Стабилизаторы для вирус вакцина
Использование: вирусология, иммунология. Сущность изобретения: стабилизатор вирусных препаратов содержит холестериносодержащий продукт и химический реагент. В качестве холестериносодержащего продукта используют холестерин или продукты, содержащие его не менее 0,05%, например, сыворотка лошади. В качестве химического реагента используют мертиолят натрия, хинозол или их смесь. Оптимальный результат достигается при соотношении холестерин: химический реагент 1:20. 8 з.п. ф-лы, 8 табл.
Изобретение относится к области прикладной биотехнологии и может быть использовано в медицине и сельском хозяйстве для получения вакцинных, инсектицидных и других биопрепаратов, содержащих живые вирусы, хранения производственных и музейных штаммов и т.д.
В настоящее время для хранения препаратов, содержащих живые вирусы, используют методы замораживания и высушивания вируссодержащих материалов.
Недостатками этих методов являются частичная потеря активности препаратов, высокая вероятность бактериальной контаминации.
Наиболее близким к заявляемому является способ с использованием химических добавок. В качестве добавок использовались хлорид натрия, глицин, альбумин, желатин, формальдегид, мальтоза и антибиотики.
Недостатком данных стабилизирующих добавок является низкая эффективность (мальтоза), инактивация вирусов (фенол, формальдегид), слабая защита от контаминации бактерий и грибов (глицин, мальтоза).
Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание стабилизатора, способность сочетать антиконтаминационную и стабилизирующую эффективность.
Указанная цель достигается использованием в качестве стабилизатора смеси холестеринсодержащего продукта с химическим агентом тиомерсалом (натриевой солью этилмеркуртиосалициловой кислоты или иначе мертиолятом натрия), хинозолом (сернокислым гамма-оксихинолином) или их смесью.
В качестве холестеринсодержащего продукта используют холестерин или продукты, содержащие не менее чем 0,05% например, различные сыворотки крови (наиболее удобна лошадиная сыворотка в связи с низкой стоимостью и большой универсальностью).
Оптимальные результаты достигаются при соотношении холестерин:химреагент 1-20: 1, при использовании в качестве химического агента смеси тиомерсала с хинолином в соотношении 1:20:1.
В результате смешения холестерина с указанными агентами образуются комплексы, способные, по-видимому, ингибировать радикальные и иные негативные процессы в системе, вызывающие деактивацию вирусов. В результате удается сохранять активность вирусных препаратов на уровне 90-99% в течение по крайней мере 12-20 мес.
Выбор оптимального соотношения производных производится исходя из того, что понижение содержания тиомерсала снижает защищенность препарата от температурных воздействий, а пониженная концентрация хинозола ухудшает гомогенность системы. Повышение же концентрации обоих агентов выше данного предела оказывается токсичным для некоторых вирусов.
Таким образом в зависимости от используемой вирусной системы используется либо смесь холестерина с тиомерсалом и хинозолом в соотношении 1 20 0,5 1 0,5 1 или смеси холестерина с одним из агентов в соотношении 1 20:1.
Указанные композиции в литературе не описаны, что свидетельствует о их новизне, хотя использование отдельных препаратов в вирусологии известно.
Так, холестеринсодержащие продукты используют для наработки антител к вирусам, тиомерсал для создания инактивированных бактериальных вакцин против сальмонеллеза.
Приготовление стабилизатора из компонентов заключается в смешении навесок, разведение перед использованием дистиллированной водой до гомогенного состояния и добавление к вирусной суспензии, исходя из содержания в конечном продукте 0,5 3% в зависимости от состава стабилизатора и природы суспензии.
Практическая применимость иллюстрируется примерами.
Пример 1. При комнатной температуре смешением были приготовлены образцы, содержащие 7 г холестерина и 1 г тиомерсала (композиция 1), 7 г холестерина и 1 г хинозола (композиция 2), 100 г лошадиной сыворотки, содержащей 0,07% холестерина, 0,4 г тиомерсала и 0,4 г хинозола (композиция 3).
Перед употреблением полученную смесь доводили дистиллированной водой до 500 мл.
Бактериостатическую активность композиций изучали на штаммах E.coli, выделенных из эмбрионов кур на птицефабриках России при n 117.
Исследования проводили методом серийных разведений с учетом количества устойчивых штаммов E. coli к различным концентрациям композиций (цифрами в табл.1 показано количество устойчивых штаммов в n 117).
Затем в том же опыте изучали бактерицидную активность композиции (см. табл.2 цифрами показано количество устойчивых штаммов (%), n 117 Те же пробирки проверили на "пророст" через 24 дня хранения в холодильнике при +4 o С, определив таким образом консервирующий эффект композиций (см. табл.3 цифрами показано общее количество "проросших" пробирок в опыте (%), n 117.
Как видно из данных приведенных таблиц, бактериостатическая, бактерицидная и консервирующая активность предлагаемых композиций выше, чем у прототипа.
Фунгицидную активность композиций изучали на грибах Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Candida albicans, Sacharomices cerevisia методом серийных разведений в жидкой среде Сабуро. Учет вели через 2 мес. культивирования при 22 o С (см. табл.4).
Как видно из приведенной табл.4, фунгицидная консервирующая активность у прототипа отсутствует, а у предлагаемых композиций достаточно высока.
Действие композиций на микоплаз изучали на 4 штаммах M.gallisepticum, выделенных от птиц методом серийных разведений в среде Эдварда (см. табл.5 - цифрами указано количество устойчивых штаммов).
Как видно из табл.5, микоплазмостатическая активность всех композиций высока и не ниже, чем у прототипа.
Действием композиций на вирусы изучали методом определения биологической активности законсервированных вирусов на развивающихся эмбрионах птиц. Опыт проводили через 1 мес. хранения при +4 o С. (см. табл.6 цифрами указана остаточная активность вируса (%).
Как видно из данных табл.6, прототип не снижал биологическую активность вирусов. Добавление в вирусные суспензии водных растворов тиомерсала и хинозола достоверно инактивировали вирусы в различной степени. Добавление к вирусной суспензии смесей холестерина и растворов тиомерсала и хинозола в 1% концентрации и их смеси с содержанием по 0,4% каждого вещества не снижало активность вирусов при хранении в жидком состоянии.
При сублимационном высушивании всех исследованных образцов вирусов установлено, что ни одна из композиций не снижала растворимости сухих вирусов в воде (см. табл.7).
Влияние различных стабилизаторов на хранение вирусных суспензий представлено в табл.8.
Вышеприведенные данные свидетельствуют об эффективности и безопасности использования стабилизаторов для различных вируссодержащих биопрепаратов.
Основные исследования проводились в Институте болезней птиц (С.-Петербург). Выпуск препарата предполагается на базе ГМП "Ветфарм". ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4 ТТТ5
2. Стабилизатор вирусных препаратов на основе химических добавок, отличающийся тем, что в качестве добавок он содержит смесь холистеринсодержащего продукта (в расчете на холистерин) с натриевой солью этилмеркуртиосалициловой кислоты в соотношении (1 20):1.
3. Стабилизатор по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве холистеринсодержащего продукта он содержит холистерин.
4. Стабилизатор по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве холистеринсодержащего препарата он содержит продукты, содержащие по крайней мере 0,05% холистерина.
5. Стабилизатор по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве холистеринсодержащего продукта он содержит сыворотку крови лошадей.
6. Стабилизатор вирусных препаратов на основе химических добавок, отличающийся тем, что в качестве добавок он содержит холистеринсодержащие продукты (в расчете на холистерин).
7. Стабилизатор по пп. 1 и 6, отличающийся тем, что в качестве холистеринсодержащего продукта он содержит холистерин.
8. Стабилизатор по пп. 1 и 6, отличающийся тем, что в качестве холистеринсодержащего препарата он содержит продукты, содержащие по крайней мере 0,05% холистерина.
9. Стабилизатор по пп. 1 и 6, отличающийся тем, что в качестве холистеринсодержащего продукта он содержит сыворотку крови лошадей.
В условиях пандемии многие государства приступили к созданию лекарств и вакцин от нового коронавируса. Сообщается, что в России разработка прошла первую фазу — так ли это? Значит ли, что скоро можно ждать появления препарата? Чтобы разработать новое лекарство от неизвестного заболевания по всем правилам научного поиска нужно от 5 до 15 лет. Разобрали весь процесс на примере COVID-19 вместе с Равилем Ниязовым, специалистом по регуляторным вопросам и разработке лекарств Центра научного консультирования.
COVID-19 — инфекционное заболевание, вызываемое коронавирусом SARS-CoV-2. В тяжелых формах оно поражает легкие, иногда — сердце и другие органы. Особенно тяжело заболевание протекает, если у больного есть другие нарушения со стороны дыхательной или сердечно-сосудистой систем. Молниеносно возникшая пандемия COVID-19 поставила вопрос разработки лекарств и вакцин от новой инфекции. Это долгий процесс с множеством стадий, на каждой из которых исключают вещества-кандидатов. Только одно или небольшая группа таких веществ в итоге сможет стать безопасным и эффективным лекарством.
Шаг 1: понять, как развивается новое заболевание
Любая болезнь нарушает естественные физиологические и биохимические процессы в организме. Причины заболеваний могут быть разными, в том числе — инфекционными. Инфекционный агент (в случае COVID-19 это коронавирус SARS-CoV-2) заимствует и эксплуатирует биохимический аппарат клеток, перехватывая управление им, в результате чего клетки перестают выполнять свою физиологическую функцию. Для вируса SARS-CoV-2 основной мишенью являются клетки дыхательного эпителия, отвечающие за газообмен, то есть за дыхание.
Лекарством для лечения COVID-19 будет считаться любое вещество или комбинация веществ, которое будет способно (1) инактивировать вирус еще до того, как он успеет поразить клетку, или (2) нарушать жизненный цикл вируса внутри зараженной клетки, или (3) защищать новые непораженные здоровые клетки от инфицирования.
Чтобы создать лекарство от SARS-CoV-2, нужно хорошо знать, каков жизненный цикл вируса в организме человека:
- с какими клетками человека и через какие рецепторы на поверхности клеток он связывается, какой собственный вирусный аппарат для этого он использует;
- как вирус проникает в клетку;
- как вирус эксплуатирует биохимический аппарат клетки, чтобы воспроизводить собственный генетический материал и белки, нужные для сборки новых вирусных частиц;
- как вирус покидает инфицированную клетку, чтобы инфицировать новые клетки;
- как формируется иммунитет против вируса и какой вклад иммунитет вносит в тяжесть заболевания (чрезмерная иммунная реакция может вызывать тяжелое поражение внутренних органов).
Всё перечисленное — это совокупность фундаментальных знаний, необходимых для перехода к следующему этапу разработки лекарства — синтезу или биосинтезу веществ, которые могут нарушать свойства вирусных частиц, убивая вирус и при этом не вредя человеку. Например, так работают лекарства от ВИЧ-инфекции или гепатита C. Но при этих заболеваниях важно применять сразу несколько веществ из разных классов, чтобы вирус не становился устойчивым к терапии. Об этом нужно будет помнить и при разработке лекарств против SARS-CoV-2.
Для лечения вирусных заболеваний также могут использоваться иммуносыворотки, содержащие антитела, способные инактивировать вирус. Такие сыворотки можно получать от животных, например, лошадей или кроликов, но также и от человека, уже переболевшего заболеванием.
Однако самый эффективный подход — профилактика заболевания. Для этого используют вакцины — естественные или генетически модифицированные белки вируса, а иногда и живой, но ослабленный вирус. Вакцина имитирует инфекционное заболевание и стимулирует организм к формированию иммунитета. В последнее время также разрабатываются РНК- и ДНК-вакцины, но пока одобренных препаратов нет.
В отличие от традиционных вакцин, РНК-/ДНК-вакцины содержат не вирусные белки, а гены, кодирующие основные вирусные белки. Введение такой вакцины приводит к синтезу клетками белков вируса, на которые должна реагировать иммунная система и вырабатывать иммунитет против этих белков вируса. Гипотетически это должно препятствовать началу инфекционного процесса при заражении настоящим патогенным вирусом. Важно отметить, такие РНК- и ДНК-вакцины не должны кодировать те белки вируса, которые способны были бы привести к настоящей вирусной инфекции.
Шаг 2: поиск хитов
На ранней стадии разработки синтезируют и тестируют множество веществ — библиотеку. Основная цель этого этапа — найти группу хитов (hit — попадание в цель), которые бы связывались с нужной вирусной мишенью. Обычно это один из белков вируса. Иногда отбор идет из библиотек, состоящих из миллиардов низкомолекулярных веществ. Сейчас активно используют компьютерные алгоритмы — машинное и глубокое обучение — чтобы искать новые потенциально активные молекулы. Одна из компаний, успешно работающая в этом направлении, — InSilico Medicine, создана российскими математиками.
Другой источник потенциальных лекарств — выздоровевшие люди: в их крови содержатся антитела, часть из которых способны связываться с вирусом и, возможно, нейтрализовать его.
Шаг 3: поиск и тестирование лидов
Когда находят группу хитов, способную связываться с вирусным белком, переходят к следующему этапу скрининга. На этом шаге исключаются вещества, которые:
- нестабильны и быстро разлагаются;
- тяжелы/затратны в синтезе;
- токсичны для различных клеток человека в условиях лабораторных экспериментов на культуре клеток. Вещества не должны быть токсичны сами, токсичностью также не должны обладать продукты их метаболизма в организме, продукты их разложения и примеси, возникающие в процессе производства; вместе с тем если процесс производства способен с помощью очистки удалять продукты разложения или примеси, то такой хит может и не будет выведен из разработки;
- плохо растворимы в воде — лекарство должно в достаточном количестве растворяться в биологических жидкостях, чтобы распределиться по организму;
- быстро разлагаются в живом организме;
- плохо проникают через слизистые оболочки, клеточные мембраны или внутрь клетки, в зависимости от пути введения лекарства и расположения вирусной мишени.
Хиты, которые выдерживают эти испытания и проходят все фильтры, переводят в категорию лидов (lead — ведущий).
Лиды тестируют в еще более широкой серии экспериментов для принятия так называемых решений Go/No-Go о продолжении или остановке разработки. На этой стадии инициируются испытания на животных. Такая схема отбора нужна чтобы как можно раньше вывести из разработки бесперспективные молекулы, потратив на них минимальные время и ресурсы, поскольку каждый последующий этап является еще более затратным.
Те несколько лидов, которые успешно проходят очередные испытания, становятся кандидатами. К этому моменту разработка может длиться уже от трех до семи лет.
Шаг 4: испытания кандидатов и клинические исследования
Прежде чем перейти к испытаниям на людях, нужно выполнить исследования на животных и подтвердить отсутствие неприемлемой для человека токсичности, подобрать первоначальную безопасную дозу. На этом этапе кандидаты тоже могут отсеиваться — например, из-за генотоксичности (токсичности для генетического аппарата клетки) или канцерогенности (способности вызывать рак). Еще они могут оказаться небезопасными для беременных женщин или женщин детородного возраста, вызывать поражение головного мозга, печени, почек, сердца или легких. В зависимости от природы молекулы исследования проводят на грызунах, собаках, обезьянах, минипигах, кроликах и т.д.
В зависимости от природы заболевания, особенностей его терапии и свойств лекарства, какие-то исследования могут не проводиться или быть не значимы. Например, оценка канцерогенности лекарства не потребуется, если оно будет применяться в лечении краткосрочных заболеваний, как в случае COVID-19. Генотоксичность не оценивают для биопрепаратов или если лекарство предназначено для лечения метастатического рака и т. д. Суммарно доклинические исследования могут занимать 3–5 лет. Часть из них проводится параллельно с клиническими исследованиями.
Если доклинические исследования успешны, начинается клиническая разработка, которая условно делится на фазы. Это нужно, чтобы постепенно и контролируемо тестировать лекарство на все большем количестве людей. И снова стадийность процесса позволяет прекратить разработку на любом этапе, не подвергая риску многих людей.
- Первая фаза: здесь подтверждают первичную безопасность для людей в принципе, изучают поведение лекарства в организме человека, его биодоступность (способность достигать места действия в достаточных концентрациях), его взаимодействие с другими лекарствами, влияние пищи, половых и возрастных различий на свойства лекарства, а также безопасность для людей с сопутствующими заболеваниями (особенно важны заболевания печени и почек — эти органы отвечают за метаболизм и выведение лекарств), проверяют, не вызывает ли лекарство нарушение ритма сердца. Кроме того, на I фазе оценивают безопасный диапазон доз: эффективные дозы не должны быть неприемлемо токсичными.
- Вторая фаза: здесь начинают проверять эффективность лекарства на пациентах с заболеванием. На ранней II фазе оценивают, работает ли кандидатная молекула на людях с изучаемым заболеванием в принципе, а на поздней II фазе подбирают режим дозирования, если кандидатное лекарство было эффективным. При этом вещество, эффективное в лабораторных экспериментах, на животных моделях заболевания и даже в ранних клинических исследованиях на людях, вполне может не быть таким же рабочим в реальной медицинской практике. Поэтому и нужен длительный процесс поэтапной исключающей разработки, чтобы на выходе получить эффективное и безопасное лекарство.
- Третья фаза: здесь подтверждают эффективность и безопасность лекарства, а также доказывают, что его польза компенсирует те нежелательные реакции, которые неминуемо будет вызывать лекарство. Иными словами, в исследованиях третьей фазы надо понять, что баланс пользы и рисков положителен. Это всегда индивидуально. Например, у людей с ВИЧ в целом допустимо, если противовирусные лекарства вызывают некоторые нежелательные реакции, а в случае онкологических заболеваний приемлемы и более выраженные токсические реакции.
В случае вакцин, которые рассчитаны на здоровых людей, и особенно детей, приемлемы лишь легкие нежелательные реакции. Поэтому найти баланс трудно: вакцина должна быть высоко эффективной, и при этом вызывать минимальное число тяжелых реакций, например реже, чем 1 случай на 1000, 10 000 или даже 100 000 вакцинированных людей. Клиническая разработка может длиться до 5–7 лет, однако низкомолекулярные противовирусные лекарства для краткосрочного применения, как в случае COVID-19, можно протестировать быстрее — за 1–2 года.
Разработка многих отечественных противовирусных и иммуномодулирующих препаратов не соответствует такому научно выверенному процессу разработки.
Шаг 5: производство
Важный этап — наладить производство лекарства. Разработка процессов синтеза начинается в самом начале отбора лидов и постепенно дорабатывается, оптимизируется и доводится до промышленного масштаба.
В настоящее время против SARS-CoV-2 разрабатывается много разных методов лечения:
- низкомолекулярные соединения, которые нарушают жизненный цикл вируса. Трудность в том, что может быть нужно применять сразу несколько противовирусных лекарств. Сейчас надежды возлагают на ремдесивир. Есть данные, что может быть эффективен давно известный гидроксихлорохин, действующий не на сам вирус, а влияющий на иммунитет. Информацию, что комбинация лопинавира и ритонавира оказалась неэффективной у тяжелобольных пациентов, стоит интерпретировать с осторожностью: она может быть эффективна при более легких формах, или для профилактики, или у каких-то определенных подгрупп;
- противовирусные, в том числе моноклональные, антитела, которые связываются с ним на поверхности и блокируют его проникновение в клетку, а также помечают вирус для клеток иммунной системы. Антитела можно получать как биотехнологически, так и выделять из крови переболевших людей. Сейчас тестируются препараты, получаемые с помощью обоих методов;
- вакцины. Они могут представлять собой естественные или модифицированные белки вируса (модификации вводят для усиления выработки иммунитета), живой ослабленный вирус, вирусоподобные наночастицы, синтетический генетический материал вируса (РНК-вакцины) для того, чтобы сам организм человека синтезировал некоторые белки вируса и смог выработать антитела к нему. Одна из проблем в случае вакцин — простое введение белков вируса, пусть и модифицированных, не всегда позволяет сформировать иммунитет, способный защитить от реального заболевания — так называемый стерильный иммунитет. Даже образование антител в ответ на введение вакцины не гарантирует защиты: хорошим примером являются те же ВИЧ и гепатит C, хотя вакцина против гепатита B достаточно проста и при этом высокоэффективна. Хочется надеяться, что отечественные разработчики следуют рекомендациям Всемирной организации здравоохранения по проведению доклинических и клинических исследований вакцин, включая исследования провокации и изучение адъювантов;
- препараты для РНК-интерференции. Так называемые малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (РНК) — это небольшие отрезки синтетически получаемой РНК, которые способны связываться с генетическим аппаратом вируса и блокировать его считывание, мешая синтезу вирусных белков или воспроизведению генетического материала вируса.
Процесс разработки лекарства — это научный поиск с неизвестным исходом. Он занимает много времени и требует участия большой команды профессионалов разных специальностей. Однако только реальный клинический опыт позволит оценить, удалось ли получить не только эффективное, но и безопасное лекарство, поэтому любое точное определение сроков получения лекарства — спекуляция. Получить эффективную и безопасную вакцину к концу года, если следовать всем правилам научного поиска, вряд ли удастся.
Детальные обсуждения процессов разработки новых лекарств и возникающих в связи с этим проблем — на YouTube-канале PhED.
В качестве вакцин используются антигены разного происхождения, это могут быть живые и убитые бактерии, вирусы, анатоксины, а также антигены, полученные с помощью генной инженерии и синтетические.
От состава вакцин во многом зависят их иммунобиологические свойства, способность индуцировать специфический иммунный ответ. Однако некоторые составные части вакцин могут вызвать и нежелательные реакции, что следует учитывать при проведении иммунизации.
Существующее многообразие вакцин можно подразделить на две основные группы: на живые и убитые (инактивированные) вакцины. В свою очередь какждая из этих групп может быть разделена на подгруппы [11].
1. Живые вакцины - из аттенуированных штаммов возбудителя (штаммы с ослабленной патогенностью).
2. Убитые вакцины
- Молекулярные, полученные путем:
а) биологического синтеза;
б) химического синтеза.
- Корпускулярные:
а) из цельных микробов;
б) из субклеточных надмолекулярных структур.
В последние годы созданы синтетические молекулярные вакцины, а так же плазмидные (генные) вакцины.
Постановка вопроса о предпочтительном выборе либо живых, либо убитых вакцин нам кажется неоправданной, так как в каждом конкретном случае эти принципиально разные препараты имеют свои преимущества и свои недостатки.
Инактивированные вакцины получают путем воздействия на микроорганизмы химическим путем или нагреванием. Такие вакцины являются достаточно стабильными и безопасными, так как не могут вызвать реверсию вирулентности. Они часто не трубуют хранения на холоде, что удобно в практическом использовании. Однако у этих вакцин имеется и ряд недостатков, в частности, они стимулируют более слабый иммунный ответ и требуют применения нескольких доз (бустерные иммунизации).
б) живые аттенуированнные
Хотя живые вакцины требуют специальных условий хранения, они продуцируют достаточно эффективный клеточный и гуморальный иммунитет и обычно требуют лишь одно бустерное введение. Большинство живых вакцин вводится парентерально (за исключением полиомиелитной вакцины).
На фоне преимуществ живых вакцин имеется и одно предостережение, а именно: возможность реверсии вирулентных форм, что может стать причиной заболевания вакцинируемого. По этой причине живые вакцины должны быть тщательно протестированы. Пациенты с иммунодефицитами (получающие иммуносупрессивную терапию, при СПИДе и опухолях) не должны получать такие вакцины.
Многие микроорганизмы, вызывающие заболевания у человека, опасны тем, что выделяют экзотоксины, которые являются основными патогенетическими факторами заболевания (например, дифтерия, столбник). Анатоксины, используемые в качестве вакцин, индуцируют специфический иммунный ответ. Для получения вакцин токсины чаще всего обезвреживают с помощью формалина.
Ниже (табл. 15) приведена сравнительная характеристика вакцин [11], из которой следует, что инактивированные вакцины более стабильны, менее реактогенны, на их основе можно конструировать многокомпонентные вакцины, хотя в то же время по иммуногенности они уступают живым вакцинам.
Таблица 15. Факторы, влияющие на иммунный ответ на антиген
|
Примечания: 0> - признак не выражен, +> - слабо выражен, ++ - выражен, +++ - сильно выражен, (+) - тенденция в сторону усиления признака.
Использование новых технологий позволило создать вакцины второй генерации.
Рассмотрим подробнее некоторые из них:
Некоторые бактерии, вызывающие такие опасные заболевания, как менингиты или пневмонию (гемофилюс инфлюэнце, пневмококки), имеют антигены, трудно распознаваемые незрелой иммунной системой новорожденных и грудных детей. В конъюгированных вакцинах используется принцип связывания таких антигенов с протеинами или анатоксинами другого типа микроорганизмов, хорошо распознаваемых иммунной системой ребенка. Протективный иммунитет вырабатывается против конъюгированных антигенов.
На примере вакцины против гемофилюс инфлюэнце (Hib-b) показана эффективность в снижении заболеваемости Hib-менингитами детей до 5-ти лет в США за период с 1989 по 1994 г.г. с 35 до 5 случаев.
б) субъединичные вакцины
Субъединичные вакцины состоят из фрагментов антигена, способных обеспечить адекватный иммунный ответ. Эти вакцины могут быть представлены как частицами микробов, так и получены в лабораторных условиях с использованием генно-инженерной технологии.
Примерами субъедиинчных вакцин, в которых используются фрагменты микроорганизмов, являются вакцины против Streptococcus pneumoniae и вакцина против менингококка типа А.
Рекомбинантные субъединичные вакцины (например, против гепатита B) получают путем введения части генетического материала вируса гепатита B в клетки пекарских дрожжей. В результате экспрессии вирусного гена происходит наработка антигенного материала, который затем очищается и связывается с адъювантом. В результате получается эффективная и безопасная вакцина.
в) рекомбинантные векторные вакцины
Вектор, или носитель, - это ослабленные вирусы или бактерии, внутрь которых может быть вставлен генетический материал от другого микроорганизма, являющегося причинно-значимым для развития заболевания, к которому необходимо создание протективного иммунитета. Вирус коровьей оспы используется для создания рекомбинантных векторных вакцин, в частности, против ВИЧ-инфекции. Подобные исследования проводятся с ослабленными бактериями, в частности, сальмонеллами, как носителями частиц вируса гепатита B. В настоящее время широкого применения векторные вакцины не нашли.
Как известно, основу каждой вакцины составляют протективные антигены, представляющие собой лишь небольшую часть бактериальной клетки или вируса и обеспечивающие развитие специфического иммунного ответа. Протективные антигены могут являться белками, гликопротеидами, липополисахаридобелковыми комплексами. Они могут быть связаны с микробными клетками (коклюшная палочка, стрептококки и др.), секретироваться ими (бактериальные токсины), а у вирусов располагаются преимущественно в поверхностных слоях суперкапсида вириона [11].
Поскольку для создания вакцин необходимо получение протективного антигена в достаточных количествах, то, прежде всего, нарабатываются большие объемы биомассы (культивируемые бактерии, вирусы). Далее производится выделение и очистка протективного антигена, причем в зависимости от условий это может быть как живая биомасса, так и инактивированная. Для инактивации используют формалин, фенол, перекись водорода, тепло, УФО-облучение и т.д.
Выделение и очистка протективного антигена также сопряжены с физическими или химическими методами воздействия, что определяется в основном свойствами антигена. Это могут быть методы изоэлектрического осаждения кислотами и щелочами, высаливание нейтральными солями, осаждение спиртом, сорбция и элюция, ультрафильтрация, колоночная хроматография и т.д.
Важно, что при всех указанных действиях должна максимально сохраняться первоначальная структура протективного антигена и в то же время должна быть получена максимальная степень чистоты препарата [11].
Несмотря на постоянное совершенствование вакцин, существует целый ряд обстоятельств, изменение которых в настоящий момент невозможно. К ним относятся следующие: добавление к вакцине стабилизаторов, наличие остатков питательных сред, добавление антибиотиков и т.д. Известно, что вакцины могут быть разными и тогда, когда они выпускаются разными фирмами. Кроме того, активные и инертные ингредиенты в разных вакцинах могут быть не всегда идентичными (для одинаковых вакцин).
Эти компоненты вакцин, анатоксинов и иммуноглобулинов используются для ингибиции и предотвращения роста бактерий в вирусных культурах, для стабилизации антигенов. Для лиофилизации используют лактозу, сахарозу, человеческий альбумин, мальтозу и др. В качестве консервантов наиболее часто в отечественных вакцинах используют меркуротиолят (мертиолят или тимеросал), стабилизатора - раствор хлористого магния. Наряду с этим в зарубежных вакцинах используют формальдегид, гидрометиламинометан, фенол, феноксиэтанол и др.
Аллергические реакции могут иметь место, если реципиент чувствителен к одной из этих добавок (тимеросал или мертиолят, фенолы, альбумин, глицин, неомицин).
В качестве растворителей могут использоваться стерильная вода, физиологический раствор, раствор, содержащий протеин или другие составляющие, происходящие из биологических жидкостей - сывороточные протеины.
Многие антигены вызывают субоптимальный иммунологический ответ. Усиление иммуногенности включает связывание антигенов с различными субстанциями или адъювантами (например, фосфат алюминия или гидроокись алюминия).
При создании вакцин учитывается способ их введения. Так, в препаратах для парентерального введения целесообразно использование адъювантов и консервантов, а для энтерального применения - кислотоустойчивое покрытие.
В технологии создания вакцин предусматривается стерилизация растворов антигенов. С этой целью используются термическая обработка, облучение, фильтрация и т.п. Безусловно все эти воздействия не должны повлиять на сохранность протективного антигена и его количество [11].
Таким образом, создание современных вакцин - это высокотехнологичный процесс, использующий достижения во многих отраслях знаний.
Актуальной задачей современной вакцинологии является постоянное совершенствование вакцинных препаратов. Эксперты международных организаций по контролю за вакцинацией разработали ряд критериев эффективных вакцин, которые соблюдаются всеми странами-производителями вакцин. Перечислим некоторые из них (Табл. 16)
Таблица 16. Некоторые критерии эффективных вакцин
(Janeway C.A., et al., 1996)
|
Другой вопрос, который следует иметь ввиду при реализации любых программ массовых иммунизаций - это соотношение между безопасностью вакцин и их эффективностью. В программах иммунизации детей против инфекций имеется конфликт между интересом индивидуума (вакцина должна быть безопасна и эффективна) и интересом общества (вакцина должна вызывать достаточный протективный иммунитет). К сожалению, на сегодняшний день в большинстве случаев частота осложнений вакцинации тем выше, чем выше ее эффективность. Авторы такой концепции приводят соответствующий пример - эффективной, но довольно реактогенной паротитной вакцины, содержащей штамм Urabe Am9, и менее эффективной, содержащей штамм Jeryl Lynn [130]. В результате эксперты по практике иммунизации в США пришли к заключению, что нет "вакцин совершенно безопасных или совершенно эффективных" ("Рекомендации по иммунизации" - ACIP., 1994).
В настоящее время существуют определенные требования к вакцинам:
| 1. | Вакцина должна быть безопасной. |
| 2. | Вакцина должна индуцировать протективный иммунитет с минимальными побочными эффектами для большинства получивших ее. |
| 3. | Вакцина должна быть иммуногенной, т.е. должна вызывать достаточно сильный иммунный ответ. |
| 4. | Вакцина должна индуцировать "правильный" (необходимый) тип иммунного ответа. Когда микроорганизмы проникают в организм человека, они могут вызвать заболевание разными путями, и разные отдела имунной системы отвечают за эффективную борьбу с ними. Вакцины должны стимулировать специфический иммунный ответ, который эффективно защитит от инфекции. |
| 5. | Вакцины должны быть стабильны в течение срока хранения. Многие инактивированные вакцины проще для хранения, особенно если они в сухом виде и растворяются перед введением. Живые аттенуированные вакцины для сохранения их стабильности требуют охлаждения на всем протяжении пути от завода-изготовителя до клиники. |
На сегодняшний день эффективной считается та вакцинация, в результате которой развивается длительная защита вакцинируемого от инфекции. Ряд требований эффективной вакцинации перечисляются ниже.
Читайте также: