [

DATE_CREATE] => 18.06.2019 09:49:15 [CREATED_BY] => 9321 [

CREATED_BY] => 9321 [IBLOCK_ID] => 17 [

IBLOCK_ID] => 17 [IBLOCK_SECTION_ID] => 2407 [

IBLOCK_SECTION_ID] => 2407 [ACTIVE] => Y [

ACTIVE] => Y [GLOBAL_ACTIVE] => Y [

GLOBAL_ACTIVE] => Y [SORT] => 9400 [

SORT] => 9400 [NAME] => Вирус гепатита В [

NAME] => Вирус гепатита В [PICTURE] => [

PICTURE] => [LEFT_MARGIN] => 207 [

LEFT_MARGIN] => 207 [RIGHT_MARGIN] => 208 [

RIGHT_MARGIN] => 208 [DEPTH_LEVEL] => 3 [

DEPTH_LEVEL] => 3 [DESCRIPTION] => [

DESCRIPTION] => [DESCRIPTION_TYPE] => text [

DESCRIPTION_TYPE] => text [SEARCHABLE_CONTENT] => ВИРУС ГЕПАТИТА В [

SEARCHABLE_CONTENT] => ВИРУС ГЕПАТИТА В [CODE] => [

SOCNET_GROUP_ID] => [LIST_PAGE_URL] => /prod/index.php [

LIST_PAGE_URL] => /prod/index.php [SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2409 [

SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2409 [IBLOCK_TYPE_ID] => products [

IBLOCK_TYPE_ID] => products [IBLOCK_CODE] => catalog [

IBLOCK_CODE] => catalog [IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [

EXTERNAL_ID] => [IPROPERTY_VALUES] => Array ( ) [PATH] => Array ( [0] => Array ( [ID] => 2403 [

ID] => 2403 [CODE] => root_pcr [

CODE] => root_pcr [XML_ID] => [

EXTERNAL_ID] => [IBLOCK_ID] => 17 [

IBLOCK_ID] => 17 [IBLOCK_SECTION_ID] => [

IBLOCK_SECTION_ID] => [SORT] => 8800 [

SORT] => 8800 [NAME] => ПЦР диагностика [

NAME] => ПЦР диагностика [ACTIVE] => Y [

ACTIVE] => Y [DEPTH_LEVEL] => 1 [

DEPTH_LEVEL] => 1 [SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2403 [

SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2403 [IBLOCK_TYPE_ID] => products [

IBLOCK_TYPE_ID] => products [IBLOCK_CODE] => catalog [

IBLOCK_CODE] => catalog [IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [

IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [GLOBAL_ACTIVE] => Y [

GLOBAL_ACTIVE] => Y [IPROPERTY_VALUES] => Array ( ) ) [1] => Array ( [ID] => 2407 [

EXTERNAL_ID] => [IBLOCK_ID] => 17 [

IBLOCK_ID] => 17 [IBLOCK_SECTION_ID] => 2403 [

IBLOCK_SECTION_ID] => 2403 [SORT] => 9200 [

SORT] => 9200 [NAME] => Вирусные гепатиты [

NAME] => Вирусные гепатиты [ACTIVE] => Y [

ACTIVE] => Y [DEPTH_LEVEL] => 2 [

DEPTH_LEVEL] => 2 [SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2407 [

SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2407 [IBLOCK_TYPE_ID] => products [

IBLOCK_TYPE_ID] => products [IBLOCK_CODE] => catalog [

IBLOCK_CODE] => catalog [IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [

IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [GLOBAL_ACTIVE] => Y [

GLOBAL_ACTIVE] => Y [IPROPERTY_VALUES] => Array ( ) ) [2] => Array ( [ID] => 2409 [

EXTERNAL_ID] => [IBLOCK_ID] => 17 [

IBLOCK_ID] => 17 [IBLOCK_SECTION_ID] => 2407 [

IBLOCK_SECTION_ID] => 2407 [SORT] => 9400 [

SORT] => 9400 [NAME] => Вирус гепатита В [

NAME] => Вирус гепатита В [ACTIVE] => Y [

ACTIVE] => Y [DEPTH_LEVEL] => 3 [

DEPTH_LEVEL] => 3 [SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2409 [

SECTION_PAGE_URL] => /prod/index.php?SECTION_ID=2409 [IBLOCK_TYPE_ID] => products [

IBLOCK_TYPE_ID] => products [IBLOCK_CODE] => catalog [

IBLOCK_CODE] => catalog [IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [

IBLOCK_EXTERNAL_ID] => [GLOBAL_ACTIVE] => Y [

GLOBAL_ACTIVE] => Y [IPROPERTY_VALUES] => Array ( ) ) ) ) [SECTIONS_COUNT] => 0 )

РеалБест ДНК ВГВ (форма 2)

Набор реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Форма 1 набора включает комплект реагентов для выделения ДНКФорма 2 набора не содержит реагентов для выделения ДНК .

Чувствительность: 5 МЕ/мл

РеалБест ДНК ВГВ количественный

Набор реагентов для выявления и количественного определения ДНК вируса гепатита В методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Набор содержит реагенты для выделения ДНК.

Чувствительность: 5 МЕ/мл

РеалБест ВГВ ПЦР (вариант 1/количественный)

РеалБест ВГВ ПЦР (вариант 2)

Набор реагентов для выявления и количественного определения ДНК вируса гепатита В методом ПЦР в режиме реального времени. Не содержит реагентов для выделения ДНК.

Изобретение относится к медицине, в частности к проблеме изучения инфекционных вирусных заболеваний, и касается поиска новых направлений в специфической диагностике хронического вирусного гепатита В.

Клинические проявления хронического вирусного гепатита В многообразны и зависят, в основном, от биологических свойств вируса и его взаимодействия с иммунной системой хозяина. Вирус гепатита В характеризуется высокой степенью генетической гетерогенности в связи с использованием обратной транскриптазы в процессе репликации вируса. Определение генотипов и субтипов вируса гепатита В важно для лучшего понимания эпидемиологических и вирусологических особенностей заболевания, а также предоставляет дополнительную информацию для принятия решения о выборе тактики противовирусной терапии. Одной из форм естественного течения хронического вирусного гепатита В является оккультный гепатит В, характеризующийся сохранением ДНК вируса гепатита B в печени и, в значительно более низкой, часто не идентифицируемой, концентрации в периферической крови пациентов с негативным HBsAg. Более 20% больных серонегативны по всем маркерам вируса гепатита В [Torbenson М., Thomas D.L. Occult hepatitis В // Lancet Infect. Dis. 2002. vol. 2. P. 479-486]. При этом оккультный ВГВ может играть существенную роль в развитии фиброза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [Raimondo G., Pollicino Т., Cacciola I. et al. Occult hepatitis В virus infection // J. Hepatol. 2007. vol. 46. P. 160-170].

Глубокое типирование, позволяющее выявлять субтипы вируса, важно для лучшего понимания эпидемиологических и вирусологических особенностей заболевания, что обретает большую значимость в связи с общемировой тенденцией к смещению за счет миграционной активности распространенности тех или иных генотипов и субтипов ВГВ в различных регионах и выявлению редких субтипов в нехарактерных для них географических ареалах [Raimondo G., Pollicino Т., Cacciola I. et al. Occult hepatitis В virus infection // J. Hepatol. 2007. vol. 46. P. 160-170]. Глубокое типирование также предоставляет дополнительную информацию для принятия решения о выборе тактики противовирусной терапии, так как, например, для ВГВ субтипа D1 показана высокая частота мутаций в промоторе гена Core, ассоциированных с развитием гепатоцеллюлярной карциномы, а также значительно более высокая, чем при ВГВ субтипа D2, частота двойной мутации, приводящей к уменьшению или предотвращению синтеза HBeAg, в то время как субтип А2 редко ассоциируется с HBeAg(-) заболеванием или раком печени [Bissinger A.L., Fehrle С, Werner C.R., Lauer U.M., Malek N.P., Berg CP. Epidemiology and Genotyping of Patients with Chronic Hepatitis B: Genotype Shifting Observed in Patients from Central Europe // Pol J Microbiol. - 2015 - 64(1): 15-21; Khan, A. Novel point mutations and mutational complexes in the enhancer II, core promoter and precore regions of hepatitis В virus genotype D1 associated with hepatocellular carcinoma in Saudi Arabia / Khan A., Al Balwi M.A., Tanaka Y., Hajeer A., Sanai P.M., Al Abdulkarim I., Al Ayyar L., Badri M., Saudi D., Tamimi W., Mizokami M., Al Knawy B. // Int. J. Cancer. - 2013. - vol. 133 (12). P. 2864-2871).

Субтипы Al, С, B2-B5 и H связаны с более серьезными осложнениями, чем субтипы А2, В1 и В6 [Khan, A. Novel point mutations and mutational complexes in the enhancer II, core promoter and precore regions of hepatitis В virus genotype D1 associated with hepatocellular carcinoma in Saudi Arabia / Khan A., Al Balwi M.A., Tanaka Y., Hajeer A., Sanai P.M., Al Abdulkarim I., Al Ayyar L., Badri M., Saudi D., Tamimi W., Mizokami M., Al Knawy B. // Int. J. Cancer. - 2013. - vol. 133 (12). P. 2864-2871].

В то время как прямое секвенирование нуклеотидной последовательности является золотым стандартом для классификации генотипов и субгенотипов вируса гепатита В [Banerjee, P.A Rare HBV Subgenotype D4 with Unique Genomic Signatures Identified in North-Eastem India - An Emerging Clinical Challenge? / Banerjee P., Mondal R.K., Nandi M., Ghosh S., Khatun M., Chakraborty N., Bhattacharya S., RoyChoudhury A., Banerjee S., Santra A., Sil S., Chowdhury A., Bhaumik P., Datta S. // PLoS One. -2014. - vol. 9 (10). e109425], используемые для выявления вируса гепатита В методики на основе технологии ПЦР недостаточно чувствительны для выявления вируса гепатита В низких концентраций при малых объемах клинического материала и/или основаны на выявлении коротких консервативных фрагментов нуклеотидных последовательностей, что не позволяет осуществлять глубокое типирование вируса.

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению и выбранным за прототип является метод, предложенный в работе зарубежных коллег, посвященной передаче ВГВ от матери ребенку [Candotti D., Danso K., Allain J-P. Matemofetal transmission of hepatitis В vims genotype E in Ghana, west Africa // J. Gen. Virol. - 2007. - vol. 88. - P. 2686-2695, doi: 10.1099/vir.0.83102-0]. Метод заключается в гнездовой ПЦР с последовательным использованием двух пар праймеров: на первом этапе прямой праймер 5'-ACATACTCTTTGGAAGGCKG-3' и обратный праймер 5'-CGTCAGCAAACACTTGGC-3', на втором этапе прямой праймер 5'-GCCTCATTTTGYGGGTCA-3' и обратный праймер 5'-AGCAAARCCCAAAAGACC-3'. При этом ПЦР для каждого раунда проводили в конечном объеме 50 мкл с 2,25 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из дНТФ, 1 мкМ каждого праймера, 1X ПЦР-буфера II, 1 ед. полимеразы AmpliTaq (Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom), ДНК-матрицы 10 мкл. при следующих условиях: тридцать пять циклов, включающих денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 48°С в течение 30 секунд и элонгацию при 72°С в течение 30 секунд. Чувствительность предложенного метода достигала 10 МЕ/мл. Недостаток метода заключается в необходимости большого объема плазмы крови для экстракции ДНК (500 мкл), а также в невозможности убедиться в полноценности генома вируса за счет секвенирования как минимум двух из четырех участков генома ВГВ, как это было рекомендовано на совещании по оккультному ВГВ [Statements from the Taormina expert meeting on occult hepatitis В virus infection. // Journal of Hepatology. - 2008. - vol. 49. №4. - Р. 652-657].

Технический результат - повышение специфичности, чувствительности и возможности дифференцировать изоляты вируса гепатита В с высокой идентичностью нуклеотидных последовательностей.

Сущность метода заключается в том, что на первом этапе проводится амплификация ДНК методом асимметричной полимеразной цепной реакции с использованием протяженных олигонуклеотидных праймеров с разной температурой плавления, комплементарных области наибольшего сходства геномов различных изолятов вируса гепатита В. Для повышения чувствительности проводится вторая полимеразная цепная реакция с использованием продукта амплификации первой реакции и внутренних (вложенных, гнездовых) праймеров, некоторые из которых были предложены на совещании по оккультному вирусному гепатиту В [Candotti D., Danso K., Allain J-P. Matemofetal transmission of hepatitis В virus genotype E in Ghana, west Africa // J. Gen. Virol. - 2007. - vol. 88. - P. 2686-2695, doi: 10.1099/vir.0.83102-0]. При этом состав реакционного буфера изменяется на разных этапах.

На первом этапе используются протяженные олигонуклеотидные праймеры:

Прямой праймер 5'-CTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3'

Обратный праймер 5'-CAGACCAATTTATGCCTACAGCCTCCTA-3'

Состав амплификационной смеси на первом этапе:

3 пмоль/л прямого праймера, 30 пмоль/л обратного праймера, по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата, 7,5 ммоль/л MgCl₂, 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas), буфер для Taq ДНК-полимеразы (750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), формамид 4% от конечного объема, глицерин 6% от конечного объема, 10 мкл раствора ДНК, вода без нуклеаз до конечного объема 30 мкл.

ПЦР проводят при следующих условиях:

после денатурации при 95°C в течение 5 минут устанавливали 35 циклов амплификации в режиме: 95°C - 30 сек, 68°C - 5 мин; затем финальная элонгация при 72°C - 5 мин.

На втором этапе используют одну из пар праймеров:

Прямой праймер 5'-GGTCACCATATTCTTGGGAA-3'

Обратный праймер 5'-AATGGCACTAGTAAACTGAG-3'

Прямой праймер 5'-GCCTTAGAGTCTCCTGAGCA-3'

Обратный праймер 5'-GAGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3'

Прямой праймер 5'-CCATACTGCGGAACTCCTAGC-3'

Обратный праймер 5'-CCCAAGGCACAGCTTGGAGG-3'

Прямой праймер 5'-TCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTC-3'

Обратный праймер 5'-AGTTCCGCAGTATGGATCGG-3'

Состав амплификационной смеси на втором этапе:

15 пмоль/л каждого праймера, по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата, 6,7 ммоль/л MgCl₂, 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas), буфер для Taq ДНК-полимеразы (750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), DMSO 10% от конечного объема, формамид 4% от конечного объема, 10 мкл продукта амплификации первого этапа, вода без нуклеаз до конечного объема 30 мкл.

ПЦР проводят при следующих условиях:

после денатурации при 95°C в течение 5 минут устанавливали 35 циклов амплификации в режиме: 95°C - 30 сек, 52°C - 30 сек, 72°C - 1 мин 30 сек; затем финальная элонгация при 72°C - 5 мин.

Таким образом, предложенный метод отличается от прототипа тем, что на первом этапе используется асимметричная ПЦР с протяженными праймерами (прямой праймер 5'-ctgcgcaccagcaccatgcaactttttcacctctgc-3', обратный праймер 5'-cagaccaatttatgcctacagcctccta-3'), на втором этапе используются праймеры к одному из четырех регионов геном ВГВ, при этом в составе амплификационной смеси на каждом этапе неравномерное соотношение дезоксинуклеозидтрифосфатов и высокая концентрация MgCl₂, на первом этапе в смеси присутствуют формамид и глицерин в количестве 4% и 6% от конечного объема соответственно, а на втором этапе формамид и DMSO в количестве 4% и 10% от конечного объема соответственно.

Аналитическую чувствительность метода проверяли методом поэтапного разведения.

Каждый образец поэтапно разводили предварительно проанализированной плазмой крови без ВГВ (чистой плазмой) следующим образом. Аликвоту образца объемом 100 мкл вносили в микропробирку Eppendorf объемом 1,5 мл, добавляли 100 мкл чистой плазмы, тщательно пипетировали и переносили 100 мкл полученного пула в новую микропробирку, куда снова добавляли 100 мкл чистой плазмы, пипетировали и 100 мкл нового пула переносили в третью пробирку и т.д. до десятикратного последовательного разведения (таб. 1).

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлен электрофорез продуктов амплификации второго этапа (праймеры 5'-GGTCACCATATTCTTGGGAA-3', 5'-AATGGCACTAGTAAACTGAG-3') последовательных разведений образца №9, вирусная нагрузка 5*10 3 МЕ/мл. Продукт амплификации последнего разведения (предположительно около 9,7 МЕ/мл) виден очень слабо. На фиг. 2 представлен Черно-белый негатив фотографии 1. Продукт амплификации последнего разведения (предположительно около 9,7 МЕ/мл) обозначен овалом.

Ниже приведены примеры конкретного использования предложенного метода.

Больные с различной степенью выраженности фиброза печени и циррозом: 11 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С, 5 пациентов с гепатитом неясной этиологии. Все пациенты серонегативны к вирусу гепатита В. При использовании стандартных наборов ДНК вируса гепатита В не была выявлена в плазме крови. При использовании нашего метода ДНК вируса гепатита В в плазме крови была выявлена у 6 пациентов с ХВГС и у всех пациентов с криптогенным гепатитом. Полученные результаты были подтверждены при получении биопсийного материала печени.

Больная с клинической картиной острого гепатита, начавшейся после пребывания в стационаре по причине, не связанной с заболеваниями печени. Высказаны подозрения об инфицировании пациентки в клинике. ДНК вируса гепатита В стандартными методами не выявлен. При использовании нашего метода ДНК вируса гепатита В в плазме крови выявлен, осуществлено секвенирование региона Pre-S1/Pre-S2/S, проведен филогенетический анализ для сравнения с вирусом гепатита В, выявленным у пациентов стационара (предположительный источник инфекции). Показаны значимые отличия изолятов. Высказано предположение об активации репликации оккультного вируса гепатита В на фоне иммуносупресси.

Больной из Центральной Африки спустя несколько месяцев после пребывания в РФ поступил в госпиталь с симптомами острого гепатита в тяжелой форме. При использовании стандартных методов был выявлен вирус гепатита В, генотипировать вирус не удалось. При использовании нашего метода в плазме крови больного были выявлены и типированы два изолята вируса гепатита В: субтипа D2 и субтипа А1, не характерного для РФ. Предположительно невозможность типирования стандартным методом с использованием коммерческого набора объясняется множественными мутациями вируса. Высказано предположение об активации репликации оккультного вируса гепатита В субтипа А1 на фоне подавления иммунитета при инфицировании вирусом гепатита В субтипа D2.

Представлены 155 клинических образцов из Республики Гвинея, в том числе 130 образцов сыворотки крови в объеме, не превышающем 80 мкл, а также 25 клинических образцов посмертных ротоглоточных соскобов. ДНК Вируса гепатита В не удалось выявить при использовании стандартных методов. При использовании предлагаемого нами способа выявлена ДНК вируса гепатита В в 19 образцах, полученных из сыворотки крови, а также в 13 образцах, полученных из ротоглоточных соскобов, при этом ДНК вируса гепатита В выявлена как в HBsAg (+) образцах, так и в HBsAg (-) образцах. Проведено секвенирование региона Pre-S1/Pre-S2/S. Представлены субтипы ВГВ: А2, A3, D1, D2, D3, Е. Таким образом, подтверждается возможность использования предлагаемого способа для выявления в малых объемах клинических образцов вируса гепатита В разных генотипов и субтипов, включая генотипы и субтипы не характерные для РФ.

Также в течение 2015-2016 года было проведено более 800 исследований предложенным методом на основе технологии ПЦР. Выявлен высокий процент встречаемости оккультного гепатита В среди доноров в географических регионах с высокой распространенностью вирусных гепатитов. Показана широкая распространенность оккультного вируса гепатита В у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Способ выявления ДНК вируса гепатита B в биологическом материале на основе двухэтапной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием амплифицированных фрагментов четырех регионов вируса, отличающийся тем, что на первом этапе применяется асимметричная ПЦР с протяженными олигонуклеотидными праймерами, а именно прямой праймер 5'-CTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3' и обратный праймер 5'-CAGACCAATTTATGCCTACAGCCTCCTA-3', продукты которой затем используют для второго этапа амплификации с одной из следующих пар вложенных праймеров: пара 1 прямой праймер 5'-GGTCACCATATTCTTGGGAA-3' обратный праймер 5'-AATGGCACTAGTAAACTGAG-3' или пара 2 прямой праймер 5'-GCCTTAGAGTCTCCTGAGCA-3' обратный праймер 5'-GAGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3', или пара 3 прямой праймер 5'-CCATACTGCGGAACTCCTAGC-3' обратный праймер 5'-CCCAAGGCACAGCTTGGAGG-3', или пара 4 прямой праймер 5'-TCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTC-3' обратный праймер 5'-AGTTCCGCAGTATGGATCGG-3', причем амплификационная смесь для первого этапа содержит: 0,3 мкл прямого праймера (конц. 10 пмоль/л), 3 мкл обратного праймера (концентрация 10 пмоль/л), 2,5 мкл смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (где содержится по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата), 6 мкл MgCl (25 мМ), 2,5 мкл буфера для Taq ДНК-полимеразы (включает 750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), 1,2 мкл формамида, 1,8 мкл глицерина, 0,5 мкл рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas, 1 ед.), 10 мкл раствора ДНК, 2,2 мкл вода без нуклеаз, общий объем смеси 30 мкл. амплификационная смесь для второго этапа содержит: по 1,5 мкл прямого и обратного праймеров (концентрация 10 пмоль/л), 2,5 мкл смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов, (содержащей по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата), 5 мкл MgCl (25 мМ), 2,5 мкл буфера для Taq ДНК-полимеразы (включает 750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), 1,2 мкл формамида, 3 мкл DMSO, 0,5 мкл рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas, 1 ед.), 10 мкл продукта амплификации первого этапа, 2,3 мкл вода без нуклеаз, общий объем смеси 30 мкл.

по применению набора реагентов

для выявления и дифференциации генотипов A, B, C и D

вируса гепатита B (HBV) в клиническом материале

методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с

Федеральное бюджетное учреждение науки

Российская Федерация, 111123,

город Москва, улица Новогиреевская, дом 3а

ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА. 8

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО

А. Подготовка пробирок для амплификации

СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ

СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ

Формат FRT Форма 2: REF R-V5-G-F / VER 15.11.12 / стр. 2 из 19

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:

(производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора), использующих гибридизационно-флуоресцентную детекцию.

ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной диагностике заболевания1.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Определение генотипов А, В, С и D HBV проводится в одной пробирке. Набор В соответствии с Директивой Европейского Союза 98/79/EC.

ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ

Набор реагентов выпускается в 1 формате.

Набор реагентов выпускается в 3 формах комплектации:

вариант FRT-50 F.

Форма 3 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным реагентам, с маркировкой реагентов на их оптовой фасовке.

Форма комплектации 3 предназначена для производственных целей для последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам.

ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 3 используется только в соответствии с регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

Аналитическая специфичность Оценка аналитической специфичности набора реагентов показала отсутствие перекрестных реакций между генотипами A, B, C, D, E, F, G и H вируса гепатита В при использовании высококонцентрированных рекомбинантных положительных контрольных образцов и образцов плазмы крови соответствующих генотипов HВV.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

При работе всегда выполнять следующие требования:

Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Экстракции, продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы, оборудование и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия Формат FRT Форма 2: REF R-V5-G-F / VER 15.11.12 / стр. 5 из 19 процесса.

ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов.

Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических дозаторов с фильтром. Одноразовую пластиковую посуду необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для обеззараживания медицинских отходов.

Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо подвергать ультрафиолетовому облучению в течение 30 мин.

Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции.

Допускать к работе с набором только специально обученный персонал.

Не использовать набор по истечении срока годности.

Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во время работы с образцами и реактивами. Тщательно вымыть руки по окончании работы.

Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за медицинской помощью.

Листы безопасности материалов (MSDS – material safety data sheet) доступны по запросу.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

ЗОНА 1. Экстракция ДНК из клинического материала

8. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл (например, Axygen, США).

9. Одноразовые наконечники с фильтром до 200 мкл и до 1000 мкл в штативах (например, Axygen, США).

10. Одноразовые наконечники до 200 мкл (например, Axygen, США).

11. Штативы для пробирок объемом 1,5 мл (например, Axygen, США).

12. Холодильник от 2 до 8 °С.

13. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.

14. Емкость для сброса наконечников.

4. Одноразовые наконечники с фильтром до 100 мкл, до 200 мкл в штативах (например, Axygen, США).

6. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С для выделенных проб ДНК.

7. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.

8. Емкость для сброса наконечников.

Формат FRT Форма 2: REF R-V5-G-F / VER 15.11.12 / стр. 7 из 19

10. Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл или 0,1 мл:

а) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с круглой (например, Axygen, США) или плоской оптически прозрачной крышкой – при использовании прибора планшетного типа;

б) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой (например, Axygen, США) или пробирки для ПЦР к Rotor-Gene, объемом 0,1 мл в стрипах по 4 шт. с крышками (например, Corbett Research, Австралия;

QIAGEN, Германия) – при использовании прибора роторного типа.

ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

Материалом для исследования служит плазма периферической крови. Для получения плазмы кровь отбирают в пробирку с 3 % раствором ЭДТА из расчета 20:1 (20 частей крови на 1 часть ЭДТА). Закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают. В течение 6 ч с момента взятия крови следует отобрать плазму и перенести в новую пробирку. Для этого пробирку с кровью центрифугируют 20 мин при 800-1600 g, после чего отбирают плазму и переносят в отдельную одноразовую пробирку. Хранить плазму можно не более 3 дней при температуре от 2 до 8 °С и длительно при температуре не выше минус 68 °С.

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ

ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:

Экстракция ДНК из исследуемых образцов.

Анализ и интерпретация результатов.

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ

В качестве отрицательного контроля экстракции (В–) используется реагент ОКО.

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО

Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами.

А. Подготовка пробирок для амплификации Общий объем реакционной смеси – 25 мкл, включая объем пробы ДНК –

4. Тщательно перемешать полученную реакционную смесь на вортексе и осадить капли кратковременным центрифугированием с помощью центрифуги/вортекса..

5. Внести в каждую пробирку, предназначенную для проведения амплификации, по 15 мкл подготовленной смеси.

6. В подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб ДНК, полученных в Число клинических образцов + 1 контроль этапа экстракции ДНК + 3 контроля ПЦР (N+4, N – количество клинических образцов).

Объемы вносимых реагентов приведены с запасом на 1 образец.

Формат FRT Форма 2: REF R-V5-G-F / VER 15.11.12 / стр. 11 из 19ФОРМАТ FRT

результате экстракции из клинических образцов.

7. Поставить контрольные реакции:

а) отрицательный контроль экстракции (В–) – внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из ОКО.

б) отрицательный контроль ПЦР (К–) – внести в пробирку 10 мкл TE-буфера.

в) положительный контроль ПЦР (К+B/A) – внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК HBV генотипы B/A;

г) положительный контроль ПЦР (К+C/D) – внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК HBV генотипы С/D.

Например, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия), Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия) и рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в методических рекомендациях по применению данного набора реагентов.

Названия каналов детекции для соответствующего прибора см. в методических рекомендациях к набору реагентов.

Формат FRT Форма 2: REF R-V5-G-F / VER 15.11.12 / стр. 12 из 19 ФОРМАТ FRT

3. Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала.

4. По окончании выполнения программы приступить к анализу и интерпретации результатов.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы ДНК значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов.

Результат амплификации по каналу считается положительным, если кривая флуоресценции однократно пересекается с пороговой линией в области достоверного прироста флуоресценции, отрицательным в случае отсутствия пересечения с пороговой линией (нет значения Ct или Cp) и сомнительным во всех других случаях.

Учет результатов в контрольных образцах Результаты ПЦР-исследования считаются достоверными, если получены правильные результаты для положительных и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК в соответствии с табл. 5.

Учет результатов в исследуемых клинических образцах

5. Если в таблице результатов для пробы определены два и более значения Ct, то выдается двойной, тройной и т. д. генотип.

1. Если значение Ct хотя бы в одной пробе с положительным контролем этапа ПЦР (К+B/A или К+C/D) превышает указанное во вкладыше граничное значение или отсутствует, необходимо повторить ПЦР-исследование для всех отрицательных образцов, начиная с этапа ПЦР.

2. Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (В–) и/или отрицательного контроля ПЦР (К–) по любому из используемых каналов детектируется положительный сигнал, необходимо повторить ПЦР-исследование для всех положительных образцов, начиная с этапа ПЦР.

Формат FRT Форма 2: REF R-V5-G-F / VER 15.11.12 / стр. 15 из 19

СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ

Срок годности. 12 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности, указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано иное.

Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до 8 С не более 5 сут. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.

Условия отпуска. Для лечебно-профилактических и санитарно-профилактических учреждений.

направлять на предприятие-изготовитель ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (111123 г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а) в отдел по работе с рекламациями и организации обучения (тел. (495) 974-96-46, факс (495) 916-18-18, email: [email protected])8.

Формат FRT Форма 2: REF R-V5-G-F / VER 15.11.12 / стр. 16 из 19

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК

1. Раствор для лизиса (если он хранился при температуре от 2 до 8 С) прогреть при температуре до 65 °С до полного растворения кристаллов.

2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл (включая отрицательный контроль экстракции).

3. В пробирки внести по 300 мкл раствора для лизиса. Промаркировать пробирки.

4. В пробирки с раствором для лизиса внести по 100 мкл пробы, используя наконечники с фильтром. В пробирку отрицательного контроля экстракции (В–) внести 100 мкл ОКО.

5. Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе, процентрифугировать в течение 5 с на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней поверхности крышки и прогреть 5 мин при 65 С в термостате.

6. Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, тщательно перемешать на вортексе.

7. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге при 12 тыс g (например, 13 400 об/мин для центрифуги MiniSpin, Eppendorf) в течение 5 мин.

8. Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

9. Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть крышки, осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Можно провести процедуру одновременно для всех пробирок, для этого необходимо накрыть пробирки в штативе сверху крышкой или другим штативом, прижать их и переворачивать штатив.

10. Центрифугировать при 12 тыс g в течение 1-2 мин на микроцентрифуге.

11. Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

12. Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть крышки и осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Можно провести процедуру одновременно для всех пробирок, для этого необходимо накрыть пробирки в штативе сверху крышкой или другим штативом, прижать

Формат FRT Форма 2: REF R-V5-G-F / VER 15.11.12 / стр. 17 из 19ЭКСТРАКЦИЯ ДНК

их и переворачивать штатив.

13. Центрифугировать при 12 тыс g в течение 2 мин на микроцентрифуге.

14. Осторожно, не захватывая осадок, тщательно отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

15. Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5 мин для подсушивания осадка (при этом крышки пробирок должны быть открыты).

16. Добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешать на вортексе.

Поместить в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.

17. Центрифугировать пробирки при 12 тыс g в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

ВНИМАНИЕ! Очищенная ДНК может храниться до 24 ч при температуре от 2 до 8 °С и до года при температуре не выше минус 16 °С.

Читайте также:

• Вирус злокачественной катаральной крупного рогатого скота
• Почему не сделали прививку от гепатита в месяц
• Цитомегаловирус после трансплантации почки
• Противовирусный препарат трекрезан отзывы
• Препарат для инъекций от бешенства

№ по каталогу	Наименование и краткое описание	Количество определений
D-0598	РеалБест ДНК ВГВ (форма 1)	48
D-0597	48
D-0599	48
D-0595	96
D-0596