Определение титра вируса в крови

Титр антител - это максимальное разведение кровяной сыворотки, содержащее в своем составе специфические антитела. При изучении иммунного статуса делается одно разведение сыворотки, соответственно, прилагаемой к тест-системе (1:50, 1:100), после чего при необходимости рекомендуется ее титрование посредством последовательных двукратных разведений.

Установлено, что при наличии в анализе титров антител до обратного значения 1:600-1:800 существует прямо пропорциональная связь между показателем оптической плотности и значением титра антител данной сыворотки. Выше данной обратной величины подобная зависимость нарушается и при последующем двукратном титровании (1:1600, 1:3200, 1:6400 и т.д.) возникает ошибка, которая тем больше, чем больше разведение.

Рассмотрим подробнее, что это - титр антител.

Разновидности антител

Многим интересно, что значит титры антител. В иммунологических исследованиях выделяется несколько видов антител, действующих строго на конкретные антигены. Их определяют при помощи метода титрования и в их число входят:

1. IgM – первоначальный иммуноглобулин, который начинает продуцироваться при попадании инфекции в организм. Его роль заключается в стимуляции иммунитета на первичную борьбу с патологическим процессом. Наличие IgG в крови наблюдается через 3-5 суток после начала болезни. Эти антитела формируют устойчивый иммунитет к определенным инфекциям, отвечают за результативность вакцинации.
2. IgA – защищают пищеварительный тракт, дыхательные пути и мочевыделительную систему от вредоносных микробов. Они связывают патогенные объекты, не давая им закрепиться на слизистых покровах.
3. IgE – активизируются в целях защиты организма от грибков, паразитов и аллергенов, и локализуются, главным образом, в бронхах, желудке и кишечнике. Данные антитела принимают участие в процессах формирования вторичного иммунитета. В плазме крови в свободном виде их практически нет.
4. IgD – фракция, которая до сих пор недостаточно изучена. Считается, что эти агенты отвечают за местный иммунитет, начинают продуцироваться при обострении миеломной болезни или хронических инфекций. В сыворотке составляют меньше 1% фракции всех существующих иммуноглобулинов.

Все антитела могут свободно присутствовать в плазме крови либо прикрепляться к поверхностям инфицированных клеток. Узнав антиген, специфические белки начинают соединяться с ним с помощью хвоста. Он служит особым сигналом для иммунных клеток, отвечающих за процессы нейтрализации чужеродных объектов.

Типы в зависимости от взаимодействия

С учетом того, как взаимодействуют с антигенами белки, их также подразделяют на несколько типов:

1. Антиинфекционные – связываются с телом болезнетворных микроорганизмов, уничтожая их.
2. Антитоксические – не оказывают влияния на жизнедеятельность чужеродных тел, однако обезвреживают токсины, вырабатываемые ими.
3. Аутоантитела – вещества, которые запускают механизм возникновения аутоиммунных нарушений посредством атаки здоровых клеток организма.
4. Аллореактивные – это иммуноглобулины, выступающие против антигенов клеток и тканей иных организмов одного и того же биологического вида. Исследование на определение антител этой фракции проводится посредством титрования при трансплантации различных органов.
5. Изоантитела – белковые соединения, которые продуцируются против агентов клеток иных биологических видов.
6. Антиидиотипические – соединения, которые предназначены для нейтрализации переизбытка собственных антител.

Как проводится анализ на титры антител? Это очень распространенное исследование.

Исследование крови

Современным методом лабораторной диагностики различных заболеваний считается анализ крови ИФА (иммунофлюоресцентный анализ). Этот тест на антитела позволяет определить титр (функциональность) иммуноглобулинов, их разновидность и установить, на каком этапе развития находится конкретный патологический процесс.

Алгоритм проведения

Методика определения титра антител состоит из нескольких стадий: сначала лаборант получает у человека сыворотку крови. Полученный образец помещается на специализированную пластиковую планшетку с наличием лунок, в которых присутствуют очищенные антигены искомых возбудителей или белка (в случаях если необходимо определить антиген). В лунки добавляется специальное окрашивающее вещество, которое при возникновении положительной ферментной реакции меняет цвет иммунных комплексов. По плотности окрашивания делается вывод о результатах проведенного анализа крови на титр антител.

Сроки

Для проведения данного тестирования исследователям необходимо от одного до трех дней. Сам анализ бывает двух видов: качественный и количественный. В первом случае указывается, что в сыворотке крови будет найден или, наоборот, отсутствовать искомый антиген. Тест количественного типа проводится в соответствии с более сложной цепной реакцией и позволяет сделать вывод о концентрации антител, установить их разновидность, оценить с какой скоростью развивается патологический инфекционный процесс.

Показания к назначению

Полный перечень показаний к проведению ИФА охватить невозможно, однако наиболее распространенными целями осуществления данного анализа является диагностика острых и хронических форм таких инфекционных патологий:

• IgG к ВИЧ;
• IgM и IgG к гепатитам вирусного происхождения А, B, C, E;
• IgM и IgG к цитомегаловирусу;
• IgM и IgG к герпесу;
• IgM и IgG к вирусу Эпштейна-Барр;
• IgG к паразитарным болезням;
• IgM и IgG к токсоплазмозу;
• IgM и IgG - титры антител к кори, краснухе, сальмонеллезу, клещевому энцефалиту, дизентерии и прочим заболеваниям;
• IgM и IgG к инфекциям, которые передаются через половые пути;
• IgG к хеликобактерной инфекции;
• в целях общей оценки показателей иммунитета и маркеров аутоиммунных заболеваний;
• определение онкологических маркеров (фактор некроза опухоли, простатспецифический антиген, раково-эмбриональный антиген и другие);
• определение уровня гормонов крови (прогестерон, пролактин, тестостерон, тиреотропный гормон и другие).

Расшифровка

Анализируемыми показателями при этом считаются:

1. IgM – присутствие данного класса иммуноглобулинов свидетельствует об остром течении инфекционного процесса в организме. Их отсутствие может свидетельствовать об отсутствии возбудителя либо о переходе патологического процесса в хроническую стадию.
2. IgA при отрицательном результате тестирования на IgM в большинстве случаев свидетельствует о скрыто протекающей либо хронической инфекции.
3. Совместное присутствие IgM и IgA - два положительных результата свидетельствуют о разгаре острой фазы имеющейся патологии.
4. IgG - хронизация заболевания либо выздоровление и формирование иммунитета к конкретному инфекционному агенту.

Еще одним важным количественным показателем является индекс авидности антител, который выражается в процентах. Он указывает на то, какой промежуток времени прошел от начала развития инфекционного процесса. Чем такой индекс выше, тем длиннее данный период.

Преимущества методики

Бесспорными преимуществами данной методики исследования считаются ее специфичность и высокая чувствительность. Чувствительность означает возможность распознать искомый элемент, даже если его содержание в образце невысокое. Специфичность подразумевает безошибочность диагностирования: если результаты положительные, значит, обнаружены именно те антитела или антигены, которые предполагались.

Высокая степень технологичности осуществления иммуноферментного анализа методом титрования минимизирует воздействие человеческого фактора, что существенно уменьшает вероятность ошибки. Основная масса используемых в современных клиниках реактивов и тест-систем для ИФА производятся в промышленных условиях, что гарантирует достоверный результат.

Основной недостаток

Основным недостатком данной диагностической методики является то, что для ее проведения необходимо знать, что именно нужно найти. Анализ подразумевает, что врач заранее предполагает, каким патологическим агентом вызвано то или иное заболевание.

Еще один недостаток данного исследования заключается в том, что ИФА на титры антител – это довольно дорогой метод анализа крови, что часто не по карману многим пациентам. А это означает, что к назначению такой диагностики врач должен подходить с умом.

Ознакомление с методикой титрования вирусов.

Оборудование и материалы

Задачи на определение титра вируса в ЭД₅₀ по фактическим данным, выписанным на карточки (на каждого студента по одной карточке, всего не менее 10 вариантов задач); аллантоисная жидкость куриных эмбрионов, зараженных вирусом ньюкаслской болезни; 1- процентная суспензия отмытых эритроцитов кур; физиологический раствор (изотонический раствор NaCl); плексигласовые панели с лунками; градуированные пипетки на 1 мл; резиновые груши; сосуды с дезраствором; карандаши для записи по стеклу, калькуляторы, логарифмические таблицы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме.

В лабораторных работах с вирусами, биофабричном производстве и в ветеринарной практике постоянно возникает необходимость определения количества вирусов в том или ином материале. Без такого определения невозможны экспериментальное заражение вирусами живых лабораторных систем, производство живых и инактивированных противовирусных вакцин и диагностических препаратов, оценка активности живых противовирусных вакцин, получение иммунных сывороток и многие другие работы.

Количество вируса в каком-либо материале определяют по титру вируса в этом материале. Под титром вируса понимают выражение его концентрации в материале.

Титр вируса - это количество вируса, содержащееся в единице объема материала

Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. и.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие.

Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й - инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й - инфекционные единицы 50-процентного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й - гемагглютинирующие единицы.

Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами. В случаях такого проявления инфекционной активности вирусов количество вируса может быть измерено в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ - одной оспины.

Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50-процентного инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД₅₀ - эффективная 50-процентная доза.

Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале.

Таблица 6 - Виды единиц количества вирусов при определении _ по 50-процентному инфекционному действию_

Виды инфекционного действия вирусов

Единицы количества вирусов

50-процентная летальная доза

Клинические симптомы или патологоанатомические изменения

50-процентная эмбриональная летальная доза

В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопа- тическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест- объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД50 принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6.

• 1 ЛД50 - это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);
• 1 ИД₅₀ — доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;
• 1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;
• 1 ЭИД₅о — доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;
• 1 ЦПД50 — доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).

Количество ЭД₅₀ (ЛД₅₀, ИД ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀ или ЦПД₅₀) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=10 3,4 ЦПД₅о/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 10 3 ’ 48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 10 3 ’ 48 = 3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.

Названные единицы 50-процентного инфекционного действия вируса (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию.

Титрование вирусов по 50-процентному инфекционному действию - наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов.

Задача определения титра вируса в единицах 50-процентного инфекционного действия (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.

Чтобы решить эту задачу, сначала из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. 10-кратные разведения берут по двум причинам:

во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 36), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД₅о, на значительном отрезке приближается к прямой.

Рисунок 36 - График зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса

Это означает, что в определенных пределах, центр которых в точке ЭД₅₀, между логарифмом дозы (разведения) вируса и инфекционным эффектом существует прямолинейная зависимость, т. е. величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведения), в области малых и особенно больших доз эта зависимость нарушается;

во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.

Одинаковыми объемами каждого из 10-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (мышей, куриных эмбрионов или культур клеток). При этом в каждой группе должно быть не менее 4-6 тест-объектов, так как при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).

После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50-процентный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50-процентному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД₅₀. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД₅о) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД50. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50-процентного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале.

• 1 Рассчитать титр вируса в единицах 50-процентного инфекционного действия по предложенным фактическим данным.
• 20пределить титр вируса ньюкаслской болезни в аллантоисной жидкости в единицах гемагглютинирующего действия.

Самостоятельная работа студентов

• а) подготовка панелей, пипеток и материала;
• б) получение последовательных 2-кратных разведений вируса по 0,5 мл или по 0,2 мл;
• в) добавление 1-процентной суспензии эритроцитов;
• г) учет результатов и их интерпретация. Во время экспозиции переписывание в тетрадь (с доски или таблицы) схемы титрования антител к вирусу ньюкаслской болезни в РТГА.

Подведение итогов занятия Задание к следующему занятию Контрольные вопросы

• 1 Что такое титр вируса?
• 2 Каковы единицы измерения количества вируса?
• 3 Каков принцип определения титра вируса в БОЕ и ООЕ?
• 4 В чем принцип определения титра вируса в единицах 50- процентного инфекционного действия?
• 5 Какова методика расчета титра вируса в единицах 50- процентного инфекционного действия?
• 6 В чем принцип определения титра вируса в ГАЕ?
• 7 Каковы достоинства и недостатки разных методов титрования вирусов?

Многие вирусы могут очень долго присутствовать в организме и циркулировать в крови, до поры до времени не вызывая никаких неприятностей. Однако это вовсе не значит, что они безопасны. Лабораторные анализы на вирусы позволяют выявить наличие последних, даже если никаких симптомов нет.

Анализы на вирусы: какие инфекции они выявляют

Для выявления вирусов лаборатории проводят исследования крови несколькими методами. Наибольшее распространение на сегодня получили ПЦР и иммуноферментный (ИФА) анализы.

Иммуноферментный анализ крови определяет наличие антител к вирусам (или антигенов к ним) в крови — иммуноглобулины (lgA, lgG, lgM) вырабатываются при заражении вирусами и являются своеобразными маркёрами инфекции.

Анализ на ДНК вируса, или ПЦР-исследование, позволяет выявить тип инфицирующего агента.

В качестве биоматериала для исследования обычно берут кровь. Анализ крови может подтвердить гепатит, герпес и вирус Эпштейна-Барра, аденовирус, различные половые инфекции (в том числе и сифилис), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и другие инфекции. Однако кровь не единственный биоматериал, пригодный для выявления вирусных поражений. В зависимости от заболевания и симптомов, для анализа на вирусы сдают соскоб слизистой оболочки, кал, мочу, мазок, слюну.

Как мы уже отмечали, исследование крови на вирусы можно проводить двумя разными способами. Расскажем о них подробнее.

Иммуноферментный метод анализа на вирусы позволяет установить форму болезни, вызванной вирусом (хроническая, острая или бессимптомная), а также оценить эффективность противовирусной терапии. Это один из самых распространенных и точных методов для выявления половых инфекций, в частности ВИЧ и ВПЧ, гепатита В.

Для анализа на вирусы чаще всего сдается кровь. Обязательно предупредите врача, если вы недавно проводили вакцинацию, — этот факт может отразиться на точности анализов. Рекомендуется не принимать пищу на протяжении 8-ми часов перед забором биоматериала, а также воздержаться от употребления алкоголя и от курения.

Время ожидания результатов зависит от типа вируса, на который проводится анализ, и от методики работы лаборатории. Обычно результаты готовы через 1–3 дня, но иногда приходится ждать и 2 недели.

Рассказать о том, каким образом следует трактовать результаты анализов на все виды вирусов, в рамках одной статьи невозможно. Далее мы поговорим лишь о наиболее известных заболеваниях и о часто назначаемых исследованиях.

В случае проведения анализа методом ИФА наличие IgG в крови на гепатит говорит о том, что этот вирус в организме присутствовал, но иммунная система выработала к нему антитела. Присутствие одновременно антител класса IgM и IgG говорит о заболевании в острой форме. Иммуноглобулины только класса IgM — признак первичного инфицирования.

При проведении исследования методом ПЦР определяется РНК вируса. Результаты могут быть приведены в следующем формате:

• РНК вируса не выявлена.
• РНК вируса выявлена в концентрации ниже предела количественного определения (менее15 МЕ/мл). Сомнительный результат.
• РНК вируса гепатита С выявлена (от 15 и выше 100000000 МЕ/мл).

Для выявления этого вируса гепатита чаще всего назначается ИФА. Если в крови присутствуют антитела IgG и IgM, это значит, что вирус очень активен или же заражение произошло недавно.

В случае проведения ПЦР-анализа определяется концентрация фрагментов ДНК вируса гепатита В. Пациент получает результат с одной из приведенных трактовок:

• Не обнаружено.
• Сомнительный результат (результат положительный с концентрацией ДНК вируса гепатита В на границе точности метода).
• Обнаружено.

Если говорить о трактовке ИФА, то наличие антител, обозначаемых как Anti-HSV-IgG, говорит не об иммунитете к вирусу, а о том, что вы уже были когда-то инфицированы. Этот маркёр наблюдается у большинства пациентов. Если показатель anti-HSV-IgG в пробах, взятых в динамике за 2-недельный период, заметно растет, это значит, что заражение произошло недавно. О рецидиве говорит высокий показатель IgG.

Расшифровка анализа крови на ВИЧ очень проста — если результат отрицательный, это значит, что вирус не обнаружен, если положительный — увы, вирус в крови есть. Но следует знать, что сегодня даже самые надежные методы точны лишь на 98–99%, то есть всегда остается шанс, что результат будет, например, ложноположительным.

При анализе на аденовирус, вызывающий респираторные заболевания, применяется в основном ИФА. В ходе анализа подсчитываются IgG-антитела. Если показатель менее 0,8 условных единиц — результат отрицательный, более 0,8 — положительный.

Не пре­не­бре­гай­те про­фи­лак­ти­чес­ки­ми ана­ли­за­ми на ви­ру­сы. Ран­нее вы­яв­ле­ние ин­фек­ции по­зво­ля­ет от­сро­чить или по­да­вить раз­ви­тие за­бо­ле­ва­ния. В слу­чае же бе­ре­мен­нос­ти сда­ча био­ма­те­ри­а­ла на ана­лиз с целью вы­яв­ле­ния ви­рус­ных ин­фек­ций яв­ля­ет­ся обя­за­тель­ной про­це­ду­рой. По­во­дом для про­хож­де­ния ис­сле­до­ва­ния так­же мо­жет стать по­вы­шен­ный уро­вень лей­ко­ци­тов в кро­ви, сдвиг лей­ко­ци­тар­ной фор­му­лы, уве­ли­че­ние ко­ли­чест­ва нейтро­фи­лов (па­лоч­ко­ядер­ных), ми­е­ло­ци­тов и ме­та­ми­е­ло­ци­тов, сни­же­ние чис­ла лим­фо­ци­тов при вы­со­кой СОЭ в ре­зуль­та­тах кли­ни­чес­ко­го ана­ли­за кро­ви.

Титр вируса — это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. п.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие.

Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й — инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й — инфекционные единицы 50%-ного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й — гемагглютинирующие единицы.

Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД50— эффективная 50%-ная доза. Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале.

В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест-объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД50 принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6.

1 ЛД50—это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);

1 ИД50—доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;

1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;

1 ЭИД50—доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;

1 ЦПД50— доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).

Количество ЭД50 (ЛД50, ИД ЭЛД50, ЭИД50 или ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=103,48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103'48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 103,48=3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.

Названные единицы 50%-ного инфекционного действия вируса (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию.

Титрование вирусов по 50%-ному инфекционному действию — наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов.

Задача определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.

Чтобы решить эту задачу, сначала из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. 10-кратные разведения берут по двум причинам:

во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 35), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД50, на значительном отрезке приближается к прямой.

Это означает, что в определенных пределах, центр которых в точке ЭД50, между логарифмом дозы (разведения) вируса и инфекционным эффектом существует прямолинейная зависимость, т. е. величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведения), в области малых и особенно больших доз эта зависимость нарушается;

во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.

Одинаковыми объемами каждого из 10-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (мышей, куриных эмбрионов или культур клеток). При этом в каждой группе должно быть не менее 4—6 тест-объектов, так как при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50%-ный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50%-ному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД50. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД50) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД50. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50%-ного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале