Отбор проб для исследования на грипп птиц

Приложение
к приказу Минсельхоза РФ
от 3 апреля 2006 г. N 105

Ветеринарные правила
лабораторной диагностики гриппа А птиц

1. Область применения

1.1. Настоящие Правила устанавливают обязательные требования к организации лабораторной диагностики гриппа А птиц (далее - грипп птиц).

1.2. Положения настоящих правил обязательны для выполнения на территории Российской Федерации органами государственной власти, предприятиями или иными хозяйствующими субъектами, учреждениями, организациями, общественными объединениями, независимо от их подчинения и форм собственности, должностными лицами и гражданами.

2. Общие положения

2.1. Диагностические лабораторные исследования и серологические тесты по определению напряженности поствакцинального иммунитета (далее - лабораторные тесты) проводят в специализированных ветеринарных учреждениях.

2.2. Лабораторная диагностика гриппа птиц направлена на выявление в исследуемых объектах ветеринарного надзора:

вируса гриппа птиц;

РНК вируса гриппа птиц;

антигенов вируса гриппа птиц;

антител к вирусу гриппа птиц.

2.3. При проведении лабораторных тестов могут быть использованы методы лабораторных исследований, применяющие:

тесты, утвержденные в установленном порядке;

тесты, которые реализуются с использованием тест-систем, зарегистрированных в установленном порядке в Российской Федерации.

3. Обязательные требования по отбору проб для проведения диагностики гриппа птиц

3.1. Отбор проб крови и патологического материала проводит ветеринарный работник, имеющий специальную подготовку.

3.2. Пробы маркируются и опечатываются. К пробам прилагается сопроводительный документ, содержащий сведения о дате и месте отбора проб, юридическом или физическом лице - владельце птицы и месте его нахождения, виде, возрасте птицы и ее состоянии на момент отбора проб.

3.3. Для проведения исследований осуществляют отбор проб патологического материала (органы, ткани головного мозга, легких, трахеи, селезенки, участков кишечника, почек, сердца) от павшей или убитой с диагностической целью птицы.

3.4. От каждого стада птицы отбирают для исследовании 5-10 трупов или патологический материал от 5-10 трупов, клоакальные и/или трахеальные смывы от 10-15 голов, 1-10 сборных проб помета от стада.

У мелких видов птиц для отбора проб используют свежий помет.

Пробу помета рекомендуется отбирать из расчета 1 грамм помета на 60 точек птичника (выгула или вольеры), выбранных по диагонали крест-накрест.

3.5. Пробы крови для определения антител к вирусу гриппа птиц рекомендуется отбирать у 25-30 птиц из стада (партии), из одного птичника (зала) или одного населенного пункта, местности (водоема).

Пробы крови отбирают из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре, или в термостате при 37°С в течение 1-2 часов, затем обводят иглой или пастеровской пипеткой, отслаивая сгусток крови от стенок пробирки, и оставляют на 16-18 часов при температуре 2-4°С. Образовавшуюся прозрачную без признаков гемолиза сыворотку отбирают с помощью пипетки в отдельные, чистые пробирки.

Отбор крови допускается проводить с помощью иглы и шприца (или вакуумной пробирки).

Рекомендуется проводить центрифугирование проб крови для получения сыворотки в течение 10-15 минут при 1000 об/мин для осаждения свободных эритроцитов.

Для серодиагностики используют парные пробы сывороток крови, полученные от больных или инфицированных птиц, в начале заболевания и через 4-10 дней.

3.6. Пробы транспортируются во влагонепроницаемой таре, в контейнере с хладоэлементами или в термосе со льдом. Допускается однократное замораживание сывороток.

При транспортировке проб соблюдают установленные ветеринарно-санитарные правила и меры безопасности, предъявляемые к транспортировке биологических материалов, содержащих инфекционные агенты 3 группы патогенности.

3.7. Если немедленное исследование проб невозможно, допускается сохранять образцы на протяжении 4 дней при температуре 4°С.

При необходимости для увеличения срока хранения диагностические образцы и/или изолят помещают в морозильную камеру с температурой -80°С.

4. Методы и сроки проведения лабораторных исследований

4.1. Для установления диагноза на грипп птиц допускается применение следующих методов:

а) для выявления вируса гриппа птиц - биопроба на СПФ (свободных от патогенной микрофлоры) - цыплятах с обязательным последующим подтверждением специфичности биологической реакции;

б) для выделения вируса гриппа птиц - метод выделения вируса на СПФ - куриных эмбрионах или в культуре клеток;

в) для обнаружения антигенов вируса гриппа птиц;

иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения одного или нескольких белков вируса;

иммунопреципитация (двойная иммунодиффузия по Оухтерлони (далее - РДП) или иммуноэлектроосмофорез (далее - ИЭОФ);

иммунохроматографические методы (далее - ИХА);

радиоиммунный анализ (далее - РИА);

непрямая гем- и латексагглютинация;

реакция связывания комплемента (далее - РСК);

г) для обнаружения гемагглютинина (гемагглютинирующей активности) вируса гриппа птиц:

реакция гемагглютинации (далее РГА) с подтверждением специфичности в реакции торможения гемагглютинации (РТГА);

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину;

д) для обнаружения РНК вируса:

полимеразная цепная реакция (далее - ПЦР);

ПЦР с последующим секвенированием ее продуктов;

Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;

е) для обнаружения антител к вирусу гриппа птиц:

ж) для субтипирования вируса по гемагглютинину и нейраминидазе:

сиквенс к ДНК или ПЦР-продукта;

Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину;

з) для субтипирования противовирусных антител по гемагглютинину:

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину.

4.2. Применение иных тестов допускается для получения предварительных результатов.

4.3. Методы проведения лабораторных исследований реализуются на основе утверждаемых в установленном порядке методик проведения обязательных диагностических исследований.

4.4. Сроки проведения лабораторных исследований устанавливаются в зависимости от метода исследования и не могут превышать 1 месяца.

федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору

В данном разделе размещаются актуальные версии нормативно-правовых актов (законы, приказы, указы, решения Верховного суда РФ и др.), представляющие интерес для специалистов в области ветеринарии и фитосанитарии.

Дополнительную информацию Вы можете получить, задав вопрос в разделе "Электронная приемная".

"Об утверждении ветеринарных правил лабороторной диагностики гриппа А птиц"

Приказ. Об утверждении ветеринарных правил лабороторной диагностики гриппа А птиц
Приложение. Ветеринарные правила лабороторной диагностики гриппа А птиц
1. Статья 1. Область применения
2. Статья 2. Общие положения
3. Статья 3. Обязательные требования по отбору проб для проведения диагностики гриппа птиц
4. Статья 4. Методы и сроки проведения лабораторных исследований

В целях повышения эффективности борьбы с гриппом птиц и в соответствии с пунктом 5.2.11 Положения о Министерстве сельского хозяйства Российской Федерации, утвержденного Постановлением Правительства Российской Федерации от 24 марта 2006 г. N 164 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2006, N 14, ст. 1543), приказываю:

утвердить Ветеринарные правила лабораторной диагностики гриппа A птиц согласно приложению.

Министр
А.В.ГОРДЕЕВ

1.1. Настоящие Правила устанавливают обязательные требования к организации лабораторной диагностики гриппа A птиц (далее - грипп птиц).

вируса гриппа птиц;

РНК вируса гриппа птиц;

антигенов вируса гриппа птиц;

антител к вирусу гриппа птиц.

тесты, утвержденные в установленном порядке;

3.4. От каждого стада птицы отбирают для исследований 5 - 10 трупов или патологический материал от 5 - 10 трупов, клоакальные и/или трахеальные смывы от 10 - 15 голов, 1 - 10 сборных проб помета от стада.

У мелких видов птиц для отбора проб используют свежий помет.

3.5. Пробы крови для определения антител к вирусу гриппа птиц рекомендуется отбирать у 25 - 30 птиц из стада (партии), из одного птичника (зала) или одного населенного пункта, местности (водоема).

Пробы крови отбирают из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре или в термостате при 37 град. C в течение 1 - 2 часов, затем обводят иглой или пастеровской пипеткой, отслаивая сгусток крови от стенок пробирки, и оставляют на 16 - 18 часов при температуре 2 - 4 град. C. Образовавшуюся прозрачную без признаков гемолиза сыворотку отбирают с помощью пипетки в отдельные, чистые пробирки.

Отбор крови допускается проводить с помощью иглы и шприца (или вакуумной пробирки).

Рекомендуется проводить центрифугирование проб крови для получения сыворотки в течение 10 - 15 минут при 1000 об./мин. для осаждения свободных эритроцитов.

3.7. Если немедленное исследование проб невозможно, допускается сохранять образцы на протяжении 4 дней при температуре 4 град. C.

При необходимости для увеличения срока хранения диагностические образцы и/или изолят помещают в морозильную камеру с температурой -80 град. C.

4.1. Для установления диагноза на грипп птиц допускается применение следующих методов:

иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения одного или нескольких белков вируса;
иммунопреципитация (двойная иммунодиффузия по Оухтерлони (далее - РДП) или иммуноэлектроосмофорез (далее - ИЭОФ);
иммунохроматографические методы (далее - ИХА);
радиоиммунный анализ (далее - РИА);
непрямая гем- и латексагглютинация;
реакция связывания комплемента (далее - РСК);

реакция гемагглютинации (далее - РГА) с подтверждением специфичности в реакции торможения гемагглютинации (РТГА);
ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину;

полимеразная цепная реакция (далее - ПЦР);
ПЦР с последующим секвенированием ее продуктов;
Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;

ИФА;
РДП и ИЭОФ;
ИХА;
РИА;
РТГА;
РСК;

РТГА;
сиквенс к ДНК или ПЦР-продукта;
ПЦР;
Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;
ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину; з) для субтипирования противовирусных антител по гемагглютинину:
1. РТГА;
2. ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину.

4.2. Применение иных тестов допускается для получения предварительных результатов.

Текст ГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа

24 руб. БЗ 9—91/1009

ПТИЦА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ, СИНАНТРОПНАЯ, ДИКАЯ И ЭКЗОТИЧЕСКАЯ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА

ГОСТ 25581—91

КОМИТЕТ СТАНДАРТИЗАЦИИ И МЕТРОЛОГИИ СССР

УДК 636.5.001,4:006.354 Группа С79

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПТИЦА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ, СИНАНТРОПНАЯ, ДИКАЯ И ЭКЗОТИЧЕСКАЯ

Методы лабораторной диагностики гриппа

Birds, poultry, synanthropos, game and exotic. Methods of Avian Influenza laboratory diagnostics

Дата введения 01.01.93

Настоящий стандарт распространяется на сельскохозяйственную, синантропную, дикую и экзотическую птицу и устанавливает методы лабораторной диагностики гриппа.

1.1. Для проведения исследований отбирают пробы патологического материала:

головной мозг и селезенку или гортанные и клоакальные смывы от больной птицы в первые два дня заболевания или от птицы в агональном состоянии. Патологический материал помещают в термос со льдом или раствор глицерина с массовой долей 50 %, приготовленный на физиологическом растворе с pH 7,2—7,4;

сыворотку крови больной и переболевшей птицы в количестве 1—2 см 3 (не менее 20 проб).

1.2. Пробы крови для определения антител в сыворотке берут стерильно из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре или термостате при 37 °С в течение 1—2 ч, затем осторожно обводят иглой или пастеровской пипеткой по стенке пробирки и оставляют на 16—18 ч при температуре 2—4 °С Образовавшуюся прозрачную без гемолиза сыворотку отсасывают пипеткой в стерильные пробирки.

Для ретроспективной диагностики используют парные пробы сывороток крови, полученные от больных и подозреваемых в заболевании птиц в начале заболевания и через 4—10 сут.

1.3. Пробы патологического материала и сывороток крови доставляют в лабораторию в термосе со льдом. К пробам прилагают сопроводительный документ, содержащий сведения о клинике, эпизоотологии заболевания, а также данные о результатах вскрытия трупов.

1.4. До начала лабораторного исследования патологический материал хранят в рефрижераторе при температуре 2—4*°С не более 24 ч.

1.5. Сыворотку крови исследуют в течение 3 сут со дня взятия крови. В случае исследования сыворотки в более поздние сроки ее замораживают или консервируют путем добавления мертиолата натрия до концентрации 1 : 10000.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сущность метода заключается в выделении вируса на эмбрионах кур и последующей его идентификации.

2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Термостат с температурой нагрева 37—38 ^С.

Центрифуга с частотой вращения ЗООО^ 1 .

Центрифужные стаканы вместимостью 50—100 см 3 .

Весы лабораторные с погрешностью взвешивания не более 0,1 г,

Колбы конические стеклянные вместимостью 100 см 3 по ГОСТ 1770.

Пробирки стеклянные вместимостью 10, 15, 20 см 3 по ГОСТ

Пипетки пастеровские или пипетки стеклянные измерительные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см 3 по ГОСТ 20292.

Шприцы с иглами.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233, раствор с массовой долей 0,8 % или другие дезинфицирующие средства.

Натрий лимонно-кислый 3-х замещенный по ГОСТ 22280, раствор с массовой долей 5 %.

Иод по ГОСТ 4159, раствор с массовой долей 5 % на физиологическом растворе.

Антибиотики — пенициллин и стрептомицин.

Среды питательные МПБ и МПА.

Развивающиеся эмбрионы кур 9—10-суточного возраста.

Эритроциты кур на физиологическом растворе, 0,7 и 1 % -ная взвесь, которую готовят следующим образом: кровь берут у петухов или кур в возрасте старше 6 мес из подкрыльцовой вены в колбу с физиологическим раствором в равных объемах с раствором лимонно-кислого натрия.

Полученную кровь трижды отмывают физиологическим раствором, осаждая эритроциты центрифугированием с частотой вращения 1500

! в течение 10 мин. Из осадка эритроцитов готовят 0,7 или 1 %-ную суспензию на физиологическом растворе и хранят не более 5 сут при температуре 4°С.

2.1.2. Подготовка к исследованию.

2.1.2.1. Обработка органов патологического материала

Патологический материал стерильно извлекают из глицеринового раствора, трехкратно ополаскивают стерильным физиологическим раствором и гомогенизируют с помощью размельчителя тканей или размельчают в ступке с кварцевым стеклом. Гомогенат разводят 1 : 10 стерильным физиологическим раствором и центрифугируют с частотой вращения 1500—2000 -1 в течение 15 мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильные пробирки, добавляют 1000 ед/см 3 стрептомицина и выдерживают при комнатной температуре 60 мин.

2.1.3. Проведение исследования

Для исследования одной пробы материала (надосадочная 10 %-ная суспензия) заражают не менее 10 эмбрионов. Перед заражением эмбрионы предварительно овоскопируют, отмечая границу пуги и участок между кровеносными сосудами для прокола скорлупы и инокуляции исследуемого материала. Скорлупу со стороны пуги и место прокола дезинфицируют раствором йода и фламбируют. В центре воздушного пространства и в месте введения исследуемого материала делают пробойником отверстия, затем через боковое отверстие вводят 0,2 см 3 исследуемого материала на глубину 2—3 мм в аллантоисную полость. Одновременно делают его высевы по 0,2 см 3 на питательные среды МПВ и МПА, которые помещают в термостат при 37—38 °С. Контролем служат 5 незараженных эмбрионов. После заражения эмбрионов отверстия в скорлупе заливают парафином. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубируют в термостате в течение 24—96 ч при температуре 37—38 °С и относительной влажности 60—-70 %. В процессе инкубации эмбрионы овоскопируют два раза в сутки, погибшие— сохраняют в холодильнике при 4 °С. Через 96 ч инкубации все эмбрионы вскрывают после предварительного охлаждения в холодильнике при 4 °С в течение 10—12 ч.

Перед вскрытием эмбрионов скорлупу обрабатывают йодом и фламбируют и из каждого эмбриона отдельно собирают экстра-эмбриональную жидкость в стерильные пробирки, которую высевают на МПБ и МПА и проверяют на гемагглютинирующую активность вируса в капельной реакции гемагглютинации (РГА). Реакцию ставят на стекле путем смешивания равных капель экст-раэмбриональной жидкости с 1 %-ной взвесью эритроцитов кур. При отрицательной РГА образцы экстраэмбриональной жидкости в количестве 1—2 см 3 от каждого зараженного эмбриона (не менее 5 эмбрионов) объединяют и вновь заражают не менее 10 эмбрионов.

Выделение вируса проводят в течение 3-х пассажей на куриных эмбрионах, проверяя в каждом пассаже экстраэмбриональную жидкость на наличие гемагглютининов в капельной РГА. Если титры гемагглютининов низкие, проводят еще 2—3 дополнительных пассажа.

2.1.4. Обработка результатов

Результат исследования пробы патологического материала считают отрицательным, если в трех дополнительных пассажах не будет обнаружено гемагглютинации эритроцитов.

При наличии гемагглютинации эритроцитов проводят идентификацию выделенного вируса.

Сущность метода заключается в способности вируса гриппа птиц агглютинировать эритроциты кур.

2.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

2.2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы — по п. 2.1.1 и дополнительно:

микротитратор типа Такачи или аналогичный;

панели из плексигласа.

2.2.2. Проведение исследования

Готовят двукратные разведения вирусосодержащего материала (надосадочную жидкость, полученную после обработки патологического материала как указано в п. 2.1.2.1.) от 1 : 2 до 1 : 1024. Для этого в ряд лунок панелей из плексигласа наливают физиологический раствор в объеме 0,2 см 3 . В первую лунку вносят 0,2 см 3 вируса, трехкратно пипетируют и переносят 0,2 см 3 во вторую лунку и т. д. до требуемого разведения. Из последней лунки 0,2 см 3 удаляют в дезинфицирующий раствор. В каждую лунку добавляют по 0,2 см 3 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов. Панели встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

Контролем служат две лунки с эритроцитами и физиологическим раствором в равных объемах по 0,2 см 3 каждого. Реакцию гемагглютинации и реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) ставят также с использованием микротитраторов или микропипе

ток в объеме 0,025 см 3 в плексигласовых панелях с лунками с 0,7 %-ной суспензией эритроцитов.

2.2.3. Обработка результатов

Титром вируса считают предельное разведение его, при котором наблюдается полная агглютинация эритроцитов, что соответствует одной агглютинирующей единице (1 АЕ).

Сущность метода заключается в способности специфических антител нейтрализовать гем агглютинирующую активность вируса в реакции торможения гемагглютинации со специфическими гриппозными сыворотками.

2.3.1. Аппаратура, материалы и реактивы

2.3.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы — по п. 2.2.1 и дополнительно:

набор сухих инактивированных антигенов вируса гриппа тринадцати серологических вариантов и гипериммунных сывороток для диагностики гриппа птиц;

кислота соляная по ГОСТ 3118 с массовой долей 30%.

2.3.2. Проведение исследования

После определения титра исследуемого вируса в количественной РГА по п. 2.2.1 ставят РТГА. Вначале устанавливают рабочую дозу вируса (4 АЕ), для чего вирус разводят физиологическим раствором во столько раз, сколько получится от деления на 4 обратного значения гемагглютинирующего титра вируса. Например: если титр вируса 1 : 256, то рабочее разведение будет 256 : 4 = = 64, т. е. в 0,2 см 3 разведенного 1 : 64 вируса будет содержаться 4 АЕ. Для его приготовления в данном примере берут 63 см 3 физиологического раствора и 1 см 3 исходного вируса.

Перед постановкой основного опыта проверяют правильность выбора 4 АЕ. Для этого на панели в четыре лунки наливают по 0,2 см 3 физиологического раствора, затем в первую лунку добавляют 0,2 см 3 4 АЕ вируса и после пипетирования 0,2 см 3 переносят во вторую лунку, затем в третью и т. д. Из четвертой лунки 0,2 см 3 разведенного вируса удаляют в дезинфицирующий раствор. Таким образом, в первой лунке должно быть 2 АЕ, во второй— 1 АЕ, в третьей — 0,5 АЕ, в четвертой — 0,25 АЕ. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 см 3 1 %-ной суспензии эритроцитов. Панель встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. При правильном определении рабочей дозы (4 АЕ) в пер

Если в третьей лунке оказывается полная агглютинация, то это означает, что выбранная доза вируса содержит не 4 АЕ, а больше. В этом случае доза должна быть уменьшена. И наоборот, отсутствие агглютинации во второй и частично в третьей лунках свидетельствует о недостаточности вируса. Увеличивают или уменьшают рабочую дозу, добавляя соответственно вирус или физиологический раствор и затем повторно проверяют правильность выбора 4 АЕ.

2.3.3. Для постановки основного опыта в ряд лунок, начиная со второй, наливают по 0,2 см 3 физиологического раствора. Затем в первую и вторую лунки добавляют по 0,2 см 3 специфической сыворотки. Во второй лунке смесь пипетируют и переносят 0,2 см 3 в третью лунку и т. д. до требуемого разведения. После этого во все лунки вносят по 0,2 см 3 рабочего разведения вируса (4 АЕ). Панели встряхивают и после 30-минутного контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют по 0,4 см 3 1 %-ной суспензии эритроцитов.

Для точности учета РТГА ставят контроль:

сыворотки (0,2 см 3 сыворотки + 0,2 см 3 физиологического раствора и 0,4 см 3 1 %-ной суспензии эритроцитов);

эритроцитов на спонтанную агглютинацию (0,2 см 3 физиологического раствора ±0,2 см 3 1 %-ной суспензии эритроцитов).

2.3.4. Обработка результатов

РТГА считают положительной, а идентификацию вируса завершенной, если специфическая сыворотка тормозит гемагглютиниру-ющую активность вируса не менее 1/4—1/8 титра, указанного на этикетке ампулы (флакона).

Сущность метода заключается в обнаружении специфической способности антител сыворотки крови больных и переболевших птиц подавлять гемагглютинирующую активность вируса в РТГА. С этой целью исследуют в РТГА с диагностическими антигенами вируса гриппа не менее 20 проб сыворотки крови от каждой обследуемой партии птиц.

2.4.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы — по пп. 2.1.1, 2.3.1 и дополнительно:

2.4.2. Подготовка к исследованию

Исследуемые сыворотки предварительно разводят в соотношении 1 : 5 дистиллированной водой. Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотки прогревают в водяной бане при 60 °С в

2.4.3. Проведение исследования

Вначале готовят двухкратное разведение сыворотки на физиологическом растворе, начиная с разведения 1 : о. Далее ставят РТГА, как указано в п. 2.3,

При обнаружении в сыворотке крови титров антител 1 : 10 и выше, ее освобождают от неспецифических термостабильных ингибиторов с целью подтверждения наличия специфических антител к вирусу гриппа. Для удаления термостабильных ингибиторов через разведенную и прогретую сыворотку крови пропускают углекислый газ из аппарата Киппа или добавляют кусочки сухого льда. Обработку сыворотки ведут в течение 2—3 мин: Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием в течение 10 мин с частотой вращения 15О0*” 1 . Надосадочную жидкость исследуют в РТГА.

2.4.4. Обработка результатов

Титром антител в сыворотке считают ее последнее разведение, давшее полную задержку гемагглютинации с исследуемым антигеном.

Выявление титра антител 1 : 10 и выше, но не менее, чем в 30 % исследованной сыворотки является основанием для постановки диагноза, который должен быть подтвержден положительным результатом вирусологических исследований.

Сущность метода заключается в обнаружении достоверного прироста уровня специфических антител, обусловленного естественным развитием гриппозной инфекции в организме зараженных птиц.

2.5.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы — по п. 2.2.1.1.

2.5.2. Проведение исследований

Исследуют парные сыворотки, полученные в первые 1—2 сут в начале заболевания и через 4—10 сут после первого взятия крови. Сыворотку крови освобождают от ингибиторов как указано з п. 2 4 РТГА ставят с выделенным виоусом .или с антигенами диагностического набора по пп. 2.3 и 2.4 с учетом эпизоотической обстановки по циркуляции того или иного серологического вариап-1 а вируса гриппа.

2.5.3. Обработка результатов

Четырехкратное и более увеличение титров антител в парных сыворотках является основанием для установления положительного диагноза.

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Московской ветеринарной академией им. К. И. Скрябина и Всесоюзным государственным научноконтрольным институтом ветеринарных препаратов

Н. Г. Осидзе, д-р биол. наук; В. И. Смоленский, канд. вет. наук

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 30.09.91 № 1575

3. Срок проверки— 1996 г., периодичность проверок — 5 лет

4. ВЗАМЕН ГОСТ 25581—83

5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

1.1. Лабораторный мониторинг гриппа птиц - комплекс лабораторно-диагностических исследований по выявлению, циркулирующих на территории Российской Федерации, штаммов вируса гриппа птиц.

1.2. Лабораторный мониторинг проводится в рамках мероприятий по предупреждению гриппа птиц на территории Российской Федерации.

1.3. Лабораторно-диагностические исследования проводятся в соответствии с Ветеринарными правилами лабораторной диагностики гриппа А птиц, Правилами по борьбе с гриппом птиц, Правилами по организации и проведению профилактических мероприятий по предупреждению гриппа птиц на территории Российской Федерации.

1.4. Лабораторный мониторинг осуществляется, в соответствии с установленными полномочиями, организациями, входящими в систему государственной ветеринарной службы Российской Федерации.

2.1. Исследования на грипп птиц проводят в ветеринарных лабораториях, имеющих необходимое оборудование, кадровый состав, диагностические наборы.

2.3. ФГУ ЦМВЛ является учреждением, осуществляющим методическое руководство деятельностью межобластных ветеринарных лабораторий и ветлабораторий субъектов Российской Федерации (областных, краевых, республиканских) при проведении мониторинга, сбор и обработку данных, составление сводного отчета по результатам исследований на грипп птиц.

2.4. Составление сводного плана мониторинга возлагается на ФГУ Центральную научно-методическую ветеринарную лабораторию. Сводный План мониторинга утверждается руководителем Россельхознадзора.

Ветеринарные лаборатории субъектов Российской Федерации, ФГУ межобластные ветеринарные лаборатории разрабатывают совместно с территориальными управлениями Россельхознадзора и органами управления в ветеринарии в субъектах Российской Федерации, на основании Методических рекомендации по лабораторному мониторингу гриппа птиц в Российской Федерации, план мониторинга по гриппу на следующий календарный год к 1 декабря текущего года. Одновременно с планом субъектовые ветлаборатории составляют и передают в Межобластные ветеринарные лаборатории, данные о потребности в диагностических препаратах для диагностики гриппа птиц (ИФА, РТГА, РДП, ПЦР) с учетом объемов планируемых исследований, птицепоголовья в птицеводческих хозяйствах и населенных пунктах, обследования водоемов и периодичности отбора проб согласно настоящему порядку мониторинга.

ФГУ межобластные ветеринарные лаборатории составляют сводный план по региону обслуживания с учетом собственных исследований и направляют его к 10 декабря текущего года в ФГУ ЦНМВЛ вместе с информацией о потребностях в диагностических наборах.

ФГУ ЦНМВЛ составляет и направляет в Россельхознадзор сводный план мониторинга, информацию о потребности в диагностических наборах для выполнения работ по мониторингу гриппа птиц по каждому региону.

3.1. Исследованию подлежит птица промышленных стад и племенных птицехозяйств, частного сектора (с индивидуальных подворий), птица, содержащаяся в птицепитомниках, зоосадах, синантропная птица, обитающая на территории птицехозяйств, птица, ввозимая на территорию Российской Федерации, а также при купле-продаже внутри страны, ввозимое на территорию Российской Федерации инкубационное яйцо.

3.2. В период карантина (в течение 21 дня) для исследования на наличие антител к вирусу гриппа птиц типа А отбирают не менее 25 проб сывороток крови от каждой партии птицы (если партия составляет более 1000 особей); при поставке от 10 до 1000 голов птицы - 10 проб; менее 10 - пробы крови отбираются от каждой птицы

3.3. При ввозе на территорию Российской Федерации эмбрионов и инкубационного яйца для контроля на грипп используют метод ПЦР - диагностики. С этой целью отбираются трахеальные и клоакальные смывы от 25 птиц, 30 эмбрионов/инкубационных яиц. Для исследования рекомендуется формировать объединенные пробы: одну пробу из смывов от 5 голов птиц, одну пробу из 5 эмбрионов/ инкубационных яиц.

3.4. Серологическое обследование мелких видов птиц (волнистые попугайчики, канарейки и др.) не проводят, а в период их содержания в карантине (в течение 21 дня) осуществляют отбор проб помета в зависимости от ввозимой партии. Отбор проб рекомендуется проводить индивидуально от каждой птицы или в виде общей пробы от птиц, содержащихся в одной вольере/клетке. В данном случае также можно отбирать клоакальные и/или трахеальные смывы, при этом отбор проб проводится аналогично отбору проб сывороток крови п. 3.2

3.5. Схемы серологического обследования птицеводческих хозяйств и подворий.

В благополучных племенных и товарных птицеводческих предприятиях яичного и мясного направления (куроводческих, индейководческих, гусеводческих и др.) отбирается от каждого стада птицы, содержащейся в одном птичнике (зале корпусе), по 25 проб крови.

В страусоводческих хозяйствах обследованию подлежат 15 % от стада взрослой птицы и 10 % от молодняка.

Отбор проб в бройлерных хозяйствах проводится в момент убоя птицы, в количестве не менее 25 проб сыворотки крови от стада птицы из одного птичника (зала).

В личных хозяйствах граждан отбирается не менее 25 проб сыворотки крови от птицы из одного населенного пункта, если количество птицы в населенном пункте более 100 голов, при этом необходимо обеспечить сбор проб крови от птицы из разных дворов, если в населенном пункте разведением птицы занимаются одновременно несколько граждан.

В населенных пунктах, где поголовье птицы составляет менее 100 голов, серологическое обследование не проводят. В данных населенных пунктах ведется наблюдение за клиническим состоянием птицы. В случае обнаружения признаков заболевания отбирается материал для лабораторного исследования в соответствии с пунктом 3.7.

На территории крупных птицеводческих хозяйств, комбикормовых предприятий отбирать по 10 проб крови от синантропных птиц (голуби, воробьи и др.).

3.6. В случае получения положительных результатов серологических исследований проводится отбор проб для вирусологических исследований и ПЦР диагностики в соответствии с пунктом 3.7.

4.1. Мониторинг дикой птицы необходимо проводить сезонно: весна, лето, осень (т.е. весенняя миграция, гнездование после вылупления птенцов, осенняя миграция) с привлечением зоологов и специалистов охотоуправлений в субъектах Российской Федерации.

4.2. Во время сезонных совместных экспедиций ветеринарных специалистов, зоологов и специалистов охотоуправлений в субъектах Российской Федерации пробы рекомендуется отбирать в местах массового гнездования птиц, зимовок, а также на пути основных миграционных маршрутов. Видовой состав птицы, подлежащей мониторингу, определяется в соответствии с особенностями каждого региона с привлечением специалистов охотоуправлений или зоологов. Исследованиям подвергается синантропные (воробьи, голуби, грачи, вороны), полусинантропные (чайки), а также дикие мигрирующие виды водоплавающих и околоводных птиц (утки, гуси, массовые виды куликов, колониально гнездящиеся цапли и др.). Периодичность отбора проб указана в п. 5. От отловленных птиц рекомендуется отбирать пробы сывороток крови, клоакальные и/или трахеальные смывы. Отловленные нетравмированные птицы, если применялся метод живоотлова, в случае отрицательного результата отпускаются. В случае положительного результата птицы умерщвляются бескровным методом и отправляются в лабораторию для дальнейших исследований. При проведении отстрела птиц или в случае их умерщвления в диагностических целях, берутся клоакальные, трахеальные смывы и пробы патматериала.

Помет от дикой птицы, а также клоакальные, трахеальные смывы и патматериал исследуются методом ПНР.

4.3. Для предупреждения отстрела редких видов птиц в составе совместной экспедиции включается специалист-орнитолог, зоолог или охотовед.

4.4. При выявлении в дикой природе случаев внезапного падежа птиц или в случае обнаружения, при клиническом обследовании птицы на водоемах, характерных клинических признаков болезни, проводится отбор патматериала на вирусовыделение и для ПНР диагностики.

5.1. Домашняя птица обследуется: в благополучных регионах - 2 раза в год; в неблагополучных регионах и в угрожаемой зоне - один раз в месяц (каждый птичник, каждый населенный пункт); ввозимая из-за рубежа птица, эмбрионы, инкубационное яйцо - при ввозе, в период карантинирования.

5.2. Дикая птица обследуется: в благополучных регионах - 3 раза в год (весна, лето, осень); в неблагополучных районах - 1 раз в квартал.

6.1. Иммуноферментный анализ (непрямой метод ИФА для выявления антител к гриппу типа А) - исследуют сыворотки крови с целью выявления антител к вирусу гриппа птиц у кур из птицеводческих предприятий, фермерских хозяйств, населенных пунктов и ввозимых из-за рубежа; патологический материал, экстраэмбриональную жидкость зараженных куриных эмбрионов на наличие вируса гриппа птиц.

6.2. Иммуноферментный анализ (конкурентный метод ИФА для выявления антител к гриппу птиц Н5) - исследуются сыворотки крови различных видов птиц на наличие антител к гриппу птиц Н5.

6.2. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) - исследуют сыворотки крови кур реагирующих положительно в ИФА; сыворотки крови других видов птиц (гусей, уток, индеек, голубей, дикой птицы и др.).

6.3. Реакция диффузионной преципитации (РДП) - исследуют сыворотки крови с целью выявления антител к вирусу гриппа у птиц различных видов. РДП может быть использована для выявления вируса гриппа птиц при исследовании патматериалов и для идентификации изолятов при проведении вирусологических исследований.

6.4. Полимеразноцепная реакция (ПЦР) - исследования проводят:

- при внезапном падеже птицы или характерных для гриппа клинических признаках; при получении у птиц положительных результатов серологических исследований в ИФА и РТГА;

- с целью определения типа гемагглютинина и нейраминидазы выделенных штаммов (ВНИИЗЖ, ВГНКИ).

- при исследовании мяса птицы, полуфабрикатов, субпродуктов, яйца, куриных эмбрионов;

- при исследовании комбикормов и мясокостной муки.

6.5. Серологические и вирусологические исследования рекомендуется проводить согласно действующей нормативной документации и наставлений к диагностическим наборам. РТГА проводится с обязательной постановкой контроля проб сывороток крови на спонтанную агглютинацию. Сыворотка крови обрабатывается обязательно от термолабильных и, в случае необходимости, от термостабильных ингибиторов.

6.6. Диагностические наборы (ИФА, РТГА, РДП и ПЦР) получают ФГУ ЦНМВЛ, межобластные ветлаборатории и ветлаборатории субъектов Российской Федерации в соответствии с заявками.

7.1. Отбор проб сывороток крови и патологического материала от всех категорий птицы организуют совместно специалисты СББЖ и районных, межрайонных, зональных ветеринарных лабораторий или диагностических кабинетов. Отбор проб осуществляет ветеринарный специалист, имеющий специальную подготовку.

7.2. Отбор проб сывороток крови. Отбор проб крови у птиц осуществляется в соответствии с планом мониторинга из подкрыльцовой вены или при забое птицы, взятие проб крови у больной или подозреваемой в заражении птицы проводят с соблюдением требований безопасности. Транспортировка проб сывороток крови в лабораторию осуществляется в стеклянных или пластиковых пробирках, закрытых крышками (пробками). Пробирки маркируются. В сопроводительном документе указывается: вид и возраст птицы, наименование предприятия и адрес (ФИО владельца, адрес), количество проб, дата отбора проб.

7.3. Отбор проб патологического и биологического материалов. При подозрении на грипп птиц (наличие клинических, патологоанатомических признаков заболевания, внезапного падежа) осуществляют отбор проб патматериала: головной мозг, легкие, трахея, селезенка, участки кишечника, почки, сердце. От каждого стада птицы отбирают для исследований 5 - 10 трупов, или патматериал от 5 - 10 трупов, клоакальные и/или трахеальные смывы от 10 - 15 голов (смывы от 5 голов можно объединять в одну пробу), 1 пробу помета от стада. Пробу помета отбирают: примерно, по 1 грамму помета из 60 точек птичника (выгула или вольеры), выбранных по диагонали крест на крест.

Доставку трупов птиц и отобранных проб патматериала (органов, тканей) в лаборатории осуществляют в кратчайшие сроки, во влагонепроницаемой таре герметично упакованной. При доставке проб в течение 24 часов отобранные органы и ткани помещают в пластиковые контейнеры, герметичные целлофановые пакеты, упаковывают в широкогорлые термосы (небьющиеся) с сухим льдом или хладоэлементами.

Если доставка образцов длится более 24 часов, они охлаждаются и доставляются на льду (можно использовать хладэлементы). Хранение суспензий из органов возможно до 4 дней при 4 °С. Для увеличения сроков хранения образцы хранят при температуре - 80 °С. Хранение при 20 °С может отрицательно сказаться на выделении вируса.

Образцы фекалий рекомендуется хранить и осуществлять их доставку при 4 °С. Клоакальные и трахеальные смывы можно доставлять в сухом виде или в транспортных средах.

7.4. Отбор проб биоматериала (трахеальные и клоакальные смывы, помет) осуществляется в целях мониторинговых исследований о клинически здоровой птицы, птицы подозреваемой в заражении вирусом гриппа, и осуществляется аналогично отбору проб сывороток крови по пункту 3.2.

В населенных пунктах отбираются клоакальные и/или трахеальные смывы от 5 - 10 домашних птиц (при наличии в населенном пункте водоплавающей птицы отбор проб проводится, прежде всего, от данных видов).

Сбор проб помета осуществляется с 5 подворий одного населенного пункта (5 проб).

В случае выявления падежа дикой птицы или обнаружения диких птиц с характерными клиническими признаками заболевания вблизи населенных пунктов, расположенных у водоемов, отбор проб патологического материала осуществляют в соответствии с пунктом 7.3

Для взятия и транспортировки смывов используют транспортные среды. Правила пересылки смывов в соответствии с пунктами 7.2 и 7.3.

7.5. Отбор проб от дикой птицы осуществляется в соответствии с п. 4 и п.п. 7.2, 7.3, 7.4, с привлечением зоологов и специалистов охотоуправлений в субъектах Российской Федерации.

При направлении на исследование проб сывороток крови, патматериалов или биоматериалов от дикой птицы необходимо указывать вид птицы, место отбора проб, количество проб, примерный возраст (взрослая, молодняк), дату отбора.

7.6. Пробы сыворотки крови и патматериал направляют нарочным с сопроводительным письмом в ветлаборатории субъектов Российской Федерации или в межобластные ветеринарные лаборатории.

8.1. Исследование мяса птицы, полуфабрикатов, субпродуктов из мяса птицы, комбикормов и мясокостной муки на грипп птиц проводится методом ПЦР в регионах, неблагополучных по данному заболеванию, и при их импорте из других стран.

9.1. Напряженным считается иммунитет, если у вакцинированной птицы получены титры антител в РТГА от 1:16 и выше более чем в 80 % проб или при исследовании в ИФА положительные титры антител также выявлены в 80 % исследованных проб. Антитела к вирусу гриппа птиц у контрольной группы должны отсутствовать.

9.2. Обследование вакцинированного поголовья птицы в населенных пунктах проводится планово на 28 день после вакцинации серологическими методами (РТГА, РДП, конкурентным методом ИФА на грипп птиц Н5). Отбор проб осуществляется в соответствии с пунктами 3.6, 3.7.

Оценка напряженности поствакцинального иммунитета осуществляется в соответствии с пунктом 9.1.

9.3. Для ПЦР диагностики отбирается не менее 60 проб помета для исследований по п. 7.3 и/или по 25 проб клоакальных и/или трахеальных смывов с одного населенного пункта.

9.4. При получении положительных результатов при исследованиях методом ПЦР проводится отбор проб для вирусологического исследования.

10.1. В случае получения положительных результатов при лабораторных исследованиях на грипп птиц ветлаборатории субъектов Российской Федерации и межобластные ветлаборатории направляют срочный отчет по форме 4 Вет-Б:

- в ФГУ ЦНМВЛ, главному государственному ветеринарному инспектору района или города, главному государственному ветеринарному инспектору субъекта Российской Федерации,

- руководителю территориального управления Россельхознадзора в субъекте Российской Федерации, уполномоченному для осуществления надзора в области ветеринарии.

10.2. ФГУ ЦНМВЛ представляет сведения по форме 4 Вет-Б в Россельхознадзор.

10.3. Квартальный отчет о проделанной работе, проводимой в соответствии с планом мониторинговых исследований, ветлаборатории субъектов РФ передают в ФГУ межобластные ветлаборатории к 10 числу следующего квартала.

Межобластные ветеринарные лаборатории представляют квартальный отчет в ФГУ ЦНМВЛ к 20 числу следующего квартала.

10.4. Формы отчетов и рекомендуемый план проведения эпизоотологического мониторинга прилагаются.

10.5. По поручению Россельхознадзора ФГУ ЦНМВЛ может собирать дополнительные сведения о проделанной работе по мониторингу гриппа птиц в субъектах Российской Федерации в течение календарного года.

10.6. Ветеринарные лаборатории субъектов Российской Федерации и межобластные ветеринарные лаборатории передают ежемесячно данные о результатах проведения лабораторного мониторинга: количестве обследованных хозяйств, населенных пунктов и т.д., количестве проведенных исследований, количестве полученных положительных результатов главному государственному ветеринарному инспектору данного субъекта Российской Федерации.

10.7. ФГУ ЦНМВЛ представляет сводный отчет о результатах проведения мониторинга в Россельхознадзор через 10 дней после поступления последнего отчета от межобластных ветлаборатории, данные сведения передаются также в Национальную референтную лабораторию по гриппу птиц.

11.1. Исследования на грипп птиц рекомендуется проводить в ветеринарных лабораториях, отвечающих требованиям безопасности, обеспеченных необходимым оборудованием, диагностическими наборами и квалифицированными кадрами.

Разработчики: Власов Н.А., Калмыков М.В., Виткова О.Н., Ирза В.Н., Myдрак Н.С., Фролов А.В., Белоусова Р.В., Михайлова В.В.

Рекомендации совершенствуются в соответствии с накопленным практическим опытом и научными достижениями.

Заместитель Руководителя
Россельхознадзора

Читайте также: