Обработка гарантирующая инактивацию вируса ящура

На правах рукописи УДК 576.858.43:577.

ПОНОМАРЕВ Алексей Петрович

МЕХАНИЗМЫ СТАБИЛИЗАЦИИ И ИНАКТИВАЦИИ ВИРУСА ЯЩУРА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных ( ВНИИЗЖ) МСХиП Российской Федерации

Научный консультант: УЗЮМОВ Василий Лаврентьевич, доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РСФСР

Официальные оппоненты: ХРИПУНОВ Егор Максимович, доктор ветеринарных наук, профессор ( ВНИИВВ и М, г. Покров) МАКАРОВ Владимир Владимирович, доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации ( Университет Дружбы Народов, г. Москва)

ОРЛЯНКИН Борис Григорьевич, доктор биологических наук, профессор (ВИЭВ, г. Москва)

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (п. Щелково, Московской обл.)

Защита диссертации состоится " О " (1//ц'Ццх|1(/ 1996 г. в // часов на заседании диссертационного совета Д 120.60.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных МСХиП по адресу: 600900, Г.Владимир, пос. Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ.

Автореферат разослан " _1996 года.

Ученый секретарь диссертационного совета - В.А.Мищенко

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы. Вакцинопрофилактика ящура ведется с применением препаратов, приготовленных на основе инактивированного вируса. Промышленное производство вакцин связано с наработкой больших объемов вирулентного вируса, сохранение структуры и свойств которого имеет первостепенное значение при получении высококачественных вакцин нового поколения.

Создание вакцин нового поколения базируется на получении инак-тивированных антигенов вируса яшура в концентрированном виде, что вызывает необходимость определения условий сохранения устойчивости вируса на различных технологических этапах, связанных с репродукцией вируса в суспензии клеток ВНК-21, с очисткой вируссодержащих суспензий от балластных белков и сопутствующих веществ, с концентрированием вируса, его инактивацией, хранением, высушиванием и др.

Несмотря на то, что проблема инактивации вируса ящура принципиально решена на уровне ее практического применения при изготовлении противоящурных вакцин, имеет место целый ряд вопросов, касающихся расшифровки механизмов инактивации вируса ящура в различных условиях. Рассматривая условия существования вирусов in vivo и vitro можно заключить, что среди факторов влияющих на сохраняемость вируса первоочередную роль играют температура и рН среды ( В.В.Макаров, И.А. Бакулов, 1974).

По данным Бахраха (1957) термоинактивация вируса объясняется двумя механизмами реакции без раскрытия их сущности. Кроме того, указанные подходы не оказались продуктивными в плане сохранения устойчивости вируса ящура в зоне температур 15-55°С. Это подтверждается тем, что гипотеза о существовании двух различных механизмов термоинактивации - "нуклеинового" и "протеинового" не позволяет объяснить сохранение устойчивости антигенов вируса ящура, получаемых, например, методами сублимационной и распылительной сушки (Кравченко В.М. и соавт.,1983).

Литературные^ сведения по инактивации вируса ящура в кислой и щелочной среде чаще всего ограничены констатацией фактического материала без теоретического объяснения феномена разрушения вирусных структур. Следует также отметить, что известные из литературы сведения о механизмах инактивации

вируса ящура при воздействии внешних факторов различной природы нельзя считать убедительными, так как отсутствует единая теория этого явления. По-видимому, задачу поддержания активной и специфичной структуры вируса, то есть сохранение его устойчивости на этапах наработки вирусного сырья, очистки, концентрирования, хранения, инактивации, а также в составе противоящурных вакцин нельзя решить без феноменологического описания взаимосвязи между физико-химическими свойствами вирусных частиц и микроокружением внешней среды. При этом следует учитывать важнейшую особенность строения вирусных частиц как функционирующих биосистем, в структуре которых целесообразно различать структурный и функциональный аспекты организации вирусных частиц (Энгельгардт В.А., 1981). Иными словами, проблема сводится к определению коррелирующей взаимосвязи структуры вирионов с их функциональностью, основой которой является принцип накопления, хранения, реализации и утраты энергии вирусными частицами, как биосистем обладающих свойством живого только в потенциале (Bandea, 1983).

Перечисленные выше нерешенные вопросы указывают на актуальность намеченных исследований, направленных на изучение механизмов стабилизации и инактивации вируса ящура, что является важной задачей при разработке и получении высококачественных вакцин и диагностических препаратов.

1.2. Цель работы. Основной целью работы являлось изучение механизмов стабилизации и инактивации вируса ящура на этапах культивирования, очистки и концентрирования, хранении при различных температурах, воздействии внешних факторов различной природы, высушивании, изготовлении вакцин, а также изучение признаков симметрии - асимметрии в структуре 146S частиц вируса ящура.

1.3. Основные задачи исследований. В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие вопросы:

-отработать оптимальные условия получения высококонцентрированных препаратов вируса ящура и на их основе получить препаративные количества 146S частиц для изучения строения, физико-химических и биологических свойств вируса ящура различных типов;

-установить возможные причины повреждения вирусных структур в динамике их накопления при культивировании вируса ящура в суспезии клеток ВНК-21 и изучить влияние рН на репродукцию вируса ящура и некоторых других вирусов животных;

-изучить влияние на структуру и свойства вируса ящура рН среды суспендирования, солевых и буферных растворов, высушивания вирусных препаратов, действия ферментов, специфических антител, химических инактивантов, электрического и магнитного полей;

-определить электрофизическую характеристику структурных полипептидов и целых вирионов вируса ящура различных типов;

-изучить признаки симметрии и асимметрии в строении 1463 частиц вируса ящура, вируса везикулярной болезни свиней и вируса везикулярной экзантемы свинер;

-обосновать механизм стабилизации и инактивации вируса при воздействии физико-химических факторов.

1.4. Научная новизна. Впервые разработан метод очистки, концентрирования, стабилизации и выделения 146Э частиц вируса ящура с получением их в препаративных количествах в виде обезвоженных концентрат -порошков (авторское свидетельство СССР №1102272), что позволило стандартизировать исходные условия опытов при проведении молекулярно-биологических, вирусологических и иммунобиологических исследований (авторские свидетельства СССР № 1489177, № 15650221 и № 1615917).

Определены условия повышения чувствительности клеток ВНК-21 к вирусу ящура, вирусу диареи КРС и аденовирусу КРС, свидетельством чему является ускорение темпа поражения клеток вирусом, что позволяет уменьшить вероятность модификации указанных выше вирусов в процессе их репродукции в суспензии клеток ВНК-21.

Впервые установлен режим стабилизации структуры и свойств вируса ящура различных типов при замораживании очищенных и концентрированных суспензий. Показано, что оптимальные условия сохранения вируса определяются выбором буферного раствора и рН суспензии, замораживаемой при температуре минус 10-40°С.

Установлено, что регулирование процесса удаления влаги из концентрированных препаратов вируса, достигаемое совмещением процесса концентрирования и обезвоживания вируссодержащей суспензии методом ультрафильтрации с последующим активным вентилированием мембраны с концентратом вируса и вакуумированием концентрат-порошка, позволяет получать препараты с остаточной влажностью менее 1% при сохранении биологических свойств вируса ящура.

Показана возможность использования метода электронной микроскопии для количественной экспресс-оценки нативных и инактивиро ванных антигенов вируса ящура, предназначенных для изготовления противоящурных вакцин. Разработаны различные способы получения поляризованных пленок-подложек для изучения строения вирусных частиц и их электрофизических свойств (авторские свидетельства СССР №445961, №469913 и №481639).

1.5. Теоретическое значение работы. На основании электронно-микроскопических исследований морфологии вируса ящура с использованием поляризованных пленок-подложек показано, что под воздействием электрического потенциала поверхности пленки-подложки в структуре белкового капсида вирионов происходят конформационные изменения. В зависимости от величины положительного электрического потенциала пленок-подложек (авторское свидетельство СССР №469913) конформационная перестройка может вызывать смещение изоэлектрической точки с р1 5,7 в объеме в сторону больших значений (ориентировочно р1 7,0-7,4) в монослое на поверхности пленок-подложек. Контрастирование вирусных частиц в их изоэлектрической точке, характеризующейся равенством противоионов раствора ФВК в адсорбционном слое заряженным группам на поверхности вирионов, позволило выявить признаки смешанного контраста в виде негативно и позитивно окрашенных участков белкового капсида. Наличие положительно и отрицательно заряженных участков поверхности 1465 частиц отражает асимметричность их строения. При более высоких электрических потенциалах как положительной, так и отрицательной полярности пленок-подложек конформационная перестройка белкового капсида сопровождается разрушением структуры вирионов на отдельные структурные компоненты.

В опытах по изоэлектрическому фокусированию белков вируса ящура установлено, что структурный полипептид УР1 заряжен положительно, а полипептиды УР2 и УРЗ - отрицательно, ассоциация которых в структуру протомера приводит к образованию асимметричного диполя. С учетом электрофизических параметров структурных полипептидов показано, что целые вирионы вируса ящура обладают суммарным электроотрицательным зарядом, величина которого существенно различается у отдельных типов вируса и обуславливает их различную устойчивость в идентичных условиях внешней среды.

Результаты исследований показали, что устойчивость вируса ящура зависит от сохранения природного базового свойства вирусных частиц - их

электрического заряда. Определяющим фактором механизма инактивации вируса ящура является сообщение системе вириона дополнительной энергии, вызывающей изменение энергетического состояния вируса, а следовательно и его функции. В частности это следует из того, что от состояния ионизации карбоксильных групп белковой оболочки вирионов или величины их электроотрицательного заряда, определяемого величиной рН среды, зависит устойчивость вируса при замораживании очищенных и концентрированных суспензий.

1.6. Практическое значение работы. На основании проведенных исследований разработан комплексный метод получения из суспензий нативного и инактивированного вируса ящура концентрированных препаратов в обезвоженном порошкообразном состоянии, в составе которых вирус сохраняет свои биологические свойства в течение нескольких лет.

Выполненные разработки вошли в технологические разделы нормативно-технической документации: "Временная инструкция по изготовлению и контролю универсальной и поливалентной вакцины против ящура типов А, О, С и Азия-1", утвержденная ГУВ 19 июня 1991 года; ТУ "Вакцина против ящура бивалентная типа А,О (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21) инактивированная", утвержденные директором института и согласованные с департаментом ветеринарии МСХиП Российской Федерации в 1995 году.

Показана возможность сокращения в среднем в два раза времени репродукции вируса ящура в суспензии клеток ВНК-21, что имеет важное практическое значение в плане снижения производственных и энергетических затрат при наработке вируссодержащего материала для изготовления биопрепаратов. Кроме того, ускорение темпа поражения клеток вирусом значительно уменьшает опасность развития контаминации, причиной которой могут быть материалы и условия культивирования.

В процессе работы по получению очищенных и концентрированных препаратов вируса разработаны и утверждены следующие методики, которые прошли комиссионные испытания и используются при молекулярно-биологических исследованиях и получении биопрепаратов:

-"Методика получения высокоочищенных суспензий вируса ящура". Утверждена директором института 01. 06. 83 года;

-"Методика получения очищенного и концентрированного антигена лапинизированного вируса ящура А22". Утверждена директором института 24. 05. 86 года.

-"Методика получения высококонцентрированного вируса ящура". Утверждена директором института 19. 01. 88 года;

-"Методика препаративного выделения 1465 частиц вируса ящура и их количественная оценка. Утверждена директором института 19. 01. 88 года;

-"Методика подготовки посевного очищенного и концентрированного вируса ящура для культивирования в суспензии". Утверждена директором института 28. 12. 93 года.

По результатам исследований морфологического и молекулярно-биологического строения вируса ящура разработаны следующие методики:

-"Методика оценки количественного и качественного состояния вируса ящура с помощью электронной микроскопии". Утверждена директором института 25. 12. 87 года;

-"Методика изоэлектрического фокусирования белков вируса ящура в полиакриламидном геле". Утверждена директором института 31. 01. 89 года. Методики внедрены в лабораторную практику института и используются также при исследовании других вирусов животных.

1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1.7.1. Результаты определения оптимальных условий очистки, концентрирования, стабилизации и выделения 146Б частиц вируса ящура с переводом последних в обезвоженное порошкообразное состояние.

1.7.2. Исследования по репродукции вируса ящура и некоторых других вирусов животных в зависимости от рН суспензии клеток ВНК-21, а также результаты проверки рН-зависимой устойчивости вируса ящура в составе очищенных суспензий, замороженных при температуре минус 10+2°С.

1.7.3. Результаты исследований механизмов инактивации вируса ящура под воздействием внешних факторов в процессе культивирования в суспензии клеток ВНК-21, влиянии на вирус различных температур, солевых и буферных растворов, при образовании пены в суспензии, при высушивании вирусных препаратов, воздействии ферментов, специфических антител, химических инактивантов, электрического и магнитного полей.

1.7.4. Исследования морфологических и молекулярно - биологических особенностей строения вируса ящура различных типов с выявлением признака

1.8. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета института в виде ежегодных отчетов по темам государственных заданий 8.1.-3.81. 7.2.2.-84. 12. 08 и 02.04.М (1980-1995); на симпозиумах специалистов стран-членов СЭВ (1981, г. Владимир; 1988, г. София); IV. V и VI Всесоюзных ветеринарных вирусологических конференциях (1976, г. Владимир; 1980, г. Казань; 1990, г.Владимир); на Всесоюзной конференции (1981, г. Москва): на восьми научных конференциях ВНИЯИ (1974-1988): на Всесоюзной научно-технической конференции (1990, г. Нижний Новгород); на республиканской конференции (¡990, г. Харьков); на республиканской научно-практической конференции (1993. г. Харьков); на международной конференции "К новой стратегии борьбы с ящуром"(1991, г. Владимир); на Всероссийской научно-практической конференции (1995, г. Владимир).

1.9. Публикации результатов исследовании. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ. Получено 7 авторских свидетельств.

1.10. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 429 страницах машинописного текста, включает введение (6 стр.), обзор литературы (49 стр.), материалы и методы (7 стр.), результаты исследований, выводы и практические предложения (271стр.). Список использованной литературы включает 253 работы на русском языке и 182 работы зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 38 таблицами и 82 рисунками. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную н практическую ценность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы н методы

2.1.1. Вирусы. При проведении исследований использовали штаммы вируса ящура из коллекции института, репродуцированные в организме крольчат, культурах клеток ВНК-21.1В-Я5-2. ПСГК:

-вирус ящура А;:-550 - выделен от крупного рогатого скота в 1964 году в колхозе им. Шаумяна. Азербайджанской ССР. Сальянского производственного управления;

-вирус ящура Азия-1 №48 - штамм из музея института; -вирус ящура С I -564/72 - "Закарпатский", выделен от крупного рогатого скота 08.10.72 г. в колхозе им.Кирова, Закарпатской области, с.Чека, Виноградского района УССР;

-вирус ящура 0| -194 - "Волгоградский", выделен в 1967 году; -вирус ящура БАТ-! №96 - штамм из музея института;

-вирус ящура ЗАТ-2 Кения (183/74) выделен в Кении в 1974 году, поступил из Пирбрайта 17.05.84 года;

-вирус ящура БАТ-З Бечуаналенд 1/65 - выделен в Африке в 1965 году, поступил из Пирбрайта в 1967 году. Другие вирусы животных:

-вирус везикулярной болезни свиней штамм Т-75, адаптированный к монослойной культуре клеток 1В-113-2;

-вирус везикулярной экзантемы свиней штамм А-48, адаптированный к монослойной культуре клеток 1В-К8-2 и ПСГК;

-вирус везикулярного стоматита штамм Нью-Джерси и штамм Индиана; -вирус диареи крупного рогатого скота штамм Орегон; -аденовирус крупного рогатого скота первого серотипа.

2.1.2. Очистка вируссодержащих суспензий. Очистку вируссодержащих суспензий культурального и латинизированного вируса ящура проводили в различных вариантах с использованием хлороформа, катионного флокулянта -анионита ВА-2, полиэтиленимина и активированной кремневой кислоты. Применение последнего флокулянта изложено в описании авторского свидетельства СССР №1102272.

2.1.3. Концентрирование вируса ящура. Концентрирование вируса ящура и других вирусов, вызывающих заболевания с везикулярным синдромом, проводили в соответствии с методиками указанными выш Пономарев, Алексей Петрович

доктора биологических наук

Владимир, 1996

ВАК 03.00.06

Что представляет собой вирус ящура? Каким образом передается инфекция? Каковы симптомы заболевания у животных и человека? Чем опасен вирус ящура? Как лечат недуг? Обо всем этом пойдет речь в нашей публикации.

Возбудитель заболевания

Возбудителем вируса ящура выступает специфическая структура рибонуклеиновых кислот, которая относится к семейству пикорнавирусов. Размер таких инфекционных частиц составляет порядка 30 нанометров. Микроскопическая структура состоит из РНК, окруженной белковой оболочкой. Оказавшись в организме человека, либо животного, вирус поражает лимфу. Развитие инфекции происходит на протяжении 48 часов.

Вирус ящура обладает устойчивостью к воздействию жары и холода в естественных условиях. Однако моментально погибает при воздействии температуры более +80 °С. Находясь в фекалиях животного, которые оказались в окружающей среде, возбудитель инфекции переходит в неактивную фазу, сохраняя жизнедеятельность на протяжении более 100 суток. Вирус ящура теряет способность к размножению под влиянием ультрафиолетовых лучей, а также обеззараживающих веществ.

Механизм развития инфекции

Проникнув в организм, вирусный возбудитель концентрируется на слизистых оболочках ротовой полости и поврежденных участках кожи. В местах внедрения в ткани инфекция скапливается в небольших везикулах. Здесь наблюдается активное размножение вируса. Затем инфекция распространяется кровотоком, атакуя ткани органов и систем. Со временем развивается интоксикация организма. Патологические рибонуклеиновые структуры оседают в эпителии ротовой полости и носоглотки, концентрируются в уретре.

Группы риска

Какие категории населения находятся в группе повышенного риска инфицирования вирусом ящура? Обычно развитие заболевания наблюдается среди персонала животноводческих предприятий. Как показывает практика, чаще всего вирусная инфекция поражает доярок, загонщиков скота, людей, что трудятся на скотобойнях и мясокомбинатах. Иногда, в результате халатного отношения к работе, вирус ящера у человека наблюдается среди ветеринаров и зоотехников.

В то же время не зафиксировано ни одного случая передачи возбудителей недуга от одного человека к другому. Обусловлено это низкой восприимчивостью человека к инфекции. Помимо прочего, после выздоровления люди приобретают кратковременный иммунитет, длительность которого составляет примерно год.

Симптомы ящура у животных

Зачастую инфекция поражает молодняк большого рогатого скота. Неполовозрелые животные не имеют иммунитета против вируса и более тяжело переносят заболевание. Для развития недуга характерно появление лихорадки, которая сопровождается высыпаниями на конечностях, слизистых оболочках рта, тканях, что прилегают к рогам, а также на коже вымени.

Вирус ящура у животных атакует организм на протяжении 10-15 суток. Этому предшествует инкубационный период, который длится 2-4 дня. В большинстве случаев скот удается благополучно излечить. Однако при тяжелом течении заболевания наступает летальный исход.

Симптомы у человека

Какие симптомы вируса ящура отмечаются у людей? Зачастую уже на протяжении инкубационного периода, продолжительность которого составляет порядка недели, у инфицированного человека отмечаются первые характерные признаки заболевания. К таковым относится:

• озноб;
• приступы головной боли;
• общее недомогание;
• болевые ощущения в мышцах;
• повышение температуры до +38… +39 °С.

Затем вирус ящура у человека начинает прогрессировать. Через несколько дней к вышеуказанным симптомам добавляется ощущение жжения и сухости в ротовой полости. Проявляется светобоязнь, возникают болевые ощущения при мочеиспускании.

Что касается внешних признаков вируса ящура, отмечается появление мелких белесых пузырьков на нёбе, губах, внутренней поверхности щек. Примерно спустя сутки такие афты вскрываются, что приводит к образованию язвочек ярко-красного оттенка. На данном этапе развития недуга наблюдается постепенное снижение температуры тела. Несмотря на такое сравнительное облегчение, общее состояние инфицированного человека ухудшается. Возникают сильные боли при глотании, происходит обильное выделение слюны. Затем отекают ткани языка, припухают губы. Речь приобретает невнятный характер.

При отсутствии адекватного лечения вируса ящура, у человека пузырчатые образования перемещаются на кожу ног и рук. Здесь афты заживают гораздо быстрее, нежели на слизистых оболочках. В течение 3-5 дней от них не остается никакого следа.

Течение заболевания у детей имеет более тяжелый характер. К вышеуказанным симптомам зачастую добавляется тошнота, частые позывы к рвоте, расстройство пищеварительных органов, изменение структуры стула, диарея.

Особенности передачи инфекции

Инфекция может распространяться между животными и от скота к человеку. Пораженные вирусом люди являются лишь носителями. Однако они не способны передавать возбудитель заболевания другому человеку. Наиболее восприимчивы к вирусу дети. Способствует этому наличие неокрепшей иммунной системы.

Как передается вирус ящура? Инфекция распространяется контактным способом. Заражение наблюдается в случае проникновения возбудителя в организм при уходе за крупным рогатым скотом. Вирус может концентрироваться на шерсти животных, содержаться в загрязнениях, испражнениях.

Обычно, люди инфицируются при вдыхании взвешенной в воздушном пространстве пыли. Иногда заражение происходит при контакте грязных рук со слизистыми оболочками рта. Болезнь способна развиваться также при употреблении мяса и молока животных.

Лечение ящура у животных

Уничтожение инфекции среди крупного рогатого скота происходит путем изоляции больных животных от остальной части стада. Последних содержат в отдельных помещениях. Уничтожают вирусный возбудитель введением в организм обеззараживающих сывороток, содержащих такие вещества как реконвалесценты, лактоглобулины, иммунолактоны.

В период восстановления животным предлагают обилие чистой воды и питательные корма. Слизистые оболочки ротовой полости периодически обрабатывают антисептиками. В целях устранения язвочек на поверхности кожи назначают мази с заживляющим эффектом. Дополнительно могут применяться антибиотики и обезболивающие препараты.

В случае широкого распространения инфекции в стаде вводят карантин. При наступлении эпидемий больной скот уничтожают. Туши животных утилизируют, сжигая в печах. Карантинные меры прекращаются по прохождению 21 дня с момента фиксации последнего случая заражения.

Лечение ящура у человека

Терапия при инфицировании вирусным возбудителем требует помещения зараженного человека в стационар. Лечение предполагает регулярную дезинфекцию ротовой полости, заживление образованных язв, применение мер, направленных на облегчение общего состояния больного.

Инфицированным людям предлагается легкоусвояемая пища с полужидкой консистенцией. Еда должна иметь комнатную температуру и не содержать ингредиентов, способных оказывать раздражающее воздействие на слизистые оболочки. При обширном распространении язвенных проявлений питание больному обеспечивают через введение пищи посредством зонда.

В целях местного лечения используют воздействие на пораженные участки кожи лазерным и ультрафиолетовым излучением. Для скорейшего заживления язвочек назначают обработку тканей флореналевой, оксолиновой либо интерфероновой мазью.

Чтобы облегчить страдания больного в ходе лечения используют болеутоляющие, сердечно-сосудистые, жаропонижающие фармакологические препараты. При потребности выполняют мероприятия, направленные на выведение из организма токсинов. Для поддержания иммунитета назначают витаминные комплексы.

В большинстве случаев ящур не представляет для человека смертельной опасности. Прогнозы при такой вирусной инфекции крайне благоприятны. Полное выздоровление с формированием соответствующего иммунитета наступает за довольно короткий период. Недуг не оставляет после себя никаких последствий. Случаи летального исхода изредка наблюдаются лишь среди новорожденных и малышей раннего возраста.

Профилактика

Предотвратить инфицирование вирусом ящура позволяет, в первую очередь, личная гигиена и соблюдение санитарных норм. В целях предупреждения заболевания нередко проводится соответствующая вакцинация животных.

Особое значение в плане профилактики имеет выполнение инструкций во время работы на фермах, скотобойнях, мясокомбинатах. Согласно предписаниям, ухаживать за скотом необходимо, облачившись в спецодежду, защитную маску, перчатки. После окончания работы важно мыть руки с мылом.

Чтобы лишний раз не подвергать себя опасности инфицирования вирусом, стоит употреблять в пищу исключительно проверенные, безопасные продукты животного происхождения. Посуду, в которой мясо либо молоко сберегалось в сыром виде, нужно тщательно очищать с использованием моющего средства.

Последний зарегистрированный случай эпидемии ящура

В октябре текущего года зафиксировали вирус ящура в Башкирии. Режим чрезвычайной ситуации был введен в поселках Ермухаметово и Урмекеево, что находятся на территории Туймазинского района. В регионе перекрыли дороги, что ведут к отмеченным населенным пунктам, а также установили пропускные пункты. Специальные подразделения по устранению чрезвычайных ситуаций оборудовали дезинфицирующие станции. Начались активные мероприятия по обеззараживанию фермерских хозяйств.

В ходе устранения эпидемии был обнаружен вирус ящура в молочной продукции. Продажа последней из рук в руки оказалась под запретом. Крупный рогатый скот в вышеуказанных населенных пунктах пришлось истребить. Остальные животные в прилегающих регионах подверглись вакцинации. На данный момент мясо и молоко не продается как населению, так и предприятиям, пока не будет полностью уничтожен вирус ящура в Башкирии.

В заключение

Как видно, ящур является достаточно опасной инфекцией вирусной природы, которая способна нанести существенные убытки животноводческим хозяйствам. Впрочем, при условии соблюдения установленных инструкций и личной гигиене заболевание не представляет опасности для человека. Если же инфекции все же удается поразить организм, прогнозы на полное восстановление здесь положительные.

Использование: при приготовлении биологических средств специфической профилактики и диагностики ящура. Сущность применения: в суспензию культурального вируса ящура добавляют при перемешивании 5-или 10-%-ный водный раствор флокулянта полигуанидина до конечной концентрации 0,005 - 0,03%, pH 7,6 - 8,0; флокулированные балластные белки отделяют центрифугированием, сепарированием или отстоем. 6 табл.

Изобретение относится к вирусологии, а более конкретно к способам очистки вирусных суспензий от балластных белков и жиров, и может быть использовано при изготовлении биологических средств специфической профилактики и диагностики ящура у сельскохозяйственных животных.

Известные способы очистки вируссодержащих суспензий подразделяются на три группы физические, химические и физико-химические с использованием хлорированных и фторированных углеводородов в двухфазных системах полимеров [1] Недостатком указанных методов является или низкая производительность, или высокая сложность исполнения; или незначительная степень очистки.

Известен способ очистки культурального вируса ящура от балластных белков и жиров с помощью флокулянта полиглюкина, который добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,7-1,0% [2] Недостаток данного способа состоит в его низкой эффективности, так как в вируссодержащей суспензии после ее обработки полиглюкином остается значительное количество балластных веществ, которые придают вакцине нежелательную аллергенность.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату при использовании является способ очистки вируса ящура, репродуцированного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, путем обработки вируссодержащей суспензии органическим растворителем хлороформом, который добавляют в объеме 2% от количества суспензии при постоянной работе мешалки и центробежного насоса, и последующего удаления денатурированных белков и жиров центрифугированием или сепарированием [3] Способ-прототип имеет следующие недостатки: 1) низкое качество очистки вируссодержащей суспензии от балластных веществ, так как эффективность очистки зависит от количества добавляемого хлороформа и степени его эмульгирования в суспензии; 2) обработка суспензии хлороформом не устраняет обсемененности суспензии микрофлорой; 3) хлороформ обладает высокой летучестью и токсичностью, поэтому работа с хлороформом опасна и вредна для обслуживающего персонала; 4) хлороформ является экологически вредным препаратом.

В задачу создания настоящего изобретения входил поиск химического препарата, позволяющего повысить экологичность и эффективность способа очистки от балластных веществ промышленных объемов суспензии культурального вируса ящура с одновременной инактивацией контаминирующей суспензию микрофлоры и сохранением антигенных и иммуногенных свойств вируса ящура.

Поставленная задача решена тем, что в известном способе стерилизующей очистки культурального вируса ящура, включающем добавление в вирусную суспензию флокулянта и последующее отделение флокулированных балластных веществ в соответствии с изобретением в качестве флокулянта используют полигуанидин (ПГ) в конечной концентрации 0,005-0,03% Для стерилизующей очистки суспензии культурального вируса ящура используют препараты ПГ мол.м. 20000-30000Д и 30000-100000Д, полученные из института нефтехимического синтеза АН СССР от П.А.Гембицкого и Покровского завода биопрепаратов.

ПГ-препарат эмпирической формулы (С₇Н₁₆N₃CI)_n, выпускаемый промышленностью под торговой маркой "Полисепт", представляет собой водорастворимый полимерный продукт, который благодаря качествам катионного электролита в сочетании с полимерностью, а также наличию полярной гуанидиновой и неполярной гексаметиленовой группировкам, придающим адгезивные и поверхностно-активные свойства, имеет широкий спектр применения в народном хозяйстве. ПГ обладает высокой бактерицидной и фунгицидной активностью. Растворы препарата в 0,05%-ной концентрации вызывают гибель грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов в течение 5-25 мин. ПГ является абсолютно безопасным для здоровья людей и животных и экологически безвредным для окружающей среды.

По сравнению с прототипом предлагаемый способ отличается тем, что в качестве флокулянта используют ПГ в конечной концентрации 0,005-0,03% Указанные отличия являются существенными, так как они достаточны во всех случаях для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

В результате проведенных исследований впервые установлены новые свойства ПГ: в используемых концентрациях он не разрушает вирус, флокулирует балластные белки и жиры. Новые свойства ПГ использованы для очистки вируссодержащей суспензии с одновременной инактивацией контаминирующей суспензию микрофлоры и сохранением исходных биологических свойств вируса ящура, что позволяет повысить экологичность предлагаемого способа и качество очистки.

Признаки, отличающие предлагаемый способ от прототипа, не выявлены в других известных решениях при изучении данной и смежных областей знаний.

Благодаря использованию новой совокупности известных и отличительных признаков, характеризующих предлагаемый способ, достигается технический результат, указанный в задаче создания изобретения, что подтверждено результатами многочисленных исследований, сведения с которых приведены ниже.

П р и м е р 1. По окончании культивирования вируса ящура А₂₂ в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в рубашку реактора подают хладагент.

Одновременно в вируссодержащую суспензию, стерильную или контаминированную микрофлорой, добавляют при перемешивании 5 или 10%-ный водный раствор ПГ рН 7,6-8,0 до конечной концентрации 0,005%
При обработке ПГ вируссодержащей суспензии объемом до 10 л перемешивание осуществляют вручную в течение 5 мин.

В этом случае флокулированные балластные белки отделяют в центрифуге в течение 20 мин при 1000 g. При объеме вируссодержащей суспензии до 2000 л перемешивание последней после добавления ПГ проводят с помощью мешалки реактора в течение 20 мин. После охлаждения вируссодержащей суспензии до 4-10 о С отделяют флокулированные балластные белки и микробные клетки центрифугированием, сепарированием или отстоем.

Для центрифугирования вируссодержащей суспензии используют проточную центрифугу ОТР-101К-01. Режим центрифугирования 200-300 л/ч. Для сепарирования используют сепаратор фирмы Альфа-Лаваль. Режим сепарирования 1000 л/ч. Длительность отстоя зависит от объема суспензии и определяется индивидуально для каждого случая. Очищенную таким образом вируссодержащую суспензию проверяют на количество балластных веществ, стерильность, инфекционность и компонентный состав вируса.

П р и м е р 2. Очистку вируса ящура А₂₂, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 1. Отличие состоит в том, что 5 или 10%-ный водный раствор ПГ добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,01%
П р и м е р 3. Очистку вируса ящура А₂₂, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 1. Отличие состоит в том, что 5 или 10%-ный водный раствор ПГ добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,03%
П р и м е р 4. Очистку вируса ящура О₁, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 1.

П р и м е р 5. Очистку вируса ящура О₁, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 2.

П р и м е р 6. Очистку вируса ящура О₁, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 3.

П р и м е р 7. Очистку вируса ящура Азия-1, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примерах 1 или 4.

П р и м е р 8. Очистку вируса ящура Азия-1, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примерах 2 или 5.

П р и м е р 9. Очистку вируса ящура Азия-1, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примерах 3 или 6.

Эффективность предлагаемого способа в сравнении с прототипом подтверждены результатами многочисленных экспериментов, сведения о которых представлены в табл. 1-6.

В опытах использовали 5 или 10%-ные водные растворы ПГ, рН которых устанавливали раствором уксусной кислоты или аммиака в пределах 7,6-8,0.

Исследования по обработке суспензии культурального вируса ящура различными образцами ПГ показали, что с увеличением молекулярной массы возрастала флокулирующая активность препарата в отношении нерастворенной взвеси и растворенных балластных белков. При самоосаждении флокул или при отделении их с помощью центрифугирования надосадочная жидкость становилась более прозрачной.

Предлагаемый способ очистки испытан в лабораторных и промышленных условиях. При этом определяли количество балластного белка, титр инфекционности вируса, стерильность очищенной суспензии, количество 146S компонента и иммуногенную активность вируса в составе адсорбатвакцины.

Содержание растворенного балластного белка в неочищенной суспензии, а также в суспензиях, обработанных ПГ и хлороформом, определяли по калибровочной кривой, построенной по известным концентрациям бычьего сывороточного альбумина. Оптическую плотность образцов суспензии измеряли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм.

Инфекционность вируса в суспензии до и после очистки определяли методом бляшек на культуре клеток свиной почки. Наличие и количество бактериальной и грибковой микрофлоры определяли по методу высевом суспензии и ее разведений на среды МПА, МППБ, тиогликолевую среду и агар Сабуро. Анализ компонентного состава вируса ящура после его обработки хлороформом или ПГ проводили спектрофотометрическим методом. Очищенный предлагаемым способом вирус инактивировали 0,03% концентрацией аминоэтиленимина в течение 24 ч при 27-28 о С. Авирулентность инактивированного вируса проверяли, инфицируя монослой клеток свиной почки неразведенной суспензией вируса. Целостность монослоя и отсутствие цитопатических изменений подтверждали авирулентность инактивированного препарата вируса. Иммуногенную активность вируса проверяли в составе адсорбатвакцины с сапонином. Иммуногенность вакцин определяли по 50% иммунизирующей дозе для взрослых белых мышей массой 18-22 г, которую вычисляли согласно формуле Кербера-Ашмарина. Опыты проводили с использованием суспензии вируса ящура типа А, О₁ и Азия-1, контаминированной микрофлорой. Результаты исследований представлены в табл. 1-6.

В результате проведенных исследований установлено, что количество растворенного балластного белка в суспензиях, обработанных ПГ м.м. 20000-30000Д и ПГ м. м. 30000-100000Д отличается между собой незначительно, но суспензии вируса, очищенные ПГ м.м. 20000-30000Д, содержат мелкую взвесь белковых флокул. Низкоскоростное центрифугирование и сепарирование не удаляет такую взвесь и очищенные суспензии обладают слабой прозрачностью. ПГ м. м. 30000-100000Д вызывает образование более крупных белковых флокул, обеспечивающих получение прозрачных суспензий при центрифугировании и сепарировании.

В табл. 1 показаны результаты обработки вируссодержащей суспензии ПГ в концентрации 0,005-0,030% Использование меньшей концентрации ПГ, а именно 0,0025% для очистки вирусной суспензии не позволяет получить удовлетворительное качество очистки суспензии. Увеличение концентрации ПГ в суспензии свыше 0,03% приводит к значительным потерям вируса. Наблюдается снижение титра инфекционности вируса и количества 146S компонента вируса. В табл. 1 показано, что обработка суспензии вируса ящура ПГ позволяет уменьшить количество растворенных балластных белков на 23% по сравнению с неочищенной суспензией, а обработка суспензии хлороформом лишь на 14%
В табл. 2 показано, что контаминированные микрофлорой суспензии вируса ящура после 5-часового контакта с ПГ в концентрации 0,01% а также после 20-часового контакта с ПГ в концентрации 0,005% при исследовании были стерильными.

В табл. 3 показано, что инфекционность вируса ящура типа А, О и Азия-1 в образцах очищенной ПГ суспензии оставалась на прежнем уровне.

В табл. 4 показано, что количество 146S компонента вируса ящура в суспензии, очищенной ПГ, не отличалось от такового при обработке суспензии 2% хлороформа.

В табл. 5 показано, что иммуногенность вакцин из вируса ящура, обработанного ПГ, была равной 0,03 мл для типа А и 0,18-0,22 для типа О и не уступала активности вакцин из вируса, обработанного хлороформом.

Данные табл. 6 показывают стабильность иммуногенных свойств культурального вируса ящура А и О типов в течение 6-12 мес при хранении вакцины при 4-8 о С.

Таким образом, предложен способ стерилизующей очистки культурального вируса ящура, использование которого обеспечивает по сравнению с прототипом следующие преимущества:
1. Количество растворенного белка в очищенной суспензии снижается в 1,6 раза.

2. Исключается выбраковка вируссодержащей суспензии, контаминированной микрофлорой в период репродукции вируса.

3. Исключается использование антибиотиков в период репродукции вируса и при составлении вакцины.

4. Технологический цикл получения очищенной суспензии культурального вируса ящура сокращается по времени на 1-1,5 ч и не требует оборудования для интенсивного эмульгирования хлороформа в суспензии вируса, например, насосов центробежного типа.

5. Замена хлороформа на ПГ при очистке вируссодержащей суспензии делает эту операцию безвредной для обслуживающего персонала, а технологию производства вакцин более экологически чистой.

6. Благодаря снижению концентрации балластного белка, отсутствию антибиотиков и микрофлоры уменьшается аллергенность и реактогенность вакцины.

Предлагаемый способ найдет промышленное применение при изготовлении средств специфической профилактики ящура сельскохозяйственных животных.

СПОСОБ ОЧИСТКИ И СТЕРИЛИЗАЦИИ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ВИРУСА ЯЩУРА, включающий добавление в вирусную суспензию флокулянта и последующее отделение флокулированных балластных веществ, отличающийся тем, что в качестве флокулянта используют полигуанидин в конечной концентрации 0,005 - 0,03%.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.02.2004

Извещение опубликовано: 27.11.2004 БИ: 33/2004