Тест-система иммуноферментная для определения антигенов хантавирусов

Иммуноферментная для определения антигенов хантавирусов

набор из 12 компонентов

Описание

Ÿ планшет для иммунологических реакций, полистироловый или полихлорвиниловый, монолитный;

иммуноглобулин человека класса G (ИГ+), сухой, содержащий антитела к хантавирусу, аморфная масса белого цвета;

иммуноглобулин человека класса G (ИГ-) сухой, не содержащий

антител к хантавирусу, аморфная масса белого цвета;

Ÿ антиген хантавируса (АГ+), сухой, инактивированный, аморфная масса белого или светло-розового цвета;

Ÿ коньюгат, жидкий – иммуноглобулин человека класса G (IgG),

содержащий антитела к хантавирусу, коньюгированный с

пероксидазой хрена, вязкая, прозрачная жидкость;

* Взамен: Инструкции по применению, утвержденной 19 мая 1999 года

Ÿ Альбумин из бычьей сыворотки (БСА), стабилизатор, сухой

кристаллический порошок белого или светло-желтого цвета;

Ÿ Концентрат ( х100) фосфатно-солевого буферного раствора, (ФСБх100) – бесцветная прозрачная жидкость, возможно выпадение

осадка, растворяющегося при температуре от 300 до 400 С в течение

Ÿ Концентрат (х2) цитратно-фосфатного буферного раствора, (ЦФБ),

бесцветная прозрачная жидкость;

Ÿ Твин-20, жидкий;

Ÿ Хромоген – ортофенилендиамин (ОФД), таблетка серо-коричневого цвета;

Ÿ Стоп-реагент – серная кислота, 1 М раствор, бесцветная прозрачная жидкость;

Ÿ Гидроперит сухой, таблетка белого цвета.

Набор рассчитан на исследование 48 анализов, включая анализ

контрольного образца АГ+.

1. Приготовление рабочих растворов и реагентов:

1.1. Рабочий раствор ФСБ. ФСБ (х100) разводят до 1 л дистиллированной водой. Раствор предназначен для растворения ИГ+, ИГ- (10 мл), и является исходным для приготовления раствора для отмывания планшета (ФСБ-Т) и раствора для разведения коньюгата (1% раствор БСА в ФСБ-Т). Хранят при температуре 2-8 0С в течение 3 сут.

1.2. ФСБ-Т – во флакон с 0,5 мл твина-20 добавляют 5,0 мл рабочего раствора ФСБ, и смесь осторожно перемешивают до получения

однородного раствора, не допуская образования обильной пены.

Полученный раствор переносят пипеткой в оставшийся объем (985 мл)

рабочего раствора ФСБ. Раствор предназначен для отмывания

планшета и для приготовления 1%-ного раствора БСА в ФСБ-Т. Хранят

при температуре 2-8 0С в течение 4 сут.

1.3. ФСБ — БСА – к 10 мл раствора ФСБ-Т добавляют содержимое флакона с БСА и, не встряхивая, оставляют при комнатной температуре до полного растворения белка. Раствор предназначен для разведения коньюгата. Готовят перед употреблением.

1.4. ЦФБ – к ЦФБ (х2) добавляют 6,0 мл дистиллированной воды и перемешивают. Раствор предназначен для приготовления раствора хромогена. Готовят перед употреблением.

1.5. Перекись водорода – таблетку гидроперита растворяют в 3 мл дистиллированной воды. Полученный раствор перекиси водорода готовят перед употреблением.

1.6. АГ+ — раствор АГ+ получают добавлением во флакон воды в объеме указанном на этикетке. Готовят непосредственно перед употреблением.

1.7. ИГ+, ИГ — — во флаконы с препаратом добавляют по 5,0 мл приготовленного раствора ФСБ. Растворы предназначены для сорбции планшета.

2. Проведение ИФА.

2.1. Сенсибилизация лунок планшета: планшет располагают согласно рекомендуемой схеме, т. е. вертикально так, чтобы буквы (от Н до А) находились вверху, а нумерация рядов (от 1 до 12) – справа (см. схему). Вносят по 0,1 мл рабочего разведения анти-хантавирусного IgG (ИГ+) человека в нечетные ряды лунок и по 0,1 мл рабочего разведения

нормального IgG человека (ИГ-) – в четные ряды лунок. Планшет накрывают

крышкой и выдерживают в холодильнике при температуре 4 – 8 0С в течение 16-20 ч, или при температуре 37 0С в течение 3 ч.

2.2. Промывание лунок планшета: после инкубации содержимое лунок удаляют и лунки трижды промывают раствором ФСБ-Т, заполняя их до края и сразу же удаляя раствор. Планшет подсушивают постукиванием по 2-3 слоям фильтровальной бумаги до удаления видимых капель.

2.3. Внесение исследуемых образцов: в лунки планшета вносят по 0,05 мл исследуемых образцов суспензий, начиная от буквы Н до А — один образец в две вертикально расположенные лунки – с ИГ+ и ИГ-, а в последнюю пару лунок (А-11 и А-12) вносят по 0,05 мл контрольного антигена хантавируса. Панель накрывают крышкой и выдерживают в холодильнике при температуре 4 – 8 0С в течение 16-20 ч, или при температуре 37 0С в течение 2 ч.

2.4. Промывание лунок планшета: после инкубации содержимое лунок удаляют и лунки 5 раз промывают раствором ФСБ-Т, заполняя их до края (1-й раз сразу же удаляя раствор, а последующие 4 раза, выдерживая с раствором по 5 мин). Планшет подсушивают постукиванием по 2-3 слоям фильтровальной бумаги до удаления видимых капель.

2.5. Приготовление рабочего разведения коньюгата: раствор для разведения коньюгата (1% р-р БСА в ФСБ-Т см. п. 1.3.) в объёме 6,4 мл вносят по флакон, содержащих пероксидазный коньюгат и тщательно перемешивают. Коньюгат в рабочем разведении не хранить, использовать сразу!

2.6. Внесение коньюгата: по 0,05 мл рабочего разведения перокисдазного коньюгата вносят по все лунки планшета. Планшет накрывают крышкой и выдерживают при температуре 37 0С в течение 1 ч.

2.7. Приготовление раствора хромогена: ОФД растворяют при перемешивании в 12 мл ЦФБ в течение 1-2 мин в темном месте. Непосредственно перед внесением в лунки к приготовленному раствору ОФД при перемешивании 0,01 мл раствора перекиси водорода.

2.8. Промывание лунок планшета: после инкубации содержимое лунок 37 0С удаляют и лунки 6 раз промывают раствором ФСБ-Т, заполняя их до края (1-й раз сразу же удаляя раствор, а последующие 5 раз, выдерживая с раствором по 5 мин). Планшет подсушивают постукиванием по 2-3 слоям фильтровальной бумаги до удаления видимых капель.

2.9. Внесение раствора хромогена: приготовленный раствор хромогена немедленно вносят по 100 мкл во все лунки планшета, который затем в условиях полной темноты выдерживают при комнатной температуре в течение 30 – 50 мин.

2.10. Стоп реагент: реакцию останавливают внесением во все лунки план-шета по 50 мкл стоп-реагента. Результат учитывают не позднее 30 мин.

Результат учитывают спектрофотометрически по оптической плотности (ОП) при длине волны 492 нм. Положительной считают пробу в случае, когда ОП лунки с ИГ+ превосходит ОП лунки с ИГ- в 2,1 и более раз.

Ÿ Планшет для иммунологический реакций — 1 шт.

Иммуноглобулин человека класса G, содержащий антитела

к хантавирусу (ИГ+), сухой — 1 флакон (0,1 мл)

Ÿ Антиген Хантавируса (АГ +), сухой, инактивированный 1 флакон (0,1 мл)

Ÿ Коньюгат, жидкий 1 флакон (5 или 20 мкл)

Ÿ Альбумин из бычьей сыворотки, сухой 1 флакон (0,1 г)

Ÿ Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора

(ФСБ х100) 1 флакон (10,0 мл)

Ÿ Концентрат (х2) цитратно-фосфатного буферного раствора

(ЦФБ) 1 флакон (6,0 мл)

Ÿ Твин-20, жидкий 1 флакон (0,5 мл)

Ÿ Хромоген (ортофенилендиамин) ОФД — 1 флакон (5,0 мг);

Ÿ Стоп-реагент – серная кислота, раствор 1М — 1 флакон (5,0 мл);

Ÿ Гидроперит, сухой — 1 табл

Ÿ Инструкция по применению — 1 шт.

Тест система с истекшим сроком годности применению не подлежит.

Транспортирование: в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 0С. Допускается транспортирование при температуре до 250С в течение не более 2-х сут.

Хранение в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 в сухом помещении при температуре от 2 до 8 0С в недоступном для детей месте.

Поделиться

Закон закупки 44-ФЗ Закон, регулирующий правовые отношения в области государственных закупок. Расширили список запрещенных иностранных товаров по 44 ФЗ В каких случаях указывать и подтверждать страну происхождения товара по 44-ФЗ? Переторжка по 44-ФЗ и 223-ФЗ: особенности, процедура проведения Оплата по контракту по 44-ФЗ: как получить вовремя Исключения из правил: что нельзя закупить по 44-ФЗ или 223-ФЗ Существенные условия контракта по 44-ФЗ: что к ним относится и можно ли их изменять? Сравниваем 44-ФЗ и 223-ФЗ: таблица для чайников Чем обычный договор отличается от контракта по 44-ФЗ Национальный режим при осуществлении закупок по 44-ФЗ и 223-ФЗ: запреты, ограничения, условия допуска Вопрос: Я продаю компьютеры. Могу ли я участвовать в закупках по 44фз, если у меня нет документов о том, что эта техника - российского происхождения? Неустойка по 44-ФЗ: разбираемся с особенностями начисления Что не так с 44-ФЗ, или Почему злится Артемий Лебедев Что такое госзакупки: полное определение понятия, виды закупок по 44-ФЗ Независимый регистратор по 44-ФЗ: обзор, функции, цели, плюсы и минусы использования Предметы роскоши по 44-ФЗ: как их опознать Как оплатить неустойку по 44-ФЗ Способы закупок по 44-ФЗ и 223-ФЗ Что изменилось в закупках в конце мая: обзор Постановлений Правительства Как проходят закупки у СМП по 223-ФЗ и 44-ФЗ Идентификационный код закупки (ИКЗ) по 44-ФЗ: определение, формирование, расшифровка и поиск закупок по ИКЗ Банковское сопровождение контракта по 44-ФЗ: виды, случаи и порядок осуществления Заказчик ИНН: 4826045274 / КПП: 482601001 Как заказчики злоупотребляли своими правами "Зачем потеть и страдать, затачивая техзадание под своего подрядчика?" - подумал как-то заказчик и обратился к компьютерщикам. Любовь заказчика к ПДФ (pdf) Контракт исполнен, а оплаты нет - знакомая ситуация? Может ли заказчик поменять техзадание после публикации закупки? Как отличить убытки от неустойки Топ-5 ловушек заказчика в техзадании ФАС в шоке: новое нарушение госзаказчиков Ошибки заказчика и обжалование действий заказчика Положение о закупках по 223-ФЗ: содержание, структура, примеры Права поставщика, о которых молчат заказчики Кто такие государственные заказчики Может ли поставщик увидеть заявки конкурентов? Заказчик не платит Заказчик разместил аукцион на ремонтные работы. Сроки выполнения работ - нереальные. Стоит ли участвовать? Топ-5 ловушек заказчика в документации Общение с заказчиками Об исчезновении строительства детского сада. Информационная лента При прокрутке вниз Вы можете получить очень полезную информацию, подобранную специально для Вас нашей программой. А также самые интересные и актуальные статьи о тендерах и закупках, которые мы подобрали для Вас на просторах интернета. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143

Портал отображает информацию о закупках, публикуемых в сети интернет
и находящихся в открытом доступе, и предназначен для юрлиц и индивидуальных предпринимателей,
являющихся участниками размещения государственного и коммерческого заказа. Сайт использует Cookie, которые нужны для авторизации пользователя.
На сайте стоят счетчики Яндекс.Метрика, Google Analytics и LiveInternet,
которые нужны для статистики посещения ресурса.

Биологические и иммунологические свойства

Тест-система обладает способностью выявлять антигены коксиелл Бернета (Ку-антиген) за счет их связывания с поликлональными антителами, сорбированными на поверхности лунок стрипов. Образующийся комплекс антитело-антиген выявляется с помощью пероксидазного коньюгата на основе поликлональных антител по появлению желтого окрашивания на этапе ферментативного превращения субстратного раствора.

Несмотря на то, что входящие в тест-систему контрольные образцы (К+ и К-) инактивированы, с системой следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом:

• работать в резиновых перчатках;
• не пипетировать ртом;
• все использованные материалы подвергать обработке дезинфицирующими растворами (6 % раствором перекиси водорода или монохлорамина);
• использованные наконечники обрабатывать 20 % раствором этилового спирта.

Назначение

Тест-система предназначена для выявления Ку-антигена в объектах внешней среды, (смывы) и материалах биологического происхождения (органы животных, клещи).

1. 8-луночные стрипы, сорбированные антителами к Ку-антигену - 12 шт.
2. Позитивный контрольный образец, содержащий антиген коксиелл Бернета, (К+), (красный раствор), 1,2 мл - 1 пр.
3. Негативный контрольный образец, содержащий гетерологический антиген, (К-), (зеленый раствор), 1,2 мл - 1 пр.
4. Конъюгат — поликлональные антитела к коксиеллам Бернета, меченные пероксидазой хрена, (Концентрат конъюгата), (синий раствор), 0,2 мл - 1 пр.
5. Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора, содержащий детергент — твин-80, (ФСРТ), (бесцветный раствор), 20,0 мл - 1 фл.
6. Цитратный буферный раствор с перекисью водорода, (ЦБП), (бесцветный раствор), 10,0 мл - 1 фл.
7. Раствор для разведения конъюгата, (РРК), (бесцветный раствор), 10,0 мл - 1 фл.
8. Раствор тетраметилбензидина, (ТМБ), (бесцветный или слегка голубоватый раствор), 2,5 мл - 1 фл.
9. Раствор серной кислоты, (Стоп реагент), (бесцветный раствор), 5,0 мл - 1 фл.
10. Полиэтиленовый пакет с молнией - 1 шт.
11. Инструкция по применению - 1 шт.

1. Все растворы и реагенты необходимо выдержать перед началом работы при температуре (18 — 25) o С в течение 30 мин. Иммуноферментный анализ (ИФА) рекомендуется проводить с использованием новых, не подвергавшихся обработке наконечников для пипеток.
2. Растворы каждого компонента тест-системы и каждого исследуемого образца необходимо брать с помощью индивидуального наконечника для пипеток.
3. В зависимости от числа исследуемых проб отбирают необходимое количество стрипов. Остальные стрипы вынимают из рамки-держателя и хранят в закрытом полиэтиленовом пакете с молнией при температуре (4 — 6) °С.
4. Материал для исследования. а) Внутренние органы животных, клещей растирают в стерильной фарфоровой ступке и готовят 25 % суспензию в 0,9 % растворе хлорида натрия. Полученную суспензию подвергают трехкратной процедуре замораживания-оттаивания, инактивируют в водяной бане при температуре 100 °С в течение 20 мин. и центрифугируют при 1000 об./мин. в течение 15 мин. Дальнейшее исследование проводят с супернатантом. б) Смывы берут ватным тампоном, смоченным 0,9 % раствором хлорида натрия, с поверхности не менее 200 –– 300 см 2 . Тампон помещают в пробирку, содержащую 2 –– 5 мл 0,9 % раствора хлорида натрия. Перед исследованием тампон тщательно отжимают, содержимое пробирки инактивируют на водяной бане при температуре 100 °С в течение 20 мин.
5. Раствор ФСРТ. Для получения рабочего раствора содержимое флакона с концентратом ФСРТ доводят до 500 мл дистиллированной водой. Раствор хранят до 4 мес. при температуре (4 — 6) o С.
6. Раствор конъюгата. Концентрат конъюгата разводят на растворе РРК 1 : 80. Необходимый объем раствора конъюгата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранят до 4 ч при температуре (4 — 6) o С.
7. Субстратный раствор. Готовят перед проведением ферментативной реакции. Необходимый объем раствора субстрата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранению не подлежит.

Пример № 1. Таблица расхода компонентов тест-системы.

Количество одновременно используемых стрипов	Коньюгат (мкл)	Разводящий буфер для коньюгата (РРК) (мл)	ТМБ (мл)	ЦБП (мл)
1	15	1,2	0,2	0,8
2	30	2,4	0,4	1,6
3	40	3,2	0,6	2,4
4	50	4,0	0,8	3,2
5	60	4,8	1,0	4,0
6	70	5,6	1,2	4,8
7	80	6,4	1,4	5,6
8	90	7,2	1,6	6,4
9	100	8,0	1,8	7,2
10	110	8,8	2,0	8,0
11	120	9,6	2,2	8,8
12	130	10,4	2,4	9,6

При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и К- должно оставаться БЕСЦВЕТНЫМ или БЛЕДНО-ЖЕЛТЫМ, а содержимое лунок с К+ должно приобрести ЖЕЛТУЮ окраску.

Исследуемый образец оценивается как положительный, если имеются отчетливые различия в интенсивности его окрашивания по сравнению с растворами в лунках с контролем субстрата и К-.

Измерение оптической плотности (ОП) проводится при длине волны 450 нм непосредственно в лунках планшета с помощью вертикального фотометра. В качестве кюветы сравнения служит лунка А1 с контролем субстрата. При правильном проведении анализа среднее значение в лунках с К+ должно быть не менее (0,60 ± 0,10) единиц ОП, а в лунках с К- – не должно превышать (0,15 ± 0,05) единиц ОП.

Оценка результатов производится следующим образом: если отношение (А) среднего значения ОП (ОП_сред) исследуемого образца к ОП_сред К- больше или равно 3 (А ≥ 3), то этот результат следует оценивать как положительный, если отношение ОП_сред исследуемого образца к ОП_сред К- меньше 3 (А o С. Транспортировку осуществлять всеми видами крытого транспорта при температуре не выше 25 о С не более 2 недель.

Срок годности тест-системы — 6 мес. со дня выпуска.

При нарушении условий хранения, транспортировки и схемы постановки ИФА рекламации не принимаются.

Иммуноферментный анализ (ИФА) — метод лабораторной диагностики, позволяющий обнаруживать специфические антитела и антигены при самых разных патологиях.

ИФА — один из самых распространенных и точных методов для выявления инфекций, передающихся половым путем, в частности ВИЧ, ВПЧ, гепатита В.

Для того чтобы результаты анализов были максимально достоверными, необходимо правильно подготовиться к их сдаче.

Спецпредложения, скидки и акции помогут существенно сэкономить на медицинском обследовании.

Контроль качества лабораторных исследований, осуществляемый по международным стандартам, — дополнительная гарантия точности результатов анализов.

Современная диагностика в медицине немыслима без высокочувствительных лабораторных анализов. Прежде для установления причин тех или иных симптомов врачи были вынуждены ориентироваться на косвенные признаки болезни, а также проводить многоступенчатые микроскопические исследования в попытке обнаружить возбудителя инфекции. Сегодня достаточно одного-единственного теста — такого как иммуноферментный анализ — чтобы подтвердить или опровергнуть первоначальный диагноз.

Основные понятия и принцип метода иммуноферментного анализа

Существует несколько разновидностей антител, каждая из которых вступает в действие на определенном этапе иммунного ответа. Так, первыми в ответ на проникновение антигена в организм синтезируются иммуноглобулины класса М (IgM). Содержание этих антител наиболее высоко в первые дни инфекционного процесса.

Следом за ними иммунная система выбрасывает в кровь иммуноглобулины класса G (IgG), которые помогают уничтожать антигены до полной победы над инфекцией, а также продолжают циркулировать по сосудам в дальнейшем, обеспечивая иммунитет к повторному заражению. На этом явлении основана вакцинация: благодаря прививкам, содержащим ослабленные антигены микробов и вирусов, в нашей крови появляется большое количество IgG, которые при контакте с реальной угрозой быстро подавляют инфекцию — до того, как она нанесет вред здоровью.

Как узнать, какие именно антигены или антитела присутствуют в организме человека? Когда врач предполагает, что причиной заболевания является определенная инфекция, или желает измерить концентрацию определенного гормона, он назначает пациенту иммуноферментный анализ.

ИФА бывает качественным и количественным. В первом случае подразумевается однозначный ответ: искомое вещество или найдено, или не найдено в образце. В случае с количественным анализом более сложная цепь реакций дает возможность оценить концентрацию антител в крови человека, что в сравнении с результатами предыдущих тестов даст ответ на вопрос о том, как развивается инфекционный процесс.

Бесспорные преимущества ИФА — высокая чувствительность и специфичность метода. Чувствительность — это возможность распознать искомое вещество, даже если его концентрация в образце невысока. Специфичность же подразумевает безошибочность диагностики: если результат положительный, значит, найдены именно те антитело или антиген, которые предполагались, а не какие-то другие.

Высокая степень технологичности проведения иммуноферментного анализа минимизирует влияние человеческого фактора, что снижает вероятность ошибки. Большинство используемых в современных лабораториях тест-систем и реактивов для ИФА выпускаются в промышленных условиях, что гарантирует точный результат.

В случае диагностики инфекционных заболеваний иммуноферментный анализ не может найти возбудителя и определить его специфичные свойства: он лишь указывает на наличие антител в крови у больного, косвенно свидетельствующих о присутствии чужеродного микроорганизма в теле человека.

ИФА — крайне точный, но не дешевый метод, поэтому обращаться к нему нужно с умом, а интерпретацией результатов должен заниматься квалифицированный врач.

Невозможно охватить полный список показаний к проведению ИФА. Вот наиболее распространенные цели анализа:

1. Диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний:
   • IgM и IgG к вирусным гепатитам А, B, C, E, а также антигенов гепатитов В и С;
   • IgG к ВИЧ;
   • Ig M и IgG к цитомегаловирусной инфекции;
   • Ig M и IgG к вирусу Эпштейна-Барр;
   • Ig M и IgG к герпетическим инфекциям;
   • Ig M и IgG к токсоплазмозу;
   • Ig M и IgG к кори, краснухе, сальмонеллезу, дизентерии, клещевому энцефалиту и другим заболеваниям;
   • IgG к паразитарным заболеваниям;
   • Ig M и IgG к инфекциям, передающимся половым путем;
   • IgG к хеликобактерной инфекции.
2. Общая оценка показателей иммунитета человека и маркёров некоторых аутоиммунных заболеваний.
3. Выявление онкологических маркёров (фактора некроза опухоли, простатспецифического антигена, раково-эмбрионального антигена и других).
4. Определение содержания гормонов в сыворотке крови (прогестерона, пролактина, тестостерона, тиреотропного гормона и других).

Основной биоматериал для проведения ИФА — это сыворотка крови: в лаборатории у пациента берут образец крови из вены, из которого в дальнейшем удаляют форменные элементы, затрудняющие проведение анализа. В некоторых других случаях для анализа используется спинномозговая жидкость, околоплодные воды, мазки слизистых оболочек и т.д.

Для того чтобы избежать искажений в результатах, рекомендуется сдавать кровь натощак, а за две недели до исследования (если целью является диагностика хронических, скрыто протекающих инфекционных заболеваний) необходимо отказаться от приема антибиотиков и противовирусных препаратов.

При наличии необходимых реактивов и хорошей организации работы лаборатории результат анализа вы получите в течение 1–2 суток после забора крови. В некоторых случаях, при необходимости получения экстренного ответа, этот срок может быть сокращен до 2–3 часов.

• IgM — наличие этого класса иммуноглобулинов говорит об остром инфекционном процессе в организме. Отсутствие IgM может говорить как об отсутствии конкретного возбудителя в организме, так и о переходе инфекции в хроническую стадию.
• IgA при отрицательном результате теста на IgM чаще всего свидетельствует о хронической или скрыто протекающей инфекции.
• IgM и IgA (совместное присутствие) — два положительных результата говорят о разгаре острой фазы заболевания.
• IgG говорит либо о хронизации заболевания либо о выздоровлении и выработке иммунитета к инфекционному агенту.

В зависимости от содержания анализа в бланке могут быть представлены данные в виде таблицы с перечислением всех антител или антигенов с пометками об отрицательной или положительной реакции, либо будет указано количественное значение результата (отрицательный, слабоположительный, положительный или резко положительный). Последний вариант определяет, сколько антител содержится в анализируемом образце.

Еще один количественный показатель — индекс авидности антител, выраженный в процентах. Он указывает, сколько времени прошло от начала инфекционного процесса (чем выше индекс — тем больше).

Сегодня выпускаются тысячи видов тест-систем ИФА, позволяющих обнаруживать специфические антитела и антигены при самых разных патологиях. Поэтому этот анализ используется практически во всех медицинских отраслях. Диагноз, поставленный с помощью ИФА, — это гарантия назначения адекватной терапии и эффективного лечения заболевания.

Информативность ИФА делает этот анализ важным инструментом в работе многих медицинских центров. Но можно ли доверять такую диагностику государственным лабораториям или лучше самим выбрать, где провести такое исследование?

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) -- вирусный нетрансмиссивный зооноз, широко распространенный в Евразии, а в России занимающий одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека. Случаи заболевания ГЛПС регистрируются в 58 из 83 административных регионов Российской Федерации и составляют ежегодно 8--10 тыс. больных в целом по стране.

Отсутствие тенденции к снижению заболеваемости ГЛПС, расширение ареала инфекции, участившиеся случаи вспышек ГЛПС, ассоциированных с новыми, ранее не известными в России хантавирусами, свидетельствует о возрастающей медицинской и социальной значимости проблемы ГЛПС.

Открытию возбудителя ГЛПС предшествовал более чем 40-летний период поисков, успешно завершившийся в конце 70-х гг., когда впервые вирус-возбудитель ГЛПС был выделен в Южной Корее от полевой мыши Apodemus agrarius coreae [1].

Несколько лет после открытия возбудителя ГЛПС единственным лабораторным методом для выявления антигена вируса-возбудителя ГЛПС и антител к нему оставался непрямой метод флюоресцирующих антител (МФА) с использованием препаратов криостатных срезов легочной ткани полевых мышей. Ограниченные возможности этого метода, а также трудности, связанные с использованием криостатных срезов легочной ткани диких грызунов (отлов диких животных, транспортировка и хранение легочных тканей, нестандартность антигенной активности препаратов, спонтанная инфицированность грызунов реовирусами, низкая производительность и др.), существенно тормозили изучение ГЛПС, а также применение специфической диагностики этой инфекции в широкой практике. Это в основном и явилось основанием для разработки и усовершенствования методов лабораторной диагностики ГЛПС, чему посвящена настоящая работа.
В процессе исследований было разработано и усовершенствовано применительно к хантавирусам 23 метода, включая иммунологические, вирусологические и молекулярно-генетические.

• обнаружение и титрование вируса по индикации вирусспецифического антигена в клетках VERO-Е6 с использованием непрямого МФА;
• обнаружение и титрование вируса с использованием феномена фокусобразующих единиц (ФОЕ) [10, 11];
• реакция нейтрализации [10, 11].

Реакция нейтрализации с использованием феномена подавления числа ФОЕ применялась в собственной модификации, предусматривающей добавление комплемента при экспозиции вирус-сывороточной смеси, что стандартизует результаты нейтрализующей активности антител в сыворотках крови с различным сроком хранения. По нашим данным, такая модификация позволяет наиболее достоверно выявлять антигенные взаимоотношения между хантавирусами и, соответственно, обеспечивать надежную информацию к таксономической классификации хантавирусов.

Молекулярно-генетические методы:

• выделение хантавирусной РНК с использованием гнездовой ПЦР с обратной транскрипцией;
• амплификация и секвенирование нуклеотидных последовательностей РНК-сегментов хантавирусного генома [13--15].

При сравнении эффективности применения разработанных нами иммунологических методов принимали во внимание не только их высокую чувствительность и специфичность, но и доступность для широкого применения в условиях практического здравоохранения. Кроме того, учитывали перспективность технологии промышленного изготовления диагностических препаратов. Так, в соответствии с этими критериями оценки эффективности было показано, что по сравнению с ранее применявшимся непрямым МФА (препараты криостатных срезов) возможность широкого практического применения иммуносорбентных методов ИФА и РИА для выявления вирусспецифического антигена у мелких млекопитающих в природных очагах ГЛПС имеет очевидные преимущества, обусловленные высокой производительностью при обследовании большого количества образцов суспензий органов, не нуждающихся в дополнительной очистке от грубых примесей, простотой и объективностью учета результатов опыта. Кроме того, в отличие от непрямого МФА иммуносорбентные методы и РНГА, обладая практически одинаковой чувствительностью и специфичностью, позволяют определять количественное содержание антигена в исследуемых материалах. Вместе с тем следует отметить, что при сравнении возможностей использования ИФА, РИА и РНГА для выявления хантавирусного антигена предпочтение отдано ИФА, поскольку применение РИА требует наличия дорогостоящего оборудования и высокого качества радиоактивных препаратов, а также специальной подготовки персонала, что ограничивает возможности использования этого метода в учреждениях практической сети здравоохранения. Что касается РНГА и РТНГА, то эффективность их широкого практического применения ниже по сравнению с ИФА и РИА, что связано главным образом с необходимостью предварительной обработки исследуемых материалов эритроцитами барана для удаления гетероагглютининов. При оценке эффективности применения двух вариантов непрямого МФА для выявления специфических хантавирусных антител в сыворотках крови больных и переболевших ГЛПС людей из разных регионов России было показано, что частота выявления серопозитивных лиц и среднегеометрические титры антител, выявляемых непрямым МФА с культуральным антигеном хантавируса (92%, титр Σ 8,3 log2), была значительно выше по сравнению с тем же методом, но с применением в качестве антигена препаратов криостатных срезов легочной ткани животных (72%, титр Σ 4,5 log2) [16].

Биотехнологические основы конструирования диагностикумов ГЛПС

Диагностикум геморрагической лихорадки с почечным синдромом культуральный, поливалентный для непрямого метода иммунофлюоресценции.

До разработки технологии изготовления культурального поливалентного диагностикума в том виде, в котором этот препарат был передан для промышленного освоения, пройден длительный и важный этап его конструирования. Этот этап был связан с усовершенствованием и оптимизацией процессов изготовления диагностического препарата, обусловленных как использованием в технологии новых данных, касающихся особенностей гуморального иммунитета при ГЛПС, антигенной вариабельности хантавирусов и их репродукции в культуре клеток, так и чисто практическими проблемами, возникавшими при широком применении диагностикума.

Первоначально культуральный диагностикум готовили на основе прототипного штамма Hantaan 76-118, полученного из Южной Кореи. Однако применение такого диагностикума в европейских очагах ГЛПС оказалось малоэффективным, особенно в ранние сроки болезни, поскольку циркулирующий в этих очагах вирус-возбудитель ГЛПС имеет, как выяснилось позже, антигенные различия с прототипным штаммом. В связи с этим для приготовления культуральных антигенов стали использовать выделенные нами в европейском и дальневосточном регионах России штаммы, относящиеся к хантавирусам Puumala и Hantaan. Вначале готовили и применяли моновалентные антигены (отдельно для каждого хантавируса), а затем комбинированный двухвалентный препарат, с тем чтобы при серологическом исследовании сывороток крови больных ГЛПС не пропустить гетерологичный для данного региона хантавирусный серотип. Диагностикум включал антигенные препараты, изготовленные по авторской технологии из 2 штаммов, представлявших штаммы хантавирусов Puumala и Hantaan, положительные и отрицательные контрольные сыворотки и ФИТЦ-конъюгат IgG против иммуноглобулинов человека. Поскольку антитела, вырабатываемые в ответ на заражение человека вирусами-возбудителями ГЛПС, относящимися к хантавирусам Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, при исследовании непрямым МФА перекрестно реагируют с минимальной разницей в титре, включение в состав диагностикума одного из этих вирусов для выявления антител ко всем остальным представлялось оправданным. Однако впоследствии было показано, что в остром периоде болезни титры антител в сыворотках крови больных ГЛПС, ассоциированной с хантавирусами Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, в 2--4 раза выше c гомологичным антигеном (в поздних сыворотках эта разница нивелируется). В этой связи для повышения чувствительности препарата при определении антител в ранние сроки болезни диагностикум ГЛПС был усовершенствован: в состав комбинированного двухвалентного антигена были дополнительно включены культуральные антигены, приготовленные на основе штаммов хантавирусов Seoul и Dobrava/Belgrad (рис. 1).

При разработке экспериментальных серий препарата были проведены научные исследования по изучению оптимальных условий размножения хантавирусных штаммов в культуре клаток VERO-Е6 и накопления вирусспецифического антигена; оптимальных условий приготовления антигенных препаратов; параметров полной инактивации инфекционной активности хантавирусов; оптимальных условий постановки непрямого МФА для выявления вирусспецифических флюоресцирующих антигенов хантавирусов и др.

Успешная апробация культурального диагностикума ГЛПС в широкой практике (серологически обследовано более 20 тыс. больных с подозрением на ГЛПС на 17 административных территориях России) и определение реальных потребностей в препарате практического здравоохранения явились обоснованием к технологической разработке промышленного производства этого диагностикума. Была разработана и утверждена соответствующая нормативно-техническая документация по изготовлению, контролю и применению культурального поливалентного диагностикума ГЛПС, проведены комиссионные испытания диагностикума в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также утверждена фармакопейная статья на диагностический препарат.

В настоящее время диагностикум ГЛПС выпускается в виде набора реагентов, содержащего культуральный антигенный препарат и контрольные сыворотки. Антигенный препарат является основным действующим компонентом комплекта. Он представляют собой равномерно нанесенные на предметное стекло по 0,005 мл высушенные, инактивированные ультрафиолетовым облучением и фиксированные ацетоном суспензии клеток VERO-E6, содержащие специфические антигены, приготовленные на основе штаммов хантавирусов Puumala, Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, и клетки, не содержащие хантавирусных антигенов в соотношении 2:1:1:1:1. Визуально на стекле антиген определяется в виде серых пятен диаметром 2--З мм (по 12 или 21 капле на каждом стекле). Помимо антигенных препаратов, набор содержит контрольные иммунные сыворотки: анти-Hantaan, выявляющую антигены хантавирусов Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad; анти-Puumala, выявляющую антигены хантавируса Puumala; нормальную сыворотку человека, а также ФИТЦ-конъюгат против глобулинов человека.

Несомненным достоинством диагностикума ГЛПС является то, что в антигенном поливалентном препарате имеется весь набор присущих хантавирусу антигенных детерминант, представленных в цитоплазме клеток в составе зрелых вирионов, а также компонентов сборки вирусных частиц: белка нуклеокапсида, гликозилированного белка наружной оболочки и его предшественников, вирусной РНК. Именно поэтому непрямой МФА остается стандартом при сравнении специфичности и чувствительности вновь создаваемых диагностических препаратов для серодиагностики ГЛПС.

Следует отметить, что культуральный диагностикум применяется и для исследования сывороток крови животных на присутствие хантавирусных антител. Для этого необходимо использовать ФИТЦ-конъюгат против глобулинов того вида животных, которому принадлежит исследуемая сыворотка.

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом занимает ведущее место по заболеваемости среди природно-очаговых инфекций в России. Заболевание протекает как острая инфекция с поражением почек, легких, центральной нервной и гормональной систем, наличием в ряде случаев тяжелых осложнений в остром периоде, приводящих к летальным исходам, и характеризуется длительным сроком восстановления до полного выздоровления. В этой связи проблема ГЛПС представляет серьезную медико-социальную проблему.

Открытие вируса -- одного из возбудителей этого заболевания в 1978 г. (Lee H.W. et al., 1978) стало этапным в изучении этой инфекции, а название вируса -- Хантаан стало родовым для многочисленных впоследствии открытых вирусов, как патогенных, так и не патогенных для человека.

Начало наших исследований по этой проблеме совпало с началом становления хантавирусологии. В первую очередь остро стоял вопрос методической составляющей исследований, поскольку в арсенале экспериментаторов поначалу имелся только метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием криостатных срезов легких инфицированных грызунов -- природных носителей вируса. Отсутствовала специфическая диагностика заболевания, соответственно, вопросы этиологии, ареала и нозоареала инфекции, о ее носителях в природе требовали своего решения.

В начале наших исследований наиболее важным был вопрос обеспечения исследований ГЛПС высокоэффективными и стандартными диагностическими препаратами. Это препараты для специфической лабораторной диагностики ГЛПС у больных людей, с одной стороны, и, с другой, для выявления возбудителей этой инфекции во внешней среде, поскольку источником заражения людей служат дикие грызуны.

В связи с этим были определены основные параметры конструирования иммуноглобулиновых диагностических препаратов, что позволило разработать технологическую схему их промышленного производства. Были разработаны и утверждены нормативно-технические документы по изготовлению, контролю и применению иммуноглобулиновой пероксидазной тест-системы для ИФА и культурального поливалентного диагностикума ГЛПС для непрямого МФА.

Экспериментальная разработка лабораторных методов применительно к хантавирусам и промышленное производство диагностических препаратов ГЛПС в значительной мере способствовало успеху, достигнутому в нашей стране и за рубежом в изучении ГЛПС, а также решению ряда задач практического здравоохранения, связанных с этой инфекцией.

Широкое применение разработанных нами методов специфической диагностики применительно к хантавирусам для обследования людей и мелких млекопитающих позволило значительно расширить наше представление о географическом распространении возбудителей ГЛПС и их носителей в природе. Отмечена тесная корреляция при обнаружении инфицированных хантавирусом мелких млекопитающих и серопозитивных к этому вирусу лиц среди населения административных территорий, где проводились параллельные исследования мелких млекопитающих и людей. В последние годы, благодаря серологическому обследованию людей с заболеваниями, сходными по некоторым симптомам с ГЛПС, в ряде районов России, в которых ранее не регистрировалась заболеваемость ГЛПС, были выявлены больные этой инфекцией.

1. Впервые, применительно к хантавирусам, разработан комплекс лабораторных методов исследования материалов от больных ГЛПС и мелких млекопитающих, позволивших существенно повысить эффективность специфической диагностики ГЛПС и получить новые данные, имеющие приоритетное значение в изучении хантавирусных лихорадок в нашей стране и за рубежом.

2. Результаты сравнительной оценки эффективности клинической и специфической лабораторной диагностики ГЛПС позволили установить истинные размеры заболеваемости, расширить представление о диапазоне клинических проявлений инфекции.

3. Получены экспериментальные данные, которые составили основу технологии изготовления иммунобиологических препаратов, предназначенных для специфической лабораторной диагностики ГЛПС.